Injecteerbare menselijk recombinant collageen matrices beperken nadelige verbouwen en verbeteren van de hartfunctie na een myocardinfarct

onderzoeksopzet

Hier, wij hebben een onderzoek uitgevoerd naar (i) het ontwerp klinisch relevante collageen hydrogels met behulp van recombinant humaan collageen type I en type III; (ii) karakteriseren en te vergelijken met de fysische eigenschappen van de rHCI en rHCIII materialen; (iii) evalueer het therapeutisch potentieel van de materialen voor de behandeling van MI bij muizen; en (iv) identificeer mechanismen die ten grondslag liggen aan de waargenomen therapeutische effecten van rHC-behandeling. Voor in vivo experimenten werd lad artery ligation bij muizen gekozen als een klinisch relevant en bewezen diermodel van MI. Voor functionele, histologische en moleculaire evaluaties werd het aantal dieren per groep geminimaliseerd tot drie tot vijftien muizen, zoals aangegeven in de figuur legendes. Muizen werden willekeurig toegewezen aan behandelingsgroepen en alle analyses werden geblindeerd uitgevoerd.

Bereiding en karakterisering van de matrices

1% collageen oplossing werd bereid door het oplossen van 0,1 g gevriesdroogd collageen (rHCI en rHCIII, van Fibrogen) op in 10 ml ultra-pure ddH2O. Chondroïtine sulfaat (CS; Wako), N-ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) en N-hydroxysuccinimide (NHS) werden toegevoegd om een uiteindelijke mengsel met een massa verhouding van 1:4:0.5:0.3 voor collageen:CS:NHS:EDC. De materialen werden bereid op ijs met behulp van een gesloten systeem dat homogeen mengen mogelijk maakt zonder toevoeging van bellen. Na grondige menging werd de pH ingesteld op 7.4 Door NaOH (1,0 N). Matrices zonder CS werden op dezelfde manier bereid, maar met PBS toegevoegd om het volume van CS te compenseren. Matrices gelabeld met Alexa-Fluor ® 594-NHS werden bereid door 20 µL van de kleurstofstockoplossing (1 mg/mL in DMSO) toe te voegen aan de gels alvorens de NaOH (25 nmol kleurstof per hydrogel) toe te voegen, gevolgd door 20 mengstappen.

viscositeit

Viscositeitsmetingen werden uitgevoerd met behulp van een Brookfield R/S plus rheometer (Brookfield) bij 37 °C. Een C25–2/30 conische spindel werd gebruikt om het materiaal (50 µm verplaatsing) samen te persen op een temperatuur gecontroleerde sokkel. De viscositeit werd gemeten met een rotatieblok op de helling met een snelheid van 1/min eenheden, vooraf ingesteld met een schuifsnelheid van vijf eenheden over een periode van 30 minuten.

mate van cross-linking

differentiële scanning calorimetrie (DSC) experimenten werden uitgevoerd om de mate van cross-linking te beoordelen. Kort, metingen werden uitgevoerd in een q2000 differentiële scanning calorimeter (TA instrumenten) in het bereik van 8 tot 80 °C met behulp van een scansnelheid van 5 °C min−1. Collageenmatrices (5-20 mg) werden aan het oppervlak gedroogd met filtreerpapier en hermetisch afgesloten met een aluminium deksel (Tzero).; TA instrumenten) in een aluminium Monster pan (tZero; TA instrumenten). De denaturatietemperatuur (Td) werd gemeten bij het begin van de endotherme piek.

watergehalte

watergehalte van de materialen werd gemeten door het natte gewicht (W0) van het monster te wegen, in PBS gedurende 96 uur bij 4 °C. Het materiaal werd vervolgens gedurende 96 uur vacuüm gedroogd bij kamertemperatuur om het drooggewicht (W) te verkrijgen. Het totale watergehalte van de hydrogels (Wt) werd vervolgens berekend volgens de vergelijking:

Degradatie

Enzymatische afbraak werd gemeten met behulp van 50-100 mg hydrogel geplaatst in 5 ml type I collagenase (10 U/ml in PBS) bij 37 °C. De resterende vaste massa werd gemeten over een periode van maximaal 24 uur. De afbraaksnelheid wordt berekend op basis van de initiële helling van de percelen van de resterende massa vs. tijd en gerapporteerd als mg/min.

Materiaalporositeit

lage-temperatuur scanning elektronenmicroscopie (Cryo – SEM) metingen werden uitgevoerd bij -50 °C met behulp van een Tescan (Model: Vega II-XMU) uitgerust met een koude-fase monsterhouder, een backscatter elektronendetector (BSE) en een secundaire elektronendetector (SE). Met behulp van ImageJ® – software werden poriegroottes gemeten van ten minste 250 afzonderlijke delen van 4 tot 6 willekeurige delen van het monster. De Diameter van de poriën werd gekwantificeerd met behulp van de lengteas van de poriën met behulp van de rechte lijn. De oppervlakte van het beeld werd aangepast aan de maatschaalbalk van het Tescan Vega II system65.

dierproeven

alle procedures werden goedgekeurd door het Animal Care Committee van de Universiteit van Ottawa en uitgevoerd volgens de National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

MI model

MI werd geïnduceerd bij 9 weken oude vrouwelijke c57bl / 6 muizen (Charles River; aantal muizen/groep zijn in de figuur legends) en de behandeling werd uitgevoerd met behulp van een vastgesteld protocol26,27. Muizen werden verdoofd( 2% isofluraan), geïntubeerd en het hart werd blootgesteld via de vierde intercostale thoracotomie. De left anterior descending coronary artery (LAD) werd dan ligated net onder de opkomst van het linker atrium. Deze procedure resulteert in een grote MI met betrekking tot de anterolaterale, posterior, en apicale delen van het hart, die werd bevestigd op het moment van de operatie door myocardiale blancheren in het gebied dat door de slagader wordt geleverd. Kortwerkende buprenorfine werd ten minste een uur voor de operatie toegediend en langwerkende buprenorfine werd vlak voor de operatie subcutaan toegediend voor perioperatieve analgesie. 1 week na het MI (baseline) werden muizen willekeurig toegewezen aan de behandeling van PBS-(controle), rHCI-of rHCIII-matrices, toegediend in vijf equivolumetrische intramyocardiale injecties (10 µl per plaats, 50 µl in totaal) via een 27-G naald met behulp van een ultrageleide gesloten borstprocedure. De spuit wordt vastgezet in een micromanipulator (VisualSonics) en voorafgaand aan de injectieprocedure worden zowel de naald als de RMV scanhead-sonde op één lijn gebracht langs de hartlengteas. Via het ultrasone gezichtsveld wordt de micromanipulator gebruikt om de punt van de naald op de gewenste plaats binnen het myocardium te plaatsen voor het toedienen van de injecties (zie aanvullende Fig. 1 en aanvullende Video 1). Muizen werden gedood door terminale anesthesie op 2 dagen of 4 weken na de behandeling en harten werden verzameld voor histologie en / of metingen van de mechanische eigenschappen.

echocardiografie

transthoracale echocardiografie werd uitgevoerd op long-axis views met behulp van een Vevo770 systeem in B modus met een 707b serie real-time microvisualisatie scanhead probe (VisualSonics). De beeldvorming werd uitgevoerd bij baseline vóór de injectie van de behandeling (7 dagen na MI) en 28 dagen na injectie om de linkerventrikelejectiefractie (LVEF), fractional area change (FAC), end-systolic volume (ESV), end-diastolic volume (EDV), stroke volume en cardiale output te bepalen. Merk op dat LVEF, ESV en EDV worden gebruikt als klinische voorspellers van HF en overleving na MI44.

Ex vivo beeldvorming van Alexa-Fluor ® 594-gelabelde matrix

de chemisch geëtiketteerde rHC-matrices (25 nmol kleurstof per hydrogel) werden geïnjecteerd in het hartinfarct van de muis, zoals hierboven beschreven. Dieren werden gedood op 2 uur, 2 dagen en 7 dagen na de behandeling, en harten werden geoogst en ex vivo afgebeeld door IVIS® Spectrum (PerkinElmer) om de rHCI-en rHCIII-verdeling in de harten te visualiseren (λexcitation: 570 nm; λemission: 640 nm). Voor histologie werden weefselsecties bereid in aceton en vervolgens gekleurd met DAPI, gevolgd door beeldvorming met behulp van een Leica Aperio Versa slide scanner met een uiteindelijke vergroting van ×20 en een z-stack met acht stappen bij 1,5 µm.

Stamanalyse

transthoracale echocardiografie werd uitgevoerd op long-axis views met behulp van een Vevo3100 systeem in B modus met een mx400 serie real-time microvisualisatie scanhead probe (VisualSonics). De beeldvorming werd uitgevoerd bij baseline vóór de injectie van de behandeling (7 dagen na MI) en 2 dagen na injectie om de longitudinale endocardiale stam te bepalen op het moment van sluiting van de aortaklep (wat het einde van de systole voorstelt). De stam in Segment 5 (het voorste middensegment), overeenkomend met het gebied van de grenszone waarvoor de injectie werd toegediend, werd geanalyseerd met behulp van de Vevostrain-toepassing van de Vevo LAB 3.1.1-software (VisualSonics)41. Representatieve voorbeelden van de uitgevoerde metingen zijn opgenomen in de aanvullende Fig. 10 voor alle experimentele groepen plus een gezond (niet-infarcted) dier.Elektrocardiografie

elektrocardiografie

elektrocardiogrammen werden gelijktijdig met echocardiografie verkregen met behulp van een Vevo3100-systeem (VisualSonics) bij aanvang vóór de injectie van de behandeling (7 dagen na MI) en 2 dagen na injectie. Elektrocardiogrammen werden geëxporteerd vanuit Vevo LAB 3.1.1. software (VisualSonics). De lengte van de PR -, QT-en QRS-intervallen werd bepaald met behulp van ImageJ-software (aanvullende tabel 1).

mechanische eigenschappen van het myocardium

muizen werden 2 of 28 dagen na de behandeling geëuthanaseerd door terminale anesthesie en de harten werden geoogst. Rechthoekige delen (2,5 × 5 mm) van het linker ventrikel, bestaande uit het litteken en de grenszone, werden verwijderd. Om de trekelasticiteit van het weefsel (Young ‘ s modulus) te bepalen, werden de monsters mechanisch getest in een Instron mechanische universele tester (model 3342, Instron) uitgerust met serie IX/S software, met een kruissnelheid van 10 mm min−1.

histologie / immunohistochemie

dia ‘ s van myocardiale weefselsecties werden bereid uit een subgroep van harten die niet werden gebruikt voor mechanische eigenschappen metingen. 28 dagen na de injectie werden de harten geoogst, geperforeerd met PBS, ingebed in OCT en bevroren in vloeibare stikstof. Secties van 10 µm werden gesneden met behulp van een cryostaat. Om littekengrootte te bepalen, werden weefselsecties gefixeerd in 4% PFA gedurende 1 uur en gekleurd met Masson ‘ s trichrome procedure (Sigma). Beelden genomen met een Olympus bx50 microscoop met behulp van een 2 × objectief, en acht secties per muis werden gebruikt om de wanddikte op afstand te meten en de grootte van het litteken te bepalen met behulp van de middellijn boog methode met behulp van MIQuant software66. Voor immunohistochemie, werden weefselsecties gefixeerd in aceton gedurende 20 min, permeabilized met 0,1% Triton gedurende 10 min en vervolgens geblokkeerd in 10% serum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Primaire antilichamen werden ‘ s nachts aangebracht bij 4 °C in 10% serum, en vervolgens werden de objectglaasjes 1 uur lang gespoeld en behandeld met secundaire antilichamen bij kamertemperatuur, alvorens te worden gemonteerd met fluorescerend montagemedium (Dako). Voor de detectie van bloedvaten en myofibroblasten, PECAM-1 (ook bekend als CD31; Santa Cruz 101454, 1: 50) en α-SMA (Abcam 5694, 1:200) antilichamen werden gebruikt en gedetecteerd met respectievelijk af594 anti-rat (Life Technologies A11008, 1:500) en AF488 anti-konijn (Life Technologies A11007, 1: 500). M2 macrofagen werden gedetecteerd door af488-geconjugeerd anti-CD206 antilichaam (Biolegend 141710, 1:50). Voor cardiale troponine I-kleuring werden secties geïncubeerd met af488-gelabelde tarwekiem agglutinine (ThermoFisher, W11261) gedurende 1 uur bij 37 °C, gevolgd door incubatie met primair geitencardiaal troponine I-antilichaam (Abcam ab56357, 1:200) en gedetecteerd door donkey anti-goat af594 secundair antilichaam (Life Technologies A-11058, 1:500). Ten slotte werden voor connexin 43-kleuring secties geïncubeerd met connexin 43/GJA1 (Abcam ab11370, 1:400) en cardiale troponine I (Abcam ab188877, 1:200) primaire antilichamen gevolgd door detectie met AF488 anti-konijn (Life Technologies A11007, 1:500) en donkey anti-goat AF594 secundair antilichaam (Life Technologies a-11058, 1:500), respectievelijk. Fluorescerende beelden werden verkregen met behulp van een Zeiss Axio observator microscoop met een ×20 objectief en voor de connexin 43 bevlekte secties werd een Leica Aperio Versa Diascanner met een 20 × objectief gebruikt. Voor alle IHC vlekken werden vier secties per muis geanalyseerd en voor elke sectie 2-4 beelden binnen de grenszone, infarct en afgelegen gebieden werden gebruikt voor analyse. Voor H&e kleuring werden weefselsecties gefixeerd in 10% formaline. De secties werden vervolgens eerst gekleurd in hematoxyline gill ‘ s oplossing Nr. 2 gedurende 7 min, gevolgd door zure alcoholdifferentiatie, en vervolgens 0,5% eosine gedurende 7 min, gevolgd door dehydratie (alle oplossingen van Sigma). Foto ‘ s zijn gemaakt met een Olympus bx50 microscoop. De grenszone werd aangeduid als de GV direct grenzend aan beide zijden van het infarctgebied dat begint wanneer 50% van de LV fibrotisch littekenweefsel is (zie aanvullende Fig. 11 voor een schematische voorstelling).

cx3cr1-EGFP muisexperimenten

om de rekrutering van circulerende mononucleaire cellen in het myocardium na rHC-behandeling te evalueren, werden B6.129P-Cx3cr1 tm1litt/J muizen (Cx3cr1-EGFP) aangekocht bij het Jackson Laboratory. Deze muizen drukken verbeterde groene fluorescente proteã ne in monocytes, dendritische cellen, NK cellen, en hersenenmicroglia uit, en zijn een model dat Voor de studie van mononucleaire celwerving aan het hart wordt gerapporteerd67. 1 week na het MI kregen muizen een behandeling van 50 µl PBS, rHCI of rHCIII, zoals hierboven beschreven. De dieren werden 2 dagen na de behandeling gedood en er werd bloed verzameld in EDTA-tubes. Ook werden harten geperforeerd met PBS en de rechter ventrikel en de apicale regio van de linker ventrikel werden verzameld. De weefsels werden gespoeld met HBSS en verteerd in 2.4U / ml dispase I (Roche) en 1 mg/ml Collagenase B (Roche) gedurende 40 min bij 37 °C. De monsters werden driemaal gewassen met PBS, gecentrifugeerd gedurende 5 min bij 400 g, en de geïsoleerde cellen werden bereid voor flowcytometrie (FACS Aria III; Becton Dickinson). De cellen werden gelabeld met APC-anti-muis/mens CD11b (Biolegend 101211), PE-anti-muis-Ly-6G/6C (Biolegend 108407), PE/Cy5 anti-muis-F4/80 (Biolegend 123111), PE/Cy7 anti-muis-CD38 (Biolegend 102717) en Alexa Fluor® 700 anti-muis CD206 (Biolegend 141733), volgende de door de fabrikant aanbevolen verdunningen (0.25 µg / L per 1 × 106 cellen voor CD11b, Ly-6G/6C, CD38 en CD206, en 1 µg/L per 1 × 106 cellen voor F4/80). Zie Aanvullende Fig. 12 voor Sorteer / gating strategie.

celisolatie en flow cytometrie voor monocyte subgroepen

twee dagen na de behandeling werden muizen gedood door inhalatie van CO2 gevolgd door cervicale dislocatie. Bloed werd verzameld van muizen door hartpunctie in een 50 mM EDTA-oplossing, en RBC ‘ s werden gelyseerd met rode bloedcel (RBC) lysis buffer volgens het Protocol van de fabrikant (Biolegend 420301). Cellen werden geïsoleerd uit geoogste muizenharten met behulp van een digestiebuffer met: DNAse I (50 u/µL; Sigma D5025), collagenase type II (400 U/mL; ThermoFisher 17101015), collagenase D (0,15 U/mL; Sigma 11088866001) en hyaluronidase (10 U/mL; Sigma H3506). Na een uur spijsvertering bij 37 °C werden geïsoleerde hartcellen door een filter van 70 µm geleid. Tenslotte werden geoogste muis milten gepureerd en getrituriseerd door een 70 µm filter gevolgd door incubatie met rode bloedcel (RBC) lysis buffer. Celkorrels werden verzameld door centrifugeren bij ×400 g gedurende 5 min bij 4 °C. Geïsoleerde cellen uit alle weefsels werden geïncubeerd met Zombie Aqua fixable viability dye (1:500, Biolegend 423101) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens werden Fc-receptoren geblokkeerd met TruStain x-reagens (1: 100, Biolegend 103319) gedurende 10 min bij kamertemperatuur. De cellen werden vervolgens geïncubeerd met een antilichaam cocktail voor 45 min op kamertemperatuur met CD45-APC/Brand 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-PE/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1A8), CD3-PE (1:160, Biolegend 17A2), B220-AF488 (1:50, Biolegend RA3-6B2), F480-AF647 (1:100, Biolegend BM8) en Ly6C-BV421 (1: 80, BD Biosciences AL-21). De cytometry stroom werd uitgevoerd gebruikend een FACS Aria III van BD, en de gegevens werden geanalyseerd met FlowJo v10.5. 2 software (zie aanvullende Fig. 12 voor Sorteer / gating strategie). Het totale aantal levensvatbare cellen voor elk weefsel na isolatie werd bepaald door trypan blue exclusion met behulp van een hemocytometer. Het totale aantal cellen binnen elke leukocytenpopulatie werd bepaald met behulp van het percentage levende cellen voor een bepaalde celpopulatie, en het totale aantal levende cellen geteld post-isolatie die vervolgens werd genormaliseerd tot de MG weefsel of mL bloed verzameld. Gating strategie: enkele cellen werden gated gebaseerd op FSC-A en FSC-H. levende enkele cellen werden gated op lage kleuring voor Zombie Aqua levende / dode kleurstof. Uit deze levende eencellige populatie waren leukocyten CD45+. Leukocytensubgroepen werden als volgt gekarakteriseerd: neutrofielen CD45+CD11b+Ly6G+, Ly6C lage monocyten CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C−, Ly6C hoge monocyten CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C+, macrofagen CD45+CD11b+Ly6G−F480+, T-cellen CD45+CD11b−Ly6G−CD3+B220− en B-cellen CD45+CD11b−Ly6G−CD3−B220+. Opmerking voor bloed F480 expressie werd niet gebruikt in de gating strategie. Gates werden ingesteld ten opzichte van isotype besturingselementen.

neonatale cardiomyocytenonderzoeken

neonatale rattenventriculaire myocyten (Nrwm ‘ s) werden pas geïsoleerd met behulp van een vastgesteld protocol68. Linker ventrikels verzameld van 2 dagen oude Sprague-Dawley ratten (Harlan) werden verteerd door trypsine (Amersham Biosciences) en collagenase type II (Worthington Biochemical). Geïsoleerde cellen werden opnieuw gesuspendeerd in de M-199 medium (Life Technologies) aangevuld met 10% FBS, 19,4 mM glucose, 2 mM L-glutamine, 2 U/mL penicilline, 0,8 µg/mL vitamine B12, 10 mM HEPES en 1 × mem niet-essentiële aminozuren (Sigma-Aldrich). Er werden twee rondes van 60 minuten voorplating uitgevoerd, waarbij cardiale fibroblasten zich aan de bodem van de schotel hechten, waardoor de niet-adherente populatie voor Nrwm ‘ s werd verrijkt. De niet-resistente cellen (Nrwm ‘ s) werden vervolgens op de verschillende collageenmatrices gezaaid in 24-Wells platen (40.000 cellen/cm2). Voor de survival assay werden gedurende 3 dagen gekweekte Nrwm ‘ s onderworpen aan m-199 media die 50 µM waterstofperoxide bevatten gedurende 3 uur, waarna een terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) assay werd uitgevoerd en dode cellen werden geteld in drie willekeurige gezichtsvelden.

celculturen

volgens een vastgesteld protocol werden beenmerg-afgeleide macrofagen geïsoleerd van 8-12 weken oude C57BL/6J mice69. Muizen werden geëuthanaseerd door CO2-inhalatie en cervicale dislocatie, en scheenbeenderen werden verzameld en gespoeld met media om het beenmerg te isoleren. Het beenmergisolaat werd herhaaldelijk gepipetteerd om een eencellige suspensie te verkrijgen, die vervolgens door een celzeef werd doorgegeven. Pas geà soleerde cellen werden gedurende 1 week gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS, 20% 29-geconditioneerde media en penicilline–streptomycine, en vervolgens gedurende 3 dagen op de rHC-hydrogels verzilverd. Uit de rHC-hydrogels werden cellen verzameld met behulp van 3 mM CaCl2 Hank ‘ s buffer zoutoplossing met 250 eenheden collagenase I (Gibco). De polarisatie van de macrofagen werd beoordeeld door middel van flowcytometrie (FACS Aria III; Becton Dickinson) met behulp van CD86 en CD206 (Biolegend) om respectievelijk M1 en M2 macrofagen te identificeren. Voor mononucleaire celisolatie werd beenmerg uit tibiabeen verzameld zoals hierboven beschreven. Mononucleaire cellen werden gezuiverd door middel van density gradient centrifugatie met Histopaque® (Sigma) volgens de instructies van de fabrikant. Cellen waren gelabeld met 0.5 µg / ml DAPI (Sigma) gedurende 30 minuten bij 37 °C.

macrofaag adhesietest

mononucleaire cellen werden geïsoleerd door het scheenbeen en het dijbeen van 6 tot 12 weken oude muizen te spoelen. De cellen werden gezuiverd door middel van centrifugering van de dichtheidsgradiënt met Histopaque® (Sigma) volgens de instructies van de fabrikant. Mononucleaire cellen werden geteld en geëtiketteerd met DAPI. Cellen werden geplateerd op de verschillende biomaterialen bij een concentratie van 50.000 cellen / cm2 gedurende 24 uur. cellen werden gefixeerd met 4% PFA gedurende 5 min, en cellen werden geteld. De gegevens werden uitgedrukt ten opzichte van de controle (niet-gecoate putten, d.w.z., TCP ‘ s) om het effect van interdonorcelvariabiliteit te minimaliseren.

macrofage migration assay

beenmerg mononucleaire cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS, 20% 299 geconditioneerd medium en Pen/Strep gedurende 7 dagen om beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) te genereren en gelabeld met DAPI, zoals hierboven beschreven. Bmdm ‘ s (2 × 105) werden vervolgens opnieuw gesuspendeerd in EBM zonder groeifactoren en serum, en geladen in de bovenste kamer van een Transwell plaat (Life Technologies) gecoat met 100 µL rHCI of rHCIII. De onderste kamer bevatte volledige macrofaagmedia zoals hierboven beschreven. Na 24 h, werden de tussenvoegsels verwijderd, en het aantal BMDMs dat door het biomateriaal migreerde werd gekwantificeerd op een geblindeerde manier gebruikend een Zeiss Z1 fluorescentiemicroscoop. De gegevens werden uitgedrukt ten opzichte van de controle (niet-gecoate putjes, d.w.z. TCP ‘ s) om het effect van interdonorcelvariabiliteit te minimaliseren.

Macrofaagpolarisatietest

Bmdm ‘ s werden gegenereerd in DMEM aangevuld met 10% FBS, 20% 299 geconditioneerd medium en Pen/Strep gedurende 7 dagen, zoals hierboven beschreven. Voor macrofaagactivatie-experimenten werden cellen gedurende 3 dagen gestimuleerd met lipopolysaccharide (1 µg/ml; Sigma) plus IFN-γ (50 ng/ml; Sigma) voor M1-activering, of met IL-4 (20 ng/ml; r&D-systemen) voor M2-activering. Het totale RNA werd geëxtraheerd gebruikend Tri reagens (Zymo onderzoek), volgens het Protocol van de fabrikant. Eerste-streng cDNA werd gesynthetiseerd met Smartscribe Reverse Transcriptase (Takara Bio USA) en random hexamer primers (Fisher Scientific). De mRNA-waarden van het doelgen werden beoordeeld aan de hand van kwantitatieve RT-PCR met LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix (Roche) en een LightCycler 480 Real-Time PCR-systeem (Roche). Sequenties voor primerparen zijn vermeld in aanvullende tabel 2. De relatieve veranderingen in mRNA-uitdrukking werden bepaald door de ∆∆CT-methode, die als niveaus ten opzichte van 18S wordt uitgedrukt. de gegevens werden uitgedrukt ten opzichte van de controle (noncoated wells, d.w.z., TCP ‘ s) om het effect van Inter-donorcelvariabiliteit te minimaliseren.

overleving na blootstelling aan H2O2

cellen werden gedurende 7 dagen gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS, 20% 2929-geconditioneerd medium en Pen/Strep. Op dag 7, werden de media veranderd in dmem die 0.5 mM waterstofperoxide bevatten, en de cellen werden gecultiveerd 3 h alvorens met 7-AAD voor analyse door cytometry stroom worden bevlekt. De gegevens werden uitgedrukt ten opzichte van de controle (niet-gecoate putjes, d.w.z. TCP ‘ s) om het effect van interdonorcelvariabiliteit te minimaliseren.

statistische analyse

statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Kaleida grafiek 4.5®. Alle gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SEM. Voor de vergelijking van in vivo gegevens tussen behandelingen, werd een ANOVA gebruikt gevolgd door Holm correctie voor meerdere vergelijkingen. Littekengrootte werd geanalyseerd met behulp van een meervoudige regressie, inclusief behandelingsgroep (rHCI, rHCIII en PBS) en LVEF bij baseline. rHCI en rHCIII waren in vergelijking met PBS significante voorspellers van infarctgrootte, naast de baseline LVEF. De correlatiecoëfficiënt voor het model is 0,6 met STATA multiple linear regression. In vitro NRVM, macrofaag en cardiale fibroblast gegevens werden geanalyseerd, hetzij door een Student t-test of door een one-way ANOVA met een Holm correctie voor meerdere vergelijkingen, zoals gespecificeerd in de figuur legends.

samenvatting van de rapportage

meer informatie over de opzet van het onderzoek is beschikbaar in de samenvatting van de rapportage over natuuronderzoek die aan dit artikel is gekoppeld.