Infectieuze necrotische hepatitis veroorzaakt door Clostridiumnovyi type B bij een paard: case report and review of theliterature | Jiotower

infectieuze necrotische hepatitis (Inh) wordt veroorzaakt door Clostridium novyitype B. de ziekte treft meestal schapen, waarbij de ziekte ook”zwarte ziekte” wordt genoemd, gezien de donkere verkleuring van het onderhuidse weefsel veroorzaakt door intense veneuze congestie die wordt waargenomen in de karkassen van dieren die aan deze ziekte sterven.Hoewel INH vermoedelijk ook voorkomt bij andere diersoorten,waaronder runderen, geiten en paarden, is er zeer beperkte informatie beschikbaar over deze ziekte bij andere dieren dan schapen.2,3,19,15 Bovendien, vanwege zijn strikt anaërobe aard, wordt isolatie en identificatie van C. novyi type B zelden bereikt.Om deze reden, zijn de rapporten van INH gewoonlijk beperkt tot veronderstelde diagnosis gebaseerd op histopathologie, fluorescente antilichaamtest (vet), en/orimmunohistochemie (IHC). Het type C. novyi is zeldzaam. Hierin presenteren we een bevestigd geval van paardeninh veroorzaakt door C.novyi type B, en bekijk ook de literatuur over de ziekte.

bij de San Bernardinobranch van het California Animal Health and Food Safety Laboratory System werd een 14-jarige ruin van 511 kg bay Quarter paarden ingediend voor postmortemonderzoek en diagnostisch onderzoek. Het dier had een 3-d geschiedenis vanprogressieve neurologische symptomen, rectale temperatuur van 38,8-40,5°C, en was tevergeefs met niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen, voorafgaand aan de dood.Een volledige autopsie werd uitgevoerd ~6 uur na de dood.

bij de autopsie was het paard in goede voedingsconditie, met voldoende vetreserves en in matige staat van postmortem ontbinding. Er was geelverkleuring van de sclera, onderhuids en vetweefsel, en articularkraakbeen. Multifocale ecchymotische-tot-suffusieve bloedingen waren aanwezig in de meeste spieren, serosa van het darmkanaal, mesenterium, milt, pleura en inpapillaire spieren van het hart. Veneus bloed was diep rood-zwart. De pericardialsac werd opgezwollen met een grote hoeveelheid serosanguineous vloeistof, en er waren ~5L van een soortgelijke vloeistof met overvloedige fibrinestrengen in de buikholte.De lever was duidelijk vergroot en had afgeronde randen; de linkerkwab was stevig, donkerrood tot zwart, en had talrijke subcapsulaire en diepe parenchymale gasbellen en overvloedige fibrine over de capsule (Fig. 1 bis). Op gesneden gedeelte van deze kwab, was er een ~ 15 cm diameter, bleek gebied omgeven door een dunne hemorragische rand (Fig. 1 ter). De hersenvliezen boven de hersenen en het ruggenmerg waren diffuus verstopt, en er warenpetechiale bloedingen in de hersenschors. In de rest van het karkas zijn geen andere significante grosslesions waargenomen.

monsters van hersenen, longen, hart, middenrif, lever, milt, maag,darm, pancreas, bijnier, mesenterium, nier en urineblaas werden verzameld en gefixeerd in 10% gebufferde formaline (pH 7,2) gedurende 48 uur en routinematig verwerkt voor de productie van 4 µm dikke hematoxyline en eosine (h&E) bevlekte secties. Leverand nier secties werden ook gekleurd met Gramkleuren en Okajima vlekken,respectievelijk.

monsters van de lever werden aseptisch verzameld en gedurende 48 uur aan aërobe en anaerobiccultuur onderworpen op 5% schaapagarplaten. PCR werd uitgevoerd voor West-Nijlvirus (WNV) op gepoolde monsters van het centrale zenuwstelsel en voor equid herpesvirus 1 (EHV-1)op een neusdoekje. Een zwaar metalen scherm met inbegrip van lood, mangaan, ijzer,kwik, arseen, molybdeen, zink, koper, en cadmium werd uitgevoerd op levermonsters.Cerebrospinale vloeistof werd getest op antilichamen tegen Sarcocystisneurona met behulp van een indirect vet. Leveruitstrijkjes werden verwerkt door FATfor Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium sordelli en C. novyi met behulp van commerciële conjugaten (VMRD, Pullman, WA). Bovendien werden met formaline gefixeerde, paraffine ingebedde delen van de lever verwerkt door een indirecte immunoperoxidasetechnique voor C. novyi, met behulp van een commerciële kit (RTU VECTASTAINElite ABC-systeem, Vector Laboratories, Burlingame, CA). De endogene peroxidaseactiviteit werd gedoofd met een waterstofperoxideoplossing van 3%, gevolgd door een Peps-behandeling voor het ophalen van antigeen. De monsters werden vervolgens geïncubeerd met BackgroundPunisher (Biocare Medical, Concord, CA) om niet–specifieke binding te blokkeren, voordat ze werden geïncubeerd met anti-C. novyi polyclonal antilichaam (VMRD) van geiten bij 37°C gedurende 60 minuten. Vector NovaRED chromogeen werd gebruikt voor visualisatie (Vectorlaboratoria). Delen van de lever geïncubeerd met normale geit serum in plaats van primaire antilichamen werden gebruikt als negatieve controle. Lever van een koe waarin C. novyi was geïdentificeerd door cultuur, en PCR werd gebruikt als een positieve controle.

levermonsters werden verwerkt voor DNA-extractie (QIAamp DNA FFPE tissue kit, Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Het geëxtraheerde DNA werd gebruikt als sjabloon voor een multiplex PCR-analyse om segmenten van de flagellingenes (fliC) van C. septicum, C. novyi type A, C. te versterken novyi type B, C. chauvoei, en Clostridium haemolyticum, zoals eerder beschreven.17 bovendien, ontwikkelden wij een conventionele PCR om een segment van theC te versterken. novyi type B Alfa toxine (tcna) gen (GenBank toetreding JENV01000127. 1), de belangrijkste virulentie factor van dit micro-organisme. De volgende oligonucleotideopeenvolgingen werden ontworpen: 5 ‘- TGATGTTGACCATCCTTGCTCTCT-3′(CNtBaF) en 5’-CCTTATGCAAAGGGGGCG-3 ‘ (CNtBaR),die een ~342-BP DNA-fragment van het doelgen versterken. Conventionele PCR werd uitgevoerd in een totaal volume van 25 µL met 5 µL geëxtraheerd DNA, 0.25 µL van elke primer (10 µM), 7 µL nucleasevrij water en 12,5 µL PCR-MasterMix(2X, Promega, Madison, WI), die Taq DNA-polymerase (pH 8,5, 50 U/mL), dNTPs(400 µM) en MgCl2 (3 mM) bevat. De thermocyclerprofielen waren als volgt:94°C gedurende 5 min, 30 cycli van 94°C gedurende 1 min, 55°C gedurende 1 min en 72°C gedurende 1,5 min,gevolgd door een laatste verlengstap bij 72°C gedurende 7 min. De monsters werden gehouden bij 4 ° Cuntil de PCR reacties werden gevisualiseerd onder ultraviolet licht in ethidiumbromide (Amresco, Solon, OH)-gekleurde 1% agarose gels (Agarose SFR, Amresco). Dnaextract van C. novyi type B (ATCC 25758), C. novyi type A, C. septicum, C. chauvoei en C. haemolyticum culturen werden gebruikt als positieve controles. Water in plaats van DNA werd gebruikt in negatieve controleacties.

microscopisch was de levercapsule bedekt met overvloedig fibrine gemengd met celldebris, en er waren subcapsulaire en diep parenchymale emfysemateuze bullae van verschillende grootte. De meest opvallende vondst was multifocale tot focaal extensieve coagulatieve necrose, omgeven door een rand van grote aantallen levensvatbare en gedegenereerde neutrofielen, bloeding, fibrine, celpuin, en grote aggregaten van Gram-positieve bacteriële staven, waarvan sommige subterminale sporen hadden (Fig. 1C,, D).D). Bij het interveniërende ouderschap en in de minder aangetaste lever was er galstase, multifocale hemorragen en segmentale tot diffuse fibrinoïde necrose van bloedvaten, waarvan vele ook fibrinetrombi bevatten. Het renale tubulaire epitheel had mildcytoplasmische vacuolatie, en eiwit en korrelige afgietsels waren aanwezig in het lumenof niertubuli. De afgietsels bevlekt positief met Okaiima stip (vijg. 1E). In de hersenen was er diffuse congestie,multifocale en willekeurig verspreide perivascularhemorrhages, en matige tot duidelijke expansie van Virchow-Robin ruimte met zuurstoffiel oedeem. Het viscerale peritoneum was bedekt met overvloedig fibrine vermengd met grote aantallen levensvatbare en gedegenereerde neutrofielen; de meeste peritoneale bloedlichaampjes waren verstopt en/of bevatten fibrine trombi. Een paar kleine slagaders andveins in de cortex en medulla van de bijnier hadden ook fibrine trombi. Thespleen had vasculaire congestie en multifocale parenchymale en capsulaire hemorragen. De longen waren diffuus verstopt en hadden multifocale bloedingen en oedeem, naast enkele bloedvaten die fibrine trombi bevatten. Multiplesubendocardiale, subepicardiale en subpleurale bloedingen werden gezien.

de grote meerderheid van de in de lever waargenomen intralesionale gram-positieve staafjes was positief voor C. novyi IHC (Fig. 1F). Vet was positief voor C.novyi, maar negatief voor de andere clostridiale soorten getest. Levermonsters waren positief voor C. novyi type B Flic en TcnA genen, en negatief voor de fliC genenvan de andere geteste clostridia (Fig. 2). Monsters van cerebrospinale vloeistof waren negatief voor S. neurona immunofluorescent antilichaam assay. PCR voor WNV en EHV-1 was negatief. Er werd geen significante bacteriegroei bereikt door aërobe of anaerobiccultuur. Het scherm met zware metalen onthulde een verhoogde concentratie ijzerinlivatiemonsters (1.500 ppm; referentie-interval: 100-300 ppm).

we maakten een vermoedelijke diagnose van INH op basis van grove en microscopische veranderingen, in combinatie met de resultaten van vet en IHC voor C. novyi. De diagnostiek van INH geproduceerd door C. novyi type B werd bevestigd door PCR-detectie van de fliC-en TcnA-genen van dit micro-organisme. Voor zover wij weten, zijn slechts 6 gevallen van vermoedelijke IHN gemeld bij paarden. Drie gevallen deden zich voor in Australië,8,9,11 en één in Nieuw-Zeeland, 23 Schotland, 19 en de Verenigde Staten (Montana).16 in die gevallen was een vermoedelijke diagnose gebaseerd op grove en microscopische afwijkingen in combinatie met detectie van C. novyi door vet,9,16,19 IHC,23 en/of kweek.9,19 in geen van deze gevallen werd echter bepaald welk type C. novyiin betrokken was.

C. novyi is een grampositieve, sporenvormende, anaerobe bacil, die vaak voorkomt in bodem en uitwerpselen van dieren.15 Het is ingedeeld in types A, B, en C op basis van het bereik van toxines geproduceerd.4 quater. novyi type A produceert voornamelijk het dodelijke, oedeem-inducerende alfatoxine (TcnA) en het niet-dodelijke fosfolipase, gammatoxine; deze bacterie wordt geassocieerd met gasgangreen van mens en dier, dat gewoonlijk samen met andere clostridia werkt. C. novyi type B produceert ook TcnA, in aanvulling op de necrotiserende en hemolytische beta toxine, hoewel de eerste wordt beschouwd als de meest belangrijke virulentie factor voor de pathogenese van INH. C. novyi type C wordt als niet-toxigeen en niet-pathogeen beschouwd.13,15 C. haemolyticum was voorheen bekend als C. novyitype D, en het wordt nog steeds genoemd door deze naam door sommige auteurs; daarom, we ook bespreken dit micro-organisme hier. C. haemolyticum produceert ook bètatoxine, maar in veel grotere hoeveelheden dan C. novyitype B; deze toxine wordt beschouwd als de belangrijkste virulentiefactor van dit micro-organisme en is verantwoordelijk voor bacillaire hemoglobinurie (BH), een ziekte die voornamelijk runderen treft en klinisch en pathologisch sterk lijkt op INH.11,10,14

de sporen van C. novyi zijn zeer resistent tegen omgevingsomstandigheden en, aangezien de sporen vaak in de bodem worden gevonden, kunnen grazende dieren ze vaak innemen.6,19 hoewel niet volledig bewezen,het huidige dogma is dat, na inname, de sporen van C. novyi type B worden geabsorbeerd uitde darm en bereiken de lever via de portale circulatie, waarna ze wordenrepread naar andere organen. De sporen zijn gefagocytiseerd en blijven latent in Kupffercells van de lever, en in macrofagen van de milt en het beenmerg.2,6 INH is vaak beschouwd als de tegenhanger van BH, omdat beide ziekten wordengeliefd om voor te komen na leverbeschadiging, waardoor necrose en de bijbehorende anaërobe voorwaarden die nodig zijn voor het ontkiemen van latente sporen en de productie van toxines.Migratie van onrijpe vormen van Fasciola hepatica door de lever wordt beschouwd als de belangrijkste predisponerende factor voor zowel BH als INHin herkauwers, en beide ziekten komen vaker voor in gebieden met een hoge prevalentie van fascioliasis.1 INH van herkauwers is ook in verband gebracht met Cysticercustenuicollis en andere parasieten, waaronder Fascioloidesmagna, Dicrocoelium dendriticum en thysanosoma actinoides, 2,6,15,21,hoewel de rol van deze parasieten in de pathogenese van de ziekte niet is aangetoond.Leverbeschadiging die leidt tot het ontstaan van anaërobe aandoeningen kan echter een verwijderingsfactor voor INH zijn. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, leverabsesses, biopten, vette verandering, telangiectasia, en giftige stoffen. Zodra TcnA wordt geproduceerd en vrijgegeven door de vegetatieve vormen van C. novyi type B, zijn monoglycosyltransferase activiteit inactiveert verscheidene guanosine 5 ‘ – trifosfaat (GTP)-bindende eiwitten in cellen van de gastheer, resulterend inalteratie en herverdeling van het actine cytoskelet.3 TcnA verstoort ook het vimentin-en tubulinesysteem.7,18 deze veranderingen lijken dramatischer te zijn in capillair endotheel, wat leidt tot de wijdverspreide vloeistofextravasatie gezien in INH15 en waarschijnlijk de multisystemische trombose waargenomen bij het paard van ons rapport. Bij schapen, de zeer acute aard van de ziekte maakt de detectie vanklinische tekenen moeilijk, met dieren meestal dood gevonden. In gevallen waarin tekens worden waargenomen, zijn ze niet-specifiek, en omvatten zwakte, lethargie,anorexia, hyperthermie, tachypneu, hyperpneu, en tenslotte ligfiets. Clinicopathologicchanges kunnen neutrofilia met een linker shift, azotemia, metabole acidose,en verhoogde lever en spierenzymactiviteiten omvatten.15,19

aangezien slechts 6 gevallen van vermoedelijke INH eerder zijn beschreven bij paarden,is de beschikbare epidemiologische, klinische en pathologische informatie schaars. Op basis van dit beperkte aantal gevallen is er geen duidelijke aanleg voor geslacht of ras in gevallen van paarden INH, en zowel jonge als volwassen dieren kunnen worden beïnvloed. Het klinische verloop is meestal langer bij paarden dan bij herkauwers, en duurt 12-72 uur,en het resultaat is altijd fataal geweest. De klinische symptomen variëren van lichte tot ernstige depressie en terughoudendheid om te bewegen, neurologische symptomen waaronder ataxie en hoofdtilt, hyperemische en/of icterische slijmvliezen en oculaire sclera, buikpijn en ligfasen.20,23 in één geval waarin abdominocentese werd uitgevoerd,werd een verhoogde hoeveelheid troebele vloeistof met verhoogde eiwitconcentratie en Specifieke zwaartekracht verkregen.9

Clinicopathologische profielen van paarden met INH zijn zeer variabel en kunnen verschillende stadia van toxemie en leverbeschadiging vertegenwoordigen. Deze veranderingen kunnen bestaan uit neutrofilia met een linkse verschuiving, verhoogde leverenzymen activiteit,trombocytopenie, hyperfibrinogenemie, hyperbilirubinemie, en verminderde concentratie van elektrolyten.9,16,19 daarnaast zijn toegenomen actieve partiële tromboplastine, protrombine en trombine tijden gemeld.Deze veranderingen, in combinatie met de waargenomen capillaire microtrombi, zijn gericht op gedissemineerde intravasculaire stolling, een proces dat waarschijnlijk optreedt tijdens het verloop van toxemie en hemolyse bij grote dieren.22,23 de resulterende consumptie van stollingsfactoren, hun verminderde synthese als gevolg van hepatische mislukking, en de synergetische werking van TcnA op vasculair endotheel zijn vermoedelijk verantwoordelijk voor de wijdverspreide bloedingen waargenomen in gevallen van Inh.

hoewel icterus niet wordt beschreven bij herkauwers, kunnen paarden soms dit teken vertonen dat geassocieerd is met INH.19,23 Icterus lijkt te worden gerelateerd aan de ernst vanhepatische schade en, tot op zekere hoogte, aan hemolyse, zoals in ons geval, waarbijhemoglobine werd gevisualiseerd in de niertubuli door Okajima vlek. Het paard in onze studie had een matig verhoogde ijzerconcentratie in de lever, wat wees op een emolytisch proces.5 Dit niveau van ijzer in de lever is echter een veel voorkomende bevinding bij paardendying van een verscheidenheid van oorzaken en het wordt vaak beschouwd als een incidentele vinding geassocieerd met congestie en postmortem autolyse (auteurs’ niet-gepubliceerde observatie).

hoewel men kan veronderstellen dat paarden vatbaarder zijn dan andere species voor de werking van het hemolytische bètatoxine geproduceerd door C. novyitype B, zijn in veronderstelde gevallen vaninh geen hemoglobinurische veranderingen beschreven.16,23 vergeleken met C. haemolyticum produceert C. novyi type B lagere niveaus van bètatoxine;15 daarom wordt de bijdrage ervan aan de pathogenese van INH verondersteld te zijnminor, wat een zekere mate van hemolyse bij paarden veroorzaakt, maar niet genoeg om significante hemoglobinurie-gerelateerde veranderingen te veroorzaken. Bovendien sluit geen van de voorgaande gevallen de rol van C. haemolyticum als veroorzaker van de ziekte uit, zodat uit deze gevallen geen definitieve conclusies kunnen worden getrokken. C. hemolyticum is betrokken bij een geval van septische peritonitis in een merrie door identificatie met MALDI-TOF; in dat geval werd echter geen PCR-of toxineidentificatie geprobeerd.11

de predisponerende factor voor INH bij paarden is niet altijd vastgesteld, hoewel de hepatische migraties van F. hepatica en verwante trematodes, evenals leden van de familie Strongylidae, zijn gesuggereerd.9,12,19 bovendien is anthelminthische behandeling voorafgaand aan het instellen van klinische symptomen gesuggereerd als een potentiële trigger van de ziekte,9,16,23 vermoedelijk door het veroorzaken van een zekere mate van hepatische necrosis geassocieerd met de vernietiging van migrerende parasieten. Er is echter geen wetenschappelijk bewijs beschikbaar om deze hypothese te ondersteunen. Helaas werden in ons geval geen bekende factoren bepaald.

zoals in ons geval beschreven de meeste eerdere rapporten een enkele (meerdere in één case19) focus van necrose die de lever aantast, consistent gelokaliseerd in de linkerlobe. Dit contrasteert met INH van schapen waarin willekeurig verdeeld, smallnecrotic foci komen vaker voor.6,15 de reden hiervoor is niet bekend. Het is mogelijk dat het overwicht van wonden aan de linkerkwab gerelateerd is aan zogenaamde portaalstreaming, die verantwoordelijk is voor differentiële stroom van portaalbloed naar bepaalde kwabben van de lever. Omdat C. novyi vermoedelijk wordt geabsorbeerd uit de smallintestine, en het bloed van dit orgaan volgt portaal stromen naar de linkerlobe, dit kan resulteren in deze kwab wordt voornamelijk beïnvloed.De afwezigheid van veranderingen in verband met hepatische encefalopathie (bijv., Alzheimer type II astrocytose geassocieerd met hyperammonemia) 6 kan suggereren dat neurologische tekens in dit en vorige gevallen wareneconsequence van bloedingen, congestie,en perivasculair oedeem genoteerd in de hersenen, met betrekking tot toxemia en de actie van TcnA op het capillaire endotheel.

INH moet worden opgenomen in de lijst van differentiële diagnoses van paarden met neurologische klinische symptomen, toxemie, acuut leverfalen en peritonitis. Zelfs denkbehandeling met hoge doses penicilline en tetracyclines kan effectief zijn tegen c. nieuw, de geavanceerde productie van toxines resulteert meestal in een slechte prognose.19 in gebieden waar de ziekte duidelijk geassocieerd is met leverbot en/of andere parasieten, kan als preventieve maatregel worden geprobeerd de parasitaire belasting te verminderen en de toegang van dieren tot slecht gedraineerde weiden te beperken.15

aangezien wordt aangenomen dat verscheidene clostridiale ziekten in verband worden gebracht met versnelde ontbinding na het overlijden, is een belangrijke overweging voor de juiste diagnose van Inh de noodzaak van snelle evaluatie en bewaring van weefsels na de dood van het dier.623 klinische voorgeschiedenis, routinematige autopsie,histopathologie en immunokleuring van C. novyi in leverlaesies zijn essentieel om een vermoedelijke diagnose van INH te kunnen stellen. Omdat isolatie niet altijd succesvol is, gezien de strikte anaërobe vereisten van het micro-organisme,is moleculaire identificatie door PCR een waardevol hulpmiddel om een etiologicdiagnose te verstrekken en C. novyi type B te onderscheiden van andere clostridiale pathogenen.