Hoe maak je gRNA voor CRISPR genoombewerking?
de gRNA leidt het CRIPR Cas9-systeem naar de juiste genomische locatie voor het uitvoeren van een dubbelstrengbreuk.De targeringspecificiteit van het CRISPR Cas9-systeem wordt bepaald door de 20 nucleotiden aan het 5′ – eind van gRNA. De Grna-basenparen aan de complementaire bundel van de doelopeenvolging en Cas9 nuclease voeren een dubbele bundelonderbreking uit.
bij het ontwerpen van een gRNA moet rekening worden gehouden met de volgende dingen.
1) GC-gehalte: Typisch bereik is tussen 40% – 80%. Een hoger GC-gehalte stabiliseert de RNA-DNA-duplex en destabiliseert off-target hybridisatie
2) Lengte: De lengte kan worden aangepast en variëren van 17-24 basenparen. Een kortere opeenvolging leidt tot geminimaliseerde off doeleffecten. (17 bp is de laagste limiet op de lengte van de geleidende opeenvolging, om het even welke lengte van de geleidende opeenvolging om het even welke lengte korter dan 17 heeft een statistische kans om veelvoudige genomic loci te richten.)
3) potentiële off-target effecten: Mismatch tolerantie en de target site is wat leidt tot off-target effecten. Dit kan door genoom-wideoff doel effect zoekopdrachten worden verminderd.
er zijn veel websites die helpen bij het ontwerpen van gRNAs. Sommige van hen zijn Chop Chop (Harvard), Broad Institute sgrna designer, en Biotools.
ik leg hier uit hoe Chop Chop website te gebruiken,
1) Ga naar https://chopchop.cbu.uib.no/
2) Kies Species
3) Kies species specific gen id of knip en plak het nucleotide van belang, en start de analyse.
zodra de analyse is uitgevoerd, zal een grafische weergave van locatiespecifieke gRNA worden getoond. Elke potentiële gRNA zal ook de mogelijke off target effecten tonen. Selecteer degenen met minder off target effecten.
