Arabidopsis cmt3 chromomethylase mutaties blok non-CG-methylatie in-en uitschakeling van een endogene gen | Jiotower

Resultaten en Discussie

identificeren van factoren die van controle-methylatie in-en uitschakeling van de WS PAI genen, identificeerden we een gemuteerde variant van WS, pai1C251Y, waarin het spreekverbod van de gemethyleerde singlet PAI2 gen kan worden gevisualiseerd door de intensiteit van een blauwe tl-plant fenotype onder ultra-violet (UV) licht (Bartee en Bender 2001). In de pai1c251y-stam zijn de enige potentiële bronnen van Pai-enzymactiviteit het pai1-gen, dat wordt verlamd door een missense-mutatie, en het pai2-gen, dat tot zwijgen wordt gebracht. Vanwege deze Pai-deficiëntie, accumuleert de stam fluorescerende tryptofaan weg tussenproducten, evenals het tonen van geel-groene bladpigmentatie, verminderde grootte, verhoogde bushiness, en verminderde vruchtbaarheid. Echter, tweede-site mutaties die pai2 silencing verlichten zullen de Pai-deficiënte fenotypen onderdrukken (Bartee and Bender 2001). Zo mutageniseerden we de pai1c251y stam en screenden we op zaailingen met onderdrukte zwakke fluorescerende fenotypen. Als secundair scherm, testten we Pai methylation door Southern blot analyse met methylation-sensitive restriction enzymen. Specifiek, analyseerden wij methylation met isoschizomers HpaII en MspI, die de opeenvolging 5′-CCGG-3’erkennen. HpaII is gevoelig voor methylation van zowel de binnencytosines (CG) als de buitencytosines (CNG), terwijl MspI slechts gevoelig is voor methylation van de buitencytosines. Deze enzymen splitsen eenmaal in elke ws PAI locus en onthullen zowel de dichtheid als het patroon van methylation voor elk gen (Bender en Fink 1995; Luff et al. 1999; Melquist et al. 1999).

op basis van deze screeningsstrategie hebben we 11 functieverlies-allelen in het CMT3-gen geà soleerd (zie hieronder en materialen en methoden). De cmt3-mutanten in de pai1c251y-achtergrond vertoonden een sterk verminderde fluorescentie in de vroege zaailingontwikkeling en gedeeltelijk verminderde fluorescentie in volwassen planten, met een grotere omvang, verminderde struikachtigheid en verhoogde vruchtbaarheid (Fig. (Fig.1).1). Deze intermediaire fluorescente cmt3-isolaten keerden niet terug naar nonfluorescentie, wat kenmerkend is voor verlies van resterende pai2 methylering (Bender en Fink 1995), met een detecteerbare frequentie. Zij vertoonden gedeeltelijk verhoogde splitsing met HpaII en sterk verhoogde splitsing met MspI voor de Pai genen ten opzichte van parental pai1C251Y (Fig. (Fig.2 bis).2 bis). Het splitsingspatroon suggereerde dat de cmt3 mutanten het meest werden beïnvloed in het behoud van CNG methylatie van de Pai genen. Om te bepalen of de cmt3-mutanten ook de methylering van een zeer herhaalde genomische sequentie beïnvloedden, hebben we de Zuidelijke vlek van Hpaii/MspI met een sonde naar de 180-bp centromeer-geassocieerde repeat (CEN) sequenties (Vongs et al. 1993). Deze sonde toonde weinig effect op hpaii splitsing, maar verhoogde mspi splitsing, in overeenstemming met het patroon waargenomen voor de Pai genen (Fig. (Fig.2B).2B). Een vergelijkbaar patroon van verhoogde mspi-splitsing werd ook waargenomen bij de herhaalde rDNA (gegevens niet getoond). Alle geteste 11 cmt3-allelen hadden identieke methylatiepatronen in deze analyses. Bovendien, wanneer de cmt3 allelen werden gescheiden van de pai1c251y allel in een wild-type WS achtergrond, ze ook identieke methylation patronen in deze assays (Fig. (Fig.2).2). De Pai-en CEN-methylatiepatronen waren verschillend van de patronen die werden veroorzaakt door de gekarakteriseerde ddm1-en met1-methylatiedeficiënte mutaties (Fig. (Fig.2; 2; Bartee and Bender 2001).

om methylatiepatronen in de cmt3-mutantachtergrond nauwkeuriger te bepalen, hebben we genomische sequencing van methylatiepatronen in de pai1-en PAI2-promotorregio ‘ s van een representatief cmt3-allel uitgevoerd met behulp van natriumbisulfietmutagenese (Frommer et al. 1992). Uit deze analyse bleek dat het merendeel van de geméthyleerde cytosinen (87% bij PAI1 en 70% bij PAI2) voorkwam bij CG-residuen (Fig. (Fig.3; 3; Tabel Tabel 1).1). Vergeleken met de wild-type WS PAI1 promotor (Luff et al. 1999; tabel Table1),1), CG methylation was reduced 34%, CNG methylation was elimined, en asymmetrische methylation was reduced 93%; in de pai2 promotor, CG methylation was reduced 8%, CNG methylation was reduced 92%, en non-CG methylation was reduced 75%. Aldus, heeft het verlies van CMT3 functie een sterk effect op het behoud van CNG en asymmetrische methylation en een zwakker effect op het behoud van CG methylation. Deze resultaten komen overeen met rapporten dat Arabidopsis CMT3 en mais ZMET2 belangrijk zijn voor het behoud van CNG methylering op verschillende genomische locaties (Lindroth et al. 2001; Papa et al. 2001), maar zij tonen verder aan dat CMT3 ook belangrijk is voor het behoud van asymmetrische methylering voor de PAI genen. Dit resultaat houdt in dat CMT3 zowel symmetrische als asymmetrische methylering rechtstreeks controleert of dat de vermindering van symmetrische methylering in de mutante achtergrond van cmt3 een verminderde asymmetrische methylering als secundair gevolg veroorzaakt. Omdat de geméthyleerde opeenvolgingen in de promotor en eerste exon van het pai2 verslaggeversgen (370 370 bp) slechts 16 verspreide CG-motieven bevatten, hypomethyleert het verlies van niet-CG methylatie beduidend dit gebied van het gen (Fig. (Fig.3), 3), rekening houdend met verbeterde pai2 expressie in de suppressor mutant.

de cmt3 mutant locus in de pai1c251y cmt3 suppressor isolaten werd in kaart gebracht door kruisingen met de polymorfe stam Nd-0, die een soortgelijke regeling van dicht gemethyleerde Pai genen zoals gevonden in WS (Melquist et al. 1999). F2-nakomelingen met zwak fluorescerende fenotypen die voor zowel pai1C251Y als cmt3 een diagnose van homozygositeit stellen, werden geïdentificeerd door visuele inspectie onder UV-licht en bevestigd door Mspi Southern blot voor een sterke Pai-splitsing die vergelijkbaar is met die waargenomen in de isolaten van de suppressor van de ouders. Een mapping populatie van F2 planten die aan deze criteria voldeed werd vervolgens gebruikt om te scoren voor genomische loci gekoppeld aan het onderdrukte fenotype. De in kaart brengen analyse onthulde linkage aan één enkele locus op de onderarm van chromosoom 1. Omdat het CMT3-vermeende cytosine methyltransferase-gen zich op deze locus richt, hebben we ons als kandidaat op dit gen gericht. Binnen elke populatie vonden we een volledige link met een polymorfe marker die binnen 100 kb van het CMT3-gen ligt. Om te bevestigen dat het CMT3 gen in feite de plaats was van de methylation suppressor mutaties, hebben we het gen gekloond en gesequenced van de 11 mutante isolaten. Het rangschikken onthulde een enkele basisverandering in de CMT3 codeeropeenvolging in elk isolaat. Drie van de mutante allelen beà nvloedden absoluut behouden aminozuren in het methyltransferasekatalytische domein, met inbegrip van het representatieve cmt3g456d-allel dat Voor bisulfiet het rangschikken wordt gebruikt. Een ander allel werd voorspeld om het eiwit voortijdig te beëindigen. Twee allelen creëerden splice junction mutaties. De overige vijf allelen beà nvloedden aminozuren tussen methyltransferase motief IV en het c Eindpunt van het eiwit dat in hoge mate bewaard wordt onder de CMT genen (Fig. (Fig.4).4).

om verder te bevestigen dat het CMT3 gen de mutant locus was, transformeerden we de pai1c251y cmt3 isolaten met een wild-type WS genomische kloon van het CMT3 gen. Transformant zaailingen waren sterk fluorescerend, vergelijkbaar met die van de pai1c251y stam (Fig. (Fig.1).1). Transformantlijnen die door Southern blot-analyse in de T2-generatie werden geanalyseerd, toonden remethylering van het pai2-gen aan tot de niveaus die in de oorspronkelijke pai1c251y-stam werden waargenomen (gegevens niet getoond). Aldus, kon het gekloonde gen CMT3 de mutant methylationdefecten aanvullen. Als een controle, de representatieve pai1C251Y cmt3G456D mutant werd ook getransformeerd met een wild-type WS genomische kloon van het CMT2 gen. CMT2 transformant zaailingen waren zwak fluorescerend, vergelijkbaar met die van de niet-getransformeerde ouderstam (Fig. (Fig.1), 1), en vertoonde geen detecteerbare remethylering van PAI2. Deze analyse toont aan dat CMT2 de CMT3-functie niet kan vervangen. In dit verband is het interessant op te merken dat CMT2 voornamelijk in zijn n-terminale sequentie verschilt van CMT3 (Fig. (Fig.44).

kenmerkte voorheen methylation-deficiënte Arabidopsis stammen met defecten in ofwel het SWI2 / SNF2 chromatine remodelerende factor-gerelateerde gen ddm1 (Jeddeloh et al. 1999) of het dnmt1-gerelateerde met1 cytosine methyltransferase gen vertonen progressieve ontwikkelingsafwijkingen (Finnegan et al. 1996; Kakutani et al. 1996; Ronemus et al. 1996). Onze voorlopige analyse van zes-generatie-inteelt pai1C251Y cmt3 en twee-generatie-inteelt cmt3 stammen onthulde geen duidelijke segregatie van morfologische veranderingen. Dit verschil tussen cmt3 en andere mutanten met een methylatiedeficiëntie is waarschijnlijk een weerspiegeling van het feit dat CG-methylering in cmt3 in hogere mate behouden blijft dan in ddm1 of met1 (Fig. (Fig.2; 2; Bartee and Bender 2001). Omdat veel van de endogene geméthyleerde plaatsen in het Arabidopsis genoom, zoals de CEN herhaalt (Fig. (Fig.2; 2; Vongs et al. 1993; Lindroth et al. 2001), en de promotor van het FWA homeo-domein gen (Soppe et al. 2000; Lindroth et al. 2001), dragen voornamelijk CG methylatie, cmt3 mutaties zouden naar verwachting geen sterke invloed hebben op deze loci. In plaats daarvan, doet CMT3 hoogstwaarschijnlijk dienst als versterkende methylase die een extra laag methylation aan bepaalde genomic gebieden zoals de genen Pai toevoegt, waarin de verhoogde methylationdichtheid tot het verhoogde tot zwijgen brengen leidt. Een specifiek model is dat de basale laag van CG methylation die door andere functies zoals MET1 wordt verstrekt als gids voor CMT3 zou kunnen dienen, die dan de basale laag met extra CG en niet-CG methylation zou verfraaien. De rekrutering van CMT3 aan gerichte gebieden kon chromatin eiwitinteractie met het chromodomainmotief (Henikoff en comai 1998), samen met interactie impliceren die door de unieke N-eindopeenvolgingen wordt bemiddeld.

omdat schimmels zoals Neurospora crassa en Ascobolus immersus niet-CG methylering kunnen handhaven (Selker et al. 1993; Goyon et al. 1994), zouden deze organismen CMT genen kunnen coderen. Omgekeerd, omdat dieren zoals mensen en muizen niet-CG methylation missen, worden deze organismen voorspeld om CMT genen te missen, zoals het geval is van analyses van huidige opeenvolgingsdatabases. Het duidelijke gebrek aan CMT-achtige methylasen in dierlijke genomen (Finnegan en Kovac 2000) suggereert dat dieren alternatieve mechanismen hebben ontwikkeld voor het versterken van chromatinestaten.