Minimum Information for reporting on the Comet Assay (MIRCA): recommendations for describing comet assay procedures and results

de MIRCA-richtsnoeren zijn opgesteld door leden van hCOMET COST Action met als doel de analyse en rapportage van de Comet assay-resultaten te verbeteren (http://www.hcomet.eu/). De auteurs zijn comet-testdeskundigen met minimaal acht jaar ervaring met deze tests (15 van de auteurs hebben >20 jaar relevante ervaring). We hebben gebruik gemaakt van een op internet gebaseerde vragenlijst om de meningen van de auteurs over het belang van rapportagedetails te analyseren (Tabel 1; aanvullende gegevens). Elk stuk informatie werd door de auteurs geclassificeerd als “essentieel”, “wenselijk” of “niet belangrijk”, en een drempel van ≥75% Congruentie werd gebruikt voor de classificaties. Indien het aantal antwoorden op “essentiële informatie” niet de drempel van 75% overeenkomst bereikte, werden de antwoorden op “essentiële informatie” en “wenselijke informatie” gecombineerd en werd het stuk informatie geclassificeerd als “wenselijke informatie” indien ≥75% van de auteurs het ermee eens was dat het “essentieel” of “wenselijk” was. In Tabel 1 zijn voor elke aanbeveling toelichtingen opgenomen.

specifieke MIRCA-aanbevelingen voor elke stap van de comet-bepaling

stap 1A: Isolatie van cellen en bereiding van eencellige suspensies

aangezien bij de comet-test gebruik wordt gemaakt van suspensies van eencellige cellen, moeten monsters die niet als eencellige cellen worden verkregen, mechanisch of enzymatisch worden behandeld om de hechting van cellen aan een extracellulaire matrix of aan elkaar te verstoren. De homogenisatie van weefsels door mechanische verstoring kan zelf DNA-schade veroorzaken, terwijl de enzymatische spijsvertering van weefsel kan leiden tot de verwijdering van DNA-letsels toe te schrijven aan de activiteit van endogene DNA-reparatieenzymen, of de niveaus van DNA-schade verhogen door nucleases van de cellen vrij te geven. De samenstelling van de homogenisatiebuffer is ‘wenselijke’ informatie, met name met betrekking tot de componenten die nodig zijn voor het behoud van de integriteit van DNA (bijvoorbeeld ethyleendiaminetetra-azijnzuur)24,25. Een beschrijving van de procedure voor de isolatie van eencellige suspensies, met inbegrip van de homogenisering van het weefsel, wordt als “wenselijke” informatie in artikelen beschouwd.

bloedmonsters worden vaak gebruikt in humane biomonitoringstudies. Omdat bloed een heterogene celpopulatie vertegenwoordigt, is gedetailleerde informatie over de celpopulatie ‘essentieel’ in publicaties. De tekst moet nauwkeurig beschrijven of de monsters volbloed (met inbegrip van rode bloedcellen), leukocyten, mononucleaire bloedcellen of een subset van cellen (bijvoorbeeld lymfocyten) zijn. Het kan ook nuttig zijn om informatie op te nemen over de procedure voor aderpunctie, het type anticoagulans en de daaropvolgende methode van celisolatie (d.w.z. centrifugeren en wassen) voor degenen die het experiment herhalen, zodat dit wordt geclassificeerd als “wenselijke” informatie. Informatie over de bewaarcondities van de cellen of weefsels indien deze cryopreserveerd worden, alsmede de invriesmethode (bv. “snap invriezen” op droog ijs of in vloeibare stikstof, of een procedure voor langzaam invriezen) en de ontdooiingsprocedure worden beschouwd als “essentiële” informatie om te rapporteren, aangezien is aangetoond dat deze processen het basale niveau van DNA-migratie beà nvloeden26.

stap 1B: Bereiding van substraatcellen voor de in vitro DNA repair assay

elk eukaryotisch celtype kan worden gebruikt als substraatcel voor de in vitro DNA repair assay, en het celtype en de dichtheid zijn “wenselijke” informatie om te rapporteren. Het is’ essentieel ‘ om de methode en het type genotoxische verbinding te rapporteren die wordt gebruikt om DNA-laesies in de substraatcellen en de daaropvolgende celopslagomstandigheden te induceren, terwijl het totale niveau van DNA-laesies die in de substraatcellen kunnen worden gedetecteerd (bijv. het aantal formamidopyrimidine-DNA-glycosylasegevoelige plaatsen in cellen behandeld met Ro19-8022 plus licht) wordt alleen als ‘wenselijke’ informatie beschouwd.

stap 1C: testcontroles

in dit artikel verwijzen testcontroles naar monsters die in elk comet-testexperiment zijn opgenomen; deze worden soms referentiestandaarden, interne controles of technische controles genoemd 16,27. De assay controles zijn typisch cryopreserveerde aliquots uit een enkele partij cellen die zijn blootgesteld aan een DNA-streng-brekend middel (bijv. ioniserende straling, waterstofperoxide of methylmethaansulfonaat) of een behandeling die een specifiek type DNA-laesie veroorzaakt (bijvoorbeeld de fotosensitizer Ro19-8022 plus licht, of kaliumbromaatbehandeling, om DNA-oxidatie te induceren). Er zijn verschillende testcontroles voor de standaard alkalische comet-test en de enzyme-modified comet-test. De samenstelling die voor de enzym-gewijzigde analyse wordt gebruikt zou geen de bundelbreuken van DNA moeten produceren, aangezien deze de dynamische waaier van de enzym-gevoelige plaatsen verminderen. In biomonitoring studies, evenals cross-sectionele, interventionele en klinische studies, kunnen onbelichte cellen worden gebruikt als assay controles. Het is “essentieel” om de schadeniveaus in de testcontroles en de variatie in de test (standaardafwijking) in zowel de standaard-als de enzyme-gemodificeerde comet-test te rapporteren.

de in vitro DNA-reparatietest maakt gebruik van interne experimentele controles, die ook worden gebruikt bij de berekening van de reparatieactiviteit, in plaats van controles per se. Het is essentiële informatie om het verslag van het niveau van de DNA-reparatie incisies in nucleoids van (i) de niet-blootgestelde substraat cellen geïncubeerd met reactie buffer, voor het bepalen van de basale niveau van DNA-schade in de substraat-DNA (d.w.z. de ‘achtergrond control’); (ii) blootgestelde cellen geïncubeerd met het reactie buffer, om te onthullen het niveau van een niet-specifieke DNA-streng breekt of abasic sites als gevolg van de behandeling met de schadelijke agent (d.w.z. de ‘treatment control’); iii) niet-blootgestelde substraatcellen geïncubeerd met eiwitextract uit het monster, om te controleren op niet-specifieke incisie-of splitsingsactiviteit (d.w.z. de “specificiteitscontrole”); en iv) blootgestelde substraatcellen geïncubeerd met laesiespecifiek enzym, vergelijkbaar met testcontroles voor de enzyme-modified comet-test (d.w.z. de “incubatiereactiecontrole”).

stap 1D: negatieve en positieve controles

in dit artikel hebben negatieve en positieve controles betrekking op de experimentele groepen, zoals beschreven in de OESO-richtlijn (TG 489) voor de in vivo Comet-test in dierlijke weefsel18. Negatieve en positieve controles hebben dus betrekking op het hele experiment. Een positieve controle heeft betrekking op een direct of indirect werkende genotoxische verbinding die DNA – strengenbreuken of enzymgevoelige plaatsen veroorzaakt die met de comet-test worden gedetecteerd. Voor de enzyme modified comet-test is er geen lijst van positieve controles beschikbaar die overeenkomt met de verbindingen in de OESO-lijsten als positieve controles voor de alkalische comet-test (voor het induceren van DNA-strandbreuken) in specifieke dierlijke weefsels. Bovendien bestaat er geen positieve controle voor biomonitoringstudies bij de mens, aangezien gezonde mensen niet opzettelijk aan een genotoxisch middel kunnen worden blootgesteld. Positieve controles worden reeds verplicht geacht in celcultuurexperimenten in de genetische toxicologie en zullen de facto “essentiële” informatie zijn in artikelen die gebruik maken van de comet-test. In dierstudies, echter, voor praktische doeleinden comet gegevens op assay controles (d.w.z., monsters genoemd in de bovenstaande rubriek “stap 1C, controle op de gehalten”) voldoende zijn, terwijl de resultaten van echte negatieve en positieve controles alleen als “wenselijke” informatie worden beschouwd.

Stap 2: inbedding van de cellen in agarose

de comet-test werd oorspronkelijk ontwikkeld met behulp van drie lagen agarose op glasplaten, waarbij de middelste laag de cellen bevatte. De bovenste laag van agarose is echter niet nodig en bepaalde procedures maken geen gebruik van een onderste laag (bijvoorbeeld gelbond film assays). Het is’ wenselijk ‘om het type dia’ s en de grootte (d.w.z., oppervlakte) van de gels, aangezien het aandeel van de cellen dichtbij de rand van het gel toeneemt aangezien de gelgrootte afneemt en DNA in nucleoids bij de rand van het gel anders kan migreren dan dat in nucleoids naar het centrum van het gel22. De uiteindelijke concentratie van agarose (met de daarin ingebedde cellen) is’ essentieel ‘ om te rapporteren, aangezien de migratie van DNA van de dichtheid van het gel afhangt.

Stap 3: Lysis van de cellen

er zijn verschillende procedures voor het lyseren van cellen in de comet-test. Informatie over de samenstelling van de lysis-oplossing is ‘essentieel’. Een extra enzyminbubatiestap (bijvoorbeeld met proteïnase K) kan nodig zijn voor bepaalde soorten cellen, en details van de incubatie moeten ook worden gerapporteerd als ‘essentiële’ informatie. Sommige rapporten suggereren dat de duur van lysis van invloed kan zijn op de stabiliteit van bepaalde soorten DNA-lesionen28,29,30, dus de duur van de lysis en de temperatuur van de lysis-oplossing zijn ‘wenselijke’ informatie te rapporteren.

stap 4A: Behandeling met repairenzymen in de enzyme-modified comet-test

omdat de lysis-oplossing de activiteit van het repairenzym kan remmen, is het “wenselijk” vast te stellen of een wastap is uitgevoerd tussen de lysis-stap en de enzymbehandeling (d.w.z. samenstelling van de wasbuffer, aantal wasbeurten en duur). Het is “essentieel” om informatie over de bron van reparatieenzymen door te geven, aangezien is aangetoond dat enzymen van verschillende fabrikanten verschillen in zowel hun activiteit als hun specificiteit ten aanzien van nucleobase-lesionen16. In de meeste comet-studies worden titratiecurve-experimenten uitgevoerd om optimale condities voor de enzymbehandeling31 vast te stellen; de resultaten van enzymtitratiecurves worden echter zelden gerapporteerd en worden hier geclassificeerd als ‘wenselijke’ informatie (in plaats daarvan zou een verwijzing naar een eerdere studie kunnen worden gemaakt), hoewel we het als ‘essentieel’ beschouwen om de duur en temperatuur van de behandeling te rapporteren. De op de gel aangebrachte enzymconcentratie is ‘essentiële’ informatie; het verdient de voorkeur de concentratie in enzymatische eenheden (E/ml) te melden, hoewel de eiwitconcentratie (mg/ml) ook nuttig is. Het type incubatie-eenheid (bv. incubator, schuifgracht of 12-gelsysteem) en de wijze van incubatie zijn “wenselijke” informatie om te rapporteren. Er moet worden vermeld of de incubatie is uitgevoerd i) in een enzymbad of met een druppel en een dekglaasje op het objectglaasje, ii) in een standaard 2-gel-versie, 12-gel-of multiple-well-systeem of iii) in een bevochtigde doos in een incubator, op een verwarmingsplaat of in een verwarmde gracht.

stap 4B: Bereiding en incubatie van extracten voor de in vitro DNA repair assay

het is “wenselijk” het aantal cellen of weefselmassa te vermelden dat Voor de bereiding van de eiwitextracten is gebruikt, terwijl het “essentieel” is om de uiteindelijke eiwitconcentratie van cel-of weefselextracten die aan het DNA van het substraat worden toegevoegd, te rapporteren. De samenstelling van de extractiebuffer (‘wenselijke’ informatie) is minder cruciaal dan de samenstelling van de incubatiebuffer (‘essentiële’ informatie), omdat deze laatste het achtergrondniveau van DNA-migratie kan beïnvloeden. In overeenstemming met de informatie voor de enzyme-modified comet assay is het “wenselijk” de resultaten van titratie-experimenten te rapporteren of te verwijzen naar eerdere studies van hetzelfde laboratorium, indien deze zijn uitgevoerd. Het volume van extract toegevoegd aan de gel-ingebed substraatcellen is’ wenselijke ‘ informatie. Het is “essentieel” om de duur en de temperatuur van de incubatietijd te rapporteren, omdat deze het aantal incisies beïnvloeden. Wat de enzyme-modified comet-test betreft, is de incubatiemethode ‘wenselijk’ om te rapporteren voor de in-vitro-reparatietest. Informatie over de identiteit van het enzym dat als controle op de incubatiereactie wordt gebruikt (met vermelding van de hoeveelheid DNA-laesies in de substraatcellen) en de samenstelling van de buffer die wordt gebruikt voor het achtergrondniveau van DNA-reparatieinsnijdingen in niet-blootgestelde substraatcellen zijn “essentieel”, omdat zij essentieel zijn om de betrouwbaarheid van de DNA-reparatieinsnijdingsactiviteit aan te tonen.

Stap 5: alkalische behandeling

de oplossing met een hoge alkalische pH verstoort de waterstofbinding die de DNA-strengen bij elkaar houdt en zet ook bepaalde nucleobase-laesies om in DNA-strengenbreuken. Aldus,kan de duur van alkalische behandeling het niveau van de migratie van DNA in de volgende elektroforese beà nvloeden32,33, 34. Specifieke informatie over de samenstelling van de alkalische oplossing, de pH, de temperatuur en de duur van de behandeling zijn dus “essentiële” informatie om te rapporteren.

Stap 6: elektroforese

de belangrijkste oorzaken van DNA-migratie zijn de duur van de elektroforese en de elektrische potentiaal (spanningsval over het platform van de elektroforesetank)35. Het is “essentieel” dat de samenstelling van de elektroforesebuffer, de sterkte van de elektroforese (spanningsgradiënt (V/cm) over het platform van de elektroforesetank) en de duur van de elektroforese worden gerapporteerd. De hoge temperatuur tijdens elektroforese kan de migratie van DNA beà nvloeden36; aldus, is de informatie over de temperatuur van de elektroforeseoplossing ‘essentieel’, en dit kan vergezeld gaan van beschrijvingen van stappen die worden genomen om de temperatuur constant te houden (b.v., Het koelen van het platform of het doorgeven van de buffer).

Stap 7: Neutralisatie

deze stap omvat het verwijderen van overtollige alkalische oplossing uit de objectglaasjes om een efficiënte kleuring te garanderen. Het is’ wenselijk ‘ om de samenstelling van de neutralisatieoplossing te beschrijven.

Stap 8: kleuring en visualisatie

DNA-bindende kleurstoffen hebben een verschillende binding affiniteit met DNA en kunnen daarom de berekening van de primaire komeet assay descriptors in image analysis software verschillend beïnvloeden 36, 37, 38. Het type kleurstof is “essentiële” informatie, terwijl de concentratie “wenselijke” informatie is, evenals de tijd tussen kleuring en visualisatie. De intensiteit van het licht van verschillende soorten microscooplampen verschilt. Bovendien varieert het vanwege de leeftijd van de lamp en de tijd dat deze is ingeschakeld tijdens het scoren van kometen. Nochtans, is er geen standaardprocedure om de intensiteit van licht te meten en het niveau van de migratie van DNA dienovereenkomstig te corrigeren. Bovendien kan dezelfde komeet verschillende niveaus van DNA migratie hebben bij verschillende microscoop vergrotingen. Het is dus’ wenselijk ‘ om de microscoopvergroting te rapporteren die voor de score wordt gebruikt. Het is’ wenselijk ‘ om representatieve beelden van kometen (bijv., controle met weinig of geen migratie, matige en uitgebreide migratie van DNA) naast de gerapporteerde niveaus van migratie van DNA.

stap 9A: scoren en gegevensanalyse

deze stap vereist het rapporteren van “essentiële” informatie voor de primaire comet assay descriptor (bijv.. % DNA in staart, staartlengte, staartmoment of visuele score), het aantal kometen dat per monster wordt geanalyseerd en hoe het totale niveau van de DNA-migratie wordt uitgedrukt (bv. mediaan of gemiddelde van komeetscores). Het is’ niet belangrijk ‘ om het individuele resultaat van elke komeet in elke gel te rapporteren; ze worden gecombineerd om het totale schadeniveau te berekenen. Aangezien niet kan worden uitgesloten dat verschillende softwarepakketten voor beeldanalyse verschillende manieren kunnen hebben om de primaire Comet-assay-predictor te berekenen, is het ‘essentieel’ om de gebruikte software (softwarenaam, fabrikant, versie) te rapporteren. Alle primaire descriptoren delen de beperking dat het nodig is om expertise te hebben in de Comet-test om te begrijpen wat ze betekenen, terwijl als een kalibratiekromme wordt gecreëerd (met behulp van ioniserende straling, die breuken induceert met een bekende frequentie), resultaten kunnen worden omgezet in relatieve laesiefrequentie in vergelijking met ongewijzigde nucleotiden of nucleobaseparen; dergelijke gegevens zijn eenduidig en geven informatie die alle onderzoekers kunnen begrijpen39. De procedure voor het verkrijgen van een kalibratiekromme met behulp van ioniserende straling en het omzetten van DNA-migratieniveaus naar de laesiefrequentie ten opzichte van ongewijzigde nucleotiden of nucleobaseparen is eerder vermeld40. Het is dus ‘wenselijk’om de resultaten te rapporteren als niveaus van laesies per 109 ongewijzigde nucleotiden of 106 nucleobaseparen.

stap 9B: Berekening van enzymgevoelige plaatsen of netto aantal incisies in substraatdna voor de in vitro DNA-reparatietest

de incubatie met DNA-reparatieenzymen verhoogt het niveau van DNA-migratie, aangezien zowel het basale niveau van DNA-strengenbreuken als enzyme-specifieke laesies bijdragen aan het totale aantal DNA-strengenbreuken. Aangezien de DNA-migratie die wordt toegeschreven aan het basale niveau van DNA-schade en enzymspecifieke laesies afkomstig kan zijn van verschillende mechanismen van Genotoxiciteit, is het onvoldoende om alleen het totale niveau van DNA-schade na enzymbehandeling te rapporteren. In plaats daarvan, is het’ essentieel ‘om de Genotoxiciteit als enzymgevoelige plaatsen te melden, waar het basale niveau van de migratie van DNA van de migratie van DNA in de met enzym behandelde dia’ s is afgetrokken.

aangezien bij de in vitro DNA repair assay dezelfde substraatcellen met alle cellen of weefselextractmonsters worden gebruikt, is het niet nodig om voor elk monster in hetzelfde experiment (d.w.z. het uitvoeren van de assay) gelijktijdige achtergrond-en behandelingscontroles te hebben. Er kan meer dan één substraat zijn (bijv., wanneer het analyseren van zowel basis – als nucleotide-uitsnijdingsreparatieactiviteit), en daarom zijn de afzonderlijke controles voor elk type van de reparatieanalyse van DNA nodig. Het is’ essentieel ‘ om de netto incisies door het reparatieextract in het substraatdna te melden.

stap 9C: statistische analyse van de resultaten

statistische analyses zijn “essentieel”. Het type statistische analyse hangt af van de opzet van de studie en volgt de Algemene aannames in statistische tests in genetische toxicologie en biomonitoring41,42.