Macrofaagdepletie door Clodronaatbevattende liposomen vermindert Neointimale vorming na Ballonletsel bij ratten en konijnen

ontstekingscellen spelen een belangrijke rol bij vasculair herstel, die onmiddellijk na de verwonding worden gerekruteerd.1,2 macrofaaginfiltratie in atherectomieweefsel en de activeringsstatus van bloedmonocyten correleren met een verhoogd percentage restenose.3,4 de gevolgen van macrofagen in restenosis worden waarschijnlijk veroorzaakt door hun capaciteit om talrijke de groeifactoren, cytokines, en enzymen uit te drukken die tot de ontwikkeling van restenosis bijdragen.5 aldus veronderstelden we dat systemische inactivatie van monocyten en macrofagen kan leiden tot verzwakking van neointimale vorming en dat macrofagen een centrale rol spelen in de pathogenese van restenose.

Macrofaagdepletie kan worden bereikt met de systemische injectie van liposomen die clodronaat bevatten.Clodronaat behoort tot de familie van bisfosfonaten (BPs), botzoekende middelen die krachtige remmers van osteoclasten zijn. Als andere BPs, heeft clodronate slechte celmembraan permeabiliteit.7 liposomen worden gemakkelijk opgenomen door cellen van het reticuloendothelial systeem, in het bijzonder macrofagen. Liposoom-bemiddelde levering van clodronate inactiveert en doodt macrofagen na efficiënte fagocytosis8 maar is niet toxisch aan niet-phagocytic cellen.6

methoden

liposomen

Clodronaat (Sifavitor) en rhodamine RE (Avanti polaire lipiden) werden ingekapseld in liposomen bestaande uit 50 µmol/l distearoylfosfatidylglycerol (DSPG) (Avanti), 100 µmol/l cholesterol (Sigma Chemicals) en 150 µmol/l 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (dspc) (Avanti) door middel van Reverse-Phase verdamping techniek, zoals elders beschreven.De gemiddelde grootte van liposomen was respectievelijk 190±18 nm, 24,5 mmol/L en 20 mmol/L, clodronaat en lipiden.

validatie van LC biologische activiteit werd bepaald op macrofaag-achtige ruwe 264 cellen. LC maar niet vrij clodronaat verminderde het aantal en de proliferatie van levensvatbare cellen op dosisafhankelijke wijze aanzienlijk en had geen invloed op de levensvatbaarheid en proliferatie van gladde spiercellen (SMC ‘ s) of endotheelcellen (EC) bij concentraties tot 500 µmol/L (gegevens niet getoond), overeenkomstig de gepubliceerde gegevens.8,10

Konijn Model

Nieuw-Zeelandse witte konijnen (Harlan Laboratories, Jeruzalem, Israël) met een gewicht van 2,5 tot 3.5 kg werd gebruikt in overeenstemming met de richtlijnen voor dierenverzorging van de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem en de National Institutes of Health (USA). Dieren kregen een atherogeen dieet van 2% cholesterol en 6% pindaolie, te beginnen 30 dagen voor angioplastiek. Hypercholesterolemie werd vastgesteld (plasmacholesterol >1200 mg / dL). De dieren werden verdoofd door xylazine (7 mg/kg) en ketamine (40 mg/kg). Er werden heparine (200 E/kg), atropine (0,05 mg) en norfloxacine-nicotinaat (70 mg) toegediend. Ballonletsel werd uitgevoerd aan de linker halsslagader met een 3-mm angioplastiek ballonkatheter (Cordis, 2×1-minuten inflatie bij 8 atm). De dieren werden willekeurig toegewezen aan intraveneus liposomaal of vrij clodronaat (15 mg/kg), lege liposomen of buffer. Een onderzoeker verblind voor het type experimentele groep voerde de experimenten uit. Na euthanasie met pentothal werden de slagaders in situ perfusie-gefixeerd met 150 mL van 4% formaldehyde-oplossing (pH 7.4), verwerkt voor morfometrische analyse, en gekleurd met Verhoeff elastine kleuring, Mayer hematoxyline en eosine, en gemodificeerde movat pentachroom.

rattenmodel

mannelijke Sabra-ratten (Harlan-laboratoria), met een gewicht van 350 tot 420 g, werden gebruikt. Het model van de halsslagader van de rat werd uitgevoerd zoals eerder beschreven.11,12 liposomaal clodronaat (15 mg / kg) werd geïnjecteerd op dagen -1 en +6. Organen werden op dag 14 geoogst en verwerkt zoals hierboven beschreven.

morfometrische analyse

acht tot tien secties van elke dia werden geanalyseerd door middel van geautomatiseerde morfometrische analyse (NIH-Afbeelding) door een onderzoeker die geblindeerd was voor het type van de experimentele groep. De sectie met de grootste luminale vernauwing door neointima werd geanalyseerd zoals eerder beschreven.11 het resterende lumen, het gebied begrensd door de interne elastische lamina (oorspronkelijke lumen), en het gebied begrensd door de externe elastische lamina (totale arteriële gebied) werden direct gemeten. De mate van neointimale verdikking werd uitgedrukt als de verhouding tussen het oppervlak van de neointima en het oorspronkelijke lumen (% stenose) en als de verhouding tussen het neointimale oppervlak en het oppervlak van het medium (N/M). De mate van remodeling, constrictive (negatief) en expansive (positief), en remodeling ratio (RR) werd geschat door de verhouding van het totale arteriële gebied van het ballon-gewonde segment te vergelijken met die van een aangrenzend, niet-beschadigd referentiesegment.

Stroomcytometrie

anticoagulerend bloed (200 µL) werd gedurende 30 minuten (4°C, in het donker) geïncubeerd met anti-humaan RPE-geconjugeerd anti-CD14 (DAKO) van muizen. FACS lysing-oplossing (1: 20 verdunning) werd gedurende 15 minuten toegevoegd. De resterende cellen werden gewassen (×1500 RPM, 5 minuten, 4°C) in FACS-medium (PBS, 1% BSA, 0,02% natriumazide) en gesuspendeerd in 1 mL FACS-medium voor cytometrie stroom. Monocytes werden geà dentificeerd volgens hun relatieve grootte, side-scattering, en fluorescentie.

distributie van liposomen

konijnen werden geïnjecteerd met met rhodamine gelabelde liposomen (0,4 mg/kg) en LC of buffer op dag -1 en geëuthanaseerd op dagen +1 en +6. Bloedmonocyten werden gescheiden met behulp van een ficoll gradiënt (Sigma) en centrifugatie (×1500 RPM, 5 minuten). Geoogste weefsels werden gespoeld in zoutoplossing; secties werden gemonteerd op dia ‘ s en waargenomen door confocale microscopie (Zeiss LSM 410).

immunohistochemie

de Geëxlaneerde monsters werden na een korte zoutdoorbloeding verwijderd en onmiddellijk ingevroren in de OCT-verbinding voor cryosectie (Ted Pella, Inc). De objectglaasjes werden gedeparaffiniseerd, geïncubeerd met 1% H2O2 in methanol (10 minuten) om endogene peroxidase te blokkeren, en vervolgens met 10% PBS in paardenserum gedurende (20 minuten). Primaire antilichamen voor konijn RAM-11 (DAKO) of PCNA (PC10, DAKO) werden aangebracht gedurende 1 uur bij 37°C. De secties werden vervolgens gewassen met PBS gevolgd door gebiotinyleerd secundair antilichaam (paarden anti-muis IgG, Vectorlaboratorium) en een avidine-biotine-peroxidase complex (ABC Elite kit, Vectorlaboratorium) gedurende elk 30 minuten. Kleurontwikkeling werd bereikt door 5 minuten blootstelling aan 3,3 ‘ – diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB peroxidasesubstraat, Sigma Chemical Co) in aanwezigheid van peroxidasesubstraat (Sigma). De dia ‘ s waren licht tegenbestendig met Gill No.3 hematoxyline (Sigma). Positieve kleuring werd geëvalueerd onder een microscoop (Olympus, BX40) bij 2×/0,25 10×/0.25 vergroting en gedigitaliseerde videoframes. De prevalentie van macrofagen werd beoordeeld als het gemiddelde percentage van het gebied dat wordt ingenomen door positief gekleurde cellen in 5 tot 6 velden met een hoog vermogen.

IL – 1β productie en transcriptie

afzonderlijke groepen dieren werden gebruikt voor deze studies. Slagaders en levers werden gehomogeniseerd in collagenasebuffer en geëxtraheerd IL-1β werd gemeten met commerciële ELISA-kits (R&D-systemen).

voor de reverse transcriptie-polymerasekettingreactieanalyse (RT-PCR) werd RNA uit de halsslagaders geëxtraheerd met behulp van een RNA-isolatiekit (Life Technologies). De kwaliteit, de grootte, en de hoeveelheid van RNA werden onderzocht, en de waarden van de banden werden genormaliseerd aan β-actin mRNA uitdrukking.13

Matrix Metalloproteïnase-2 Activiteit

het supernatant van slagadershomogenaat in collagenasebuffer werd geanalyseerd op collagenaseactiviteit. De monsters werden gescheiden op gelatine-geïmpregneerd (1 mg / mL: Difco) SPS 8% polyacrylamide gels onder niet-reducerende omstandigheden, 30 minuten geschud in 2,5% Triton X-100 (BDH), geïncubeerd in collagenasebuffer (16 uur, 37°C) en gekleurd met 0,5% Coomassie g 250 (BioRad) in methanol/azijnzuur/H2O (30:10:60). De bandintensiteit werd bepaald door middel van gecomputeriseerde densitometrie (moleculaire dynamica type 300A).

statistieken

gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde±SD. Vergelijkingen van histologische bevindingen tussen de controlegroep en de behandelingsgroep werden gemaakt door de T-test van de ongepaarde Student. Vergelijkingen van bloedmonocyten en cytokines in de tijd werden gemaakt met 2-weg Anova analyse. Verschillen werden statistisch significant genoemd bij P<0,05.

resultaten

preventie van Postangioplastiekhyperplasie

massale proliferatie van SMC ‘ s en extracellulaire matrixvorming werd waargenomen bij controledieren na ballonletsel (figuur 1, a en b). Er werden geen significante verschillen gevonden tussen de behandeling met lege liposomen, zoutoplossing of vrij clodronaat in oplossing (resultaten samengevoegd als controles). De N / M-verhouding was 1,4±0,44 (figuur 1e) en de luminale stenose was 75±8%. LC (15 mg/kg, dag -1 en +6) verlaagde de N/M-verhouding tot 0,66±0,2 (figuur 1,c, d en e) en luminale stenose tot 41±8%. Milde expansieve remodellering trad op in beide controle (RR = 1. 22±0,24) en met LC behandelde dieren (RR=1,29±0,25). Het mediale gebied, de botmorfologie en de minerale samenstelling werden niet beïnvloed door LC-behandeling (gegevens niet getoond). Er werden geen duidelijke infectie en geen detecteerbare systemische bijwerkingen waargenomen.

om het effect van de macrofaagdepletie in een niet-hypercholesterolemisch diermodel (geen schuimcellen) vast te stellen, werd gebruik gemaakt van het Rat carotis letselmodel.De uitgesproken neointima werd onderdrukt door LC-behandeling, zonder significante verandering in mediale en totale arteriële oppervlakte (tabel).

Mechanisme van Actie

Vermindering van Bloed Monocyten en Weefsel Macrofagen

Baseline monocyten niveau is 2.8±0.5% van de witte bloedcellen (WBC). Vóór de operatie, 24 uur na de LC-injectie,waren de monocyten sterk verminderd tot <0,2% van de totale WBC (Figuur 2, a en b), terwijl het aantal WBC onveranderd bleef. Drie dagen na de operatie werden de bloedmonocyten licht verhoogd tot 3,5±0,4% bij de controledieren en 0,7±0,7% bij de met LC behandelde dieren, waarna na 6 dagen werd teruggekeerd naar de uitgangswaarden (figuur 2c).

lever-en miltmacrofagen werden verminderd door LC (RAM 11 kleuring) 6 dagen na de verwonding (Figuur 3). Het positief gekleurd gebied in de lever was significant verminderd van 21,5±4% tot 14,7±2,9% en in de milt van 33,3±1,5% tot 11,4±3% bij respectievelijk controle-en LC-behandelde konijnen. Evenzo werd bij met LC behandelde konijnen 3 en 6 dagen na de verwonding een verminderde arteriële RAM-11 kleuring voor macrofagen waargenomen (Figuur 4).

de vermindering van monocyten en macrofagen werd ook ontdekt door injectie van fluorescente liposomen (FL). Een duidelijke vermindering van het fluorescerende signaal werd waargenomen in bloedmonocyten (evenals een verminderd aantal) en in de lever en milt van met LC behandelde dieren (Figuur 5). FL werd gedetecteerd in gewonde maar niet in intacte slagaders. FL gelijktijdig toegediend met LC verminderde significant het fluorescerende signaal in de gewonde arteriële wand (Figuur 5).

PCNA, IL-1β en Matrix Metalloproteïnase-2

het positief gekleurde oppervlak voor PCNA 6 dagen na de verwonding was significant verminderd van 5,6±2,6% bij controledieren tot 1,7±1,3% bij met LC behandelde konijnen (Figuur 6, a en b). Neointima werd nauwelijks waargenomen op dit vroege tijdstip waarop SMC-proliferatie maximaal is.

analyse van IL-1β-spiegels in arterieel weefsel na verwonding toonde een klokvormig patroon aan dat 6 dagen na de verwonding piekte en na 30 dagen terugkeerde naar de basale spiegels (figuur 7a), en een significante afname van IL-1β-spiegels werd waargenomen na 3 en 6 dagen bij met LC behandelde dieren. Bij controledieren was de IL-1β mRNA-transcriptie sterker op dag 3 dan de zwakkere expressie 1 dag na de verwonding, maar beide werden significant verminderd door LC-behandeling (figuur 7b). De IL-1β-spiegels in de lever namen ook af na een enkele injectie met LC op dag -1, waarbij na 30 dagen de basale spiegels werden bereikt (gegevens niet getoond).

de activiteit van arteriële matrixmetalloproteïnase (MMP-2) nam toe na verwonding, waarbij een klokvormig patroon een piek vertoonde na 6 dagen (292±46) en na 14 dagen terugkeerde naar de basale niveaus (figuur 7c). LC verlichtte significant de MMP-2 Activiteit, en op dag 6 was het slechts 52±17.

discussie

deze studie toont voor het eerst aan dat inactivatie van macrofagen door systemische toediening van liposoom-ingekapseld clodronaat het luminaal verlies na ballonletsel Remt bij zowel ratten als hypercholesterolemische konijnen. Deze resultaten bevestigen onze hypothese dat macrofagen een centrale rol spelen in de pathogenese van versnelde arteriopathieën. De waargenomen toename in luminaal gebied werd voornamelijk bereikt door vermindering van neointimale hyperplasie. Een milde toename van expansieve remodellering werd ook aangetoond, maar zijn bijdrage aan het verschil in Luminal gebied was minimaal.

Clodronaat behoort tot de familie van BPs, geneesmiddelen die klinisch worden gebruikt bij botgerelateerde aandoeningen, waaronder osteoporose. Zeer hydrofiel en negatief geladen, zijn vrije BPs bijna niet in staat om cellulaire membranen te kruisen.BP opname door botresorberende osteoclasten (afkomstig als macrofagen uit bloedmonocyten) treedt op wanneer de cellen geneesmiddel-gecoat bot overspoelen.Noch vrij clodronaat noch LC remde SMC-of EC-proliferatie of neointimale vorming. De efficiënte en selectieve endocytose van clodronate in macrophages wordt bereikt door clodronate in liposomes in te kapselen.9,10,14 na fagocytose verstoort de lysosomale werking de vette bilagen van het liposoom en het vrije clodronaat wordt vrijgegeven in de cel, veroorzakend onomkeerbare functionele schade en apoptosis.8,15

LC toediening onderbrak waarschijnlijk de vroege fase respons op letsel, die gemedieerd wordt door macrofaag migratie als reactie op MCP-1 expressie.Injectie van LC vóór letsel sterk uitgeputte bloedmonocyt (Figuur 2) en macrofaag aantal en activiteit in de lever, milt, en gewonde arteriële wand (figuren 3, 4 en 5). De vermindering van het aantal monocyten dat beschikbaar was op het moment van verwonding verminderde intimale hyperplasie, misschien vergelijkbaar met de effecten die werden waargenomen bij deactivering van bloedmonocyten door IL-10.17 blokkering van de migratie van monocyten/macrofaag naar het gewonde vat vanuit het lumen en/of adventitia (Figuur 5) voorkwam de effecten van deze cellen op de migratie en proliferatie van SMC.

IL-1β-en MMP-2-spiegels waren verlaagd in gewonde arteriële segmenten na LC-behandeling. Deze belangrijke producten van geactiveerde macrofagen, uitgescheiden na arteriële schade, dragen bij aan het proces van neointimale proliferatie.18-20 verminderde SMC proliferatie kan ook bijdragen tot de vermindering van IL-1β en MMP-2.21 niettemin, aangezien LC geen invloed hebben op SMC ‘ s en ECs en geen effect hebben op fibroblasten 9,is de macrofaag waarschijnlijk het primaire doel voor LC. De remming van intimale hyperplasie in het rattenmodel, zonder schuimcellen in de slagader, ondersteunt verder systemische depletie van macrofagen omdat het aandrijfmechanisme SMC-proliferatie en neointimale vorming verminderde. Samen verminderde dit voorbijgaande systemische immunomodulerende en ontstekingsremmende effect SMC-migratie en-proliferatie en arteriële restenose.

onze bevindingen zijn gelijktijdig met de gunstige effecten waargenomen na modulatie van de macrofaagfunctie door verschillende modaliteiten. Verminderde neointima-vorming na letsel werd bereikt bij konijnen door blokkade van Mac-122 en bij Mac-1–deficiënte muizen.Dus, in overeenstemming met recente rapporten, 9,17,22,23 het ontstekingsproces speelt een centrale rol in de cascade van neointima vorming. Depletie van de macrofaag vermindert ook hyperplasie van veneuze transplantaten.Ondanks de verschillende pathologie in termen van trigger, getroffen vat, de onderliggende plaque in de angioplastied slagader, samenstelling van het stenotisch weefsel, en de duur van het proces, het positieve effect in de ader graft model suggereert een gemeenschappelijke rol van macrofagen in het stimuleren van vasculaire intimale hyperplasie.

implicaties en beperkingen

vrij clodronaat doordringt geen cellen en heeft een korte halfwaardetijd in de systemische circulatie.Clodronaat dat uit dode macrofagen en liposomen lekt, hoopt zich niet in significante mate op in andere weefsels dan het bot. Er werd geen effect gezien op de somatische groei of op het serummineraalgehalte na behandeling met LC, aangezien de uitkomst van de liposomale formulering, zoals bij de meeste andere liposomen en deeltjesdotiesystemen, zich in het reticulo-endotheliale systeem bevond. Bovendien zouden twee injecties van 15 mg/kg vrij clodronaat geen effect moeten hebben op het normale bot.

inactivatie van macrofagen brengt het gevaar van immunosuppressie en infectie met zich mee. Echter, zoals in studies met Mac-1-deficiënte mice26 en ratten, 24 werd in onze studie met voorbijgaande macrofaagdepletie geen openlijke infectie waargenomen. Bloedmonocyten herstelden in dit onderzoek 6 dagen na injectie volledig en IL-1β concentraties keerden terug naar basale niveaus. Andere hebben aangetoond dat herstel van de macrofaagfunctie 4 tot 6 dagen na LC-geïnduceerde depletie geen toxische effecten op lange termijn veroorzaakt.6,14 de klinische implicaties van voorbijgaande, partiële depletie van lever-en miltmacrofagen met systemische LC moeten verder worden onderzocht in studies bij mensen.

een groot aantal meldingen van farmacologische pogingen om intimale hyperplasie bij dieren te remmen, werd niet vertaald in daaropvolgende remming van restenose bij de mens. De huidige studie gebruikt LC als een onderzoeksinstrument om de rol van ontsteking in vasculaire reparatie en de mogelijke waarde van modulerende aangeboren immuniteit in vermindering van postinjury intimale hyperplasie te verduidelijken. Dat het voordeel werd waargenomen in twee diermodellen, de rat en het hypercholesterolemisch konijn, met ongelijksoortige schade en verschillende mate van ontsteking, ondersteunt de belangrijke rol van monocyten en macrofagen in vasculaire reparatie en verhoogt de voorspellende waarde voor remming van restenose bij mensen.

macrofaagrijke gebieden komen voor in atherosclerotische laesies van patiënten met instabiele angina en acuut myocardinfarct 3 en macrofagen bemiddelen waarschijnlijk breuk van de atherosclerotische plaque en plotseling optreden van acute coronaire syndromen.Verdere studies zijn gerechtvaardigd om te onderzoeken of de macrofaagdepletie door liposomale bisfosfonaten een strategie kan vormen voor het stabiliseren van andere inflammatoire-gemedieerde vasculopathieën en cardiomyopathieën, waaronder acute coronaire syndromen.Concluderend kan worden gesteld dat toediening van LC de neointimale proliferatie remde na ballonletsel bij ratten en in de hypercholesterolemische konijnenmodellen. Het voorgestelde mechanisme is systemische selectieve, voorbijgaande modulatie van monocyt/macrofaag activiteit. Macrofagen, hoewel relatief mager in neointimaal Weefsel, spelen een belangrijke rol in het proces van neointimale proliferatie. Daarom verminderen vroege modulatie en inactivatie van macrofagen gedurende 1 week na letsel significant postangioplasty arteriële vernauwing op een later tijdstip.

voetnoten