Prevalentie en Mogelijke Mechanismen van Colistine Weerstand Onder de Multidrug-Resistente en Extensief Resistente Pseudomonas aeruginosa

Inleiding

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is een opportunistische pathogenen, vaak gevonden in de omgeving, zoals bodem, water, planten en ziekenhuis omgeving, met bekende intrinsieke resistentie tegen vele antibiotica en de mogelijkheid om de oorzaak van levensbedreigende infecties. Het wordt beschouwd als de tweede veel voorkomende oorzaak van sepsis in intensive care units (ICU ‘ s) en kan leiden tot ventilator-geassocieerde pneumonie, wondinfecties en urineweginfecties (UTI). Veel studies meldden de toename van mortaliteit en morbiditeit van infecties geassocieerd met P. aeruginosa, in het bijzonder die met multi-drug resistentiepatronen.1-3

het ontstaan van multiresistente (MDR) of extensief resistente (XDR) of pandrugresistente (PDR) P. aeruginosa wordt een belangrijk volksgezondheidsprobleem dat kan leiden tot vertraagde antimicrobiële therapie of het falen ervan en de toename van het sterftecijfer vooral met het verschijnen van carbapenem-resistente P. aeruginosa. Er is dus aandacht nodig omdat deze resistente stammen resistent kunnen zijn tegen alle beschikbare antimicrobiële stoffen of alleen gevoelig zijn voor toxische stoffen zoals colistine of polymyxinen, waardoor het gezondheidszorgteam geen keuze heeft bij de behandeling van ernstige infecties geassocieerd met MDR P. Aeruginosa.4

onlangs werd resistentie tegen polymyxinen waargenomen bij bepaalde soorten Enterobacteriaceae, zoals K. pneumoniae, E. coli, Enterobacter aerogenes en Enterobacter cloacae vanwege het brede gebruik ervan voor de bestrijding van infecties in de diergeneeskunde. Colistineresistentie is een belangrijke uitdaging geworden voor de behandeling van levensbedreigende infecties, vooral met de coëxistentie van mcr-1 genen met andere meervoudige resistentiegenen zoals ESBL, MBL, NDM genen met de mogelijkheid van het ontstaan van Pan-drugresistentie.5,6

colistine, bekend als polymyxine E, is een lid van een familie van kationische polypeptide bekend als polymyxinen. Deze antibiotische familie wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van een lipofiele vette acyl zijketen. Tegenwoordig wordt colistin opnieuw geïntroduceerd in de medische therapie en wordt het beschouwd als het laatste redmiddel voor de behandeling van ernstige infecties veroorzaakt door MDR-en XDR-vlekken. In het algemeen, hangt de actie van polymyxins op bacteriën hoofdzakelijk van de elektrostatische interactie tussen positief geladen antibioticum en negatief geladen fosfaatgroep van lipide a gelokaliseerd op het buitenmembraan na zijn band af, verspreidt het door het buitenmembraan, periplasmic ruimte en interactie met het binnenmembraan. Polymyxinen veroorzaken destabilisatie aan het buitenmembraan, porievorming, verhoging van de permeabiliteit, lekkage aan cytoplasmic inhoud gevolgd door cellysis.7

Colistineresistentie treedt voornamelijk op als gevolg van de chemische modificatie door de enzymatische toevoeging van fosfoethanolamine aan de 4 phosphate – fosfaatgroep van het lipide een deel van het lipopolysaccharide dat de netto-negatieve lading van het buitenmembraan vermindert, wat resulteert in een afname van de polymyxine-affiniteit. Resistentie tegen colistine kan het gevolg zijn van chromosomaal gecodeerde mutatie zoals gerapporteerd in K. pneumoniae of de horizontale overdracht van resistentie door middel van een plasmide dragend colistineresistent gen (mcr-1).8-11

de opkomst van colistineresistentie in verschillende landen in Azië, Europa en sommige landen in Afrika is een van de wereldwijde zorgen geworden. Zoals, de verspreiding van de colistinresistentie zijn capaciteit aangeeft om horizontaal door conjugatieve plasmiden of verticaal door chromosomale verandering over te brengen.12,13 ook, zijnde colistin een van de laatste lijnen van behandelingen voor ernstige infecties, waardoor de opkomst van colistin resistentie isolaten die de wereld bedreigen door het verschijnen van onbehandelbare infectieziekten.14 detectie van colistine resistentie in Egypte, dat is een land bekend door zijn hoge belasting van infectieziekten en de aanwezigheid van lage of geen beperking op het antimicrobiële gebruik in zowel diergeneeskunde en geneeskunde, wat wijst op de opkomst van onbehandelbare ziekten in ons gebied als gevolg van de mogelijkheid van overdracht colistine resistentie tegen zeer resistente bacteriën.15

in deze studie onderzoeken we de prevalentie van colistineresistentie onder MDR en XDR P. aeruginosa geïsoleerd van patiënten die lijden aan een verscheidenheid van infecties in de intensive care unit (ICU) van Minia university hospital in Egypte.

materialen en methoden

verzameling van isolaten

honderdvijfenzeventig klinische monsters van verschillende besmettingsbronnen werden verzameld bij patiënten die in het Minia university Hospital, Minia, Egypte op de intensive care werden opgenomen als onderdeel van routine ziekenhuis-laboratoriumprocedures. Alle klinische monsters werden gekweekt op trypticase soja agar (Lab M, UK) bij 37°C en 42°C gedurende 24 uur. Een kolonie werd gesubcultureerd op MacConkey agar platen en cetrimide agar. Geïsoleerde kolonies werden verder geïdentificeerd aan de hand van koloniemorfologie, lactose-fermentatie, biochemische reacties (waaronder sulfide-indool motiliteit, catalase, triple sugar ijzer, urease en oxidase testen), vermogen om te groeien op cetrimide agar en om te groeien bij 42°C. 16 P. aeruginosa kolonies werden gezuiverd door strepen, en zuivere kolonies werden opgeslagen bij 4°C.

Antibioticagevoeligheidstesten

Antibioticagevoeligheid volgens de Kirby-Bauer Disc Diffusion methode

de antibioticagevoeligheid tegen verschillende klassen antibiotica werd getest met de Kirby-Bauer disc diffusion methode.17 Antibioticum schijven gebruikt werden amoxicillin/clavulanic (AMC) (20/10 µg), ampicilline/sulbactam (SAM) (20 µg), meropenem (MEM) (10 µg), imipenem (IPM) (10 µg), cefepime (JAN) (30 µg), cefoperazone (CEP) (75 µg), polymyxine B (PB) (300 mg), ciprofloxacine (CIP) (5 µg), levofloxacine (LEV) (5 µg), gentamicine (CN) (10µg), ceftazidime (CAZ) (30 µg), tigecycline (TGC) (15 g), amikacin (AK) (30 µg), tobramycine (CF) (10 µg), aztreonam (ATM) (30 µg), piperacillin (PRL) (30 µg), carbenicillin (AUTO) (100 µg) (Oxoid; Basingstoke, verenigd koninkrijk). Isolaten werden geclassificeerd als gevoelig, intermediair en resistent volgens inhibition zones’ interpretation standards of Clinical Laboratory standards Institute (CLSI) 2018.18

Mic bepaling van colistine antibioticum

agarverdunningsmethode op Muller-Hinton agar werd gebruikt om de colistine minimum inhibitory concentration te bepalen.Resistentie tegen colistine werd overwogen als de MIC ≥4µg/mL is volgens de standaardrichtlijnen van CLSI.18

volgens de resultaten van gevoeligheid voor antibiotica werden isolaten geclassificeerd als MDR, XDR en PDR volgens de eerder gerapporteerde criteria.20

gecombineerde Schijfdiffusietest (CDT)

alle colistineresistente isolaten (MIC ≥4) werden getest met 100 mM EDTA (Sigma-Aldrich; St.268 Louis, MO, USA) om de mcr-1-activiteit te remmen, aangezien deze concentratie geen antimicrobiële activiteit vertoonde. De bacteriestammen werden gekweekt op Muller-Hinton agar (Lab M, UK) waarop drie schijven werden gebruikt. Eén schijf was verzadigd met 10 µL 100 mM EDTA om ervoor te zorgen dat er geen remming van de bacteriegroei door de gebruikte concentratie EDTA was. De andere twee schijven waren 10µg colistine disc en 10 µg colistine plus 10 µL 100 mM EDTA disc. De isolaten werden waargenomen voor een toename van ≥3 mm in de inhibitiezone diameter van de colistine / EDTA schijf in vergelijking met de colistine schijf.21

verandering van Zeta Potential

de mcr genen coderen fosfoethanolamine transferases enzymen die enzymatisch een fosfoethanolamine (PEtN) deel hechten aan het lipide A van het buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, wat leidt tot een vermindering van de netto negatieve lading die colistineresistentie oplevert.22

de bacteriële cellen mogen groeien in aanwezigheid en afwezigheid van 80 µg/mL EDTA. Vervolgens werd de bacteriële suspensie gecentrifugeerd bij 5000 rpm gedurende 5 min bij 5°C vervolgens werden de pellets tweemaal gewassen, waarna de pellets werden gesuspendeerd in 2 mL steriele 1 mM NaCl-oplossing aangepast aan 0.5 McFarland standaardoplossing troebelheid. De monsters werden verdund tot 1: 4 gebruikend 1mm NaCl. Zeta potentiaal werd bepaald in 2 mL van het verdunde Monster. Veranderingen van het Zeta-potentieel geïnduceerd door EDTA werden berekend uit de Zeta-potentiaalverhouding (RZP=ZP+EDTA/ZP-EDTA), waarbij ZP+EDTA en ZP-EDTA overeenkomen met de Zeta-potentiaalwaarden verkregen voor bacteriesuspensies die worden gekweekt in aanwezigheid of afwezigheid van respectievelijk 80ΜG/mL EDTA. RZP van ≥ 2,5 waarde beschouwd als criteria voor de identificatie van mcr – 1 positieve stammen.21

DNA-extractie

het DNA-sjabloon werd geëxtraheerd uit een NACHTCULTUUR van P. aeruginosa, zoals eerder beschreven.23 een suspensie van bacteriële pellet werd gedurende 10 minuten gekookt en vervolgens gecentrifugeerd. Supernatant werd direct gebruikt in de PCR-test.

PCR-analyse van de geteste genen

exotoxine A is een belangrijke virulentiefactor (een cytotoxisch middel) van P. aeruginosa bij klinische infecties. Deze factor remt eiwitbiosynthese die tot grote weefsel en orgaanschade leiden. Het toxA gen, een inherente genetische sequentie op het P. aeruginosa chromosoom, wordt gebruikt voor P. aeruginosa bevestiging door PCR.

PCR werd uitgevoerd in een totaal volume van 25 µL met 1x PCR-buffer, 1 µmol/l van elke primer, 1 µL genomisch DNA (ongeveer 150 ng), 200 µmol/L dNTPs-mix, 2 mmol/l MgCl2 en 0,05 u/µL Taq DNA-polymerase. PCR-versterkingen werden uitgevoerd voor toxA FW: CTGCGCGGGTCTATGTGCC, RV: GATGCTGGACGGGTCGAG in een geautomatiseerde thermische cycler (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) onder de volgende omstandigheden: 30 cycli van 1 min bij 94°C, 1,5 min bij 63°C en 1 min bij 72°C. 24

de genen mcr – 1 en mcr-2 werden getest met conventionele PCR-techniek met behulp van de volgende primers: mcr-1 FW (5′-AGTCCGTTTGTTCTTGGGC-3′), RV (5′-AGATCCTTGGTCTCGGCTTG-3′) en mcr-2 Fw (5ʹ-ATGACATCACATCACTCTTGG-3ʹ), Rv (5ʹ-TACTGGATAAATGCCGCGC-3ʹ).De technische omstandigheden waren 34 cycli van 95°C gedurende 1 min, 58°C voor mcr-1 en 52°C gedurende 30s, 72°C gedurende 1 min, gevolgd door een definitieve verlenging van 72°C gedurende 5 minuten.

bepaling van remming van Effluxpompen door MiC-reductie met behulp van Effluxpompremmer (CCCP)

de agarverdunningsmethode werd gebruikt voor de bepaling van MICs met behulp van de voor Kationgebruik aangepaste Mueller-Hinton bouillon (Sigma-Aldrich, St Louis, USA). De MICs van CCCP (EPI) en colistine werden bepaald voor de geteste isolaten. Sub-MIC van CCCP werd gebruikt voor het bepalen van het effect op colistine MIC; de concentratie van CCCP (0,5× MIC) werd constant gehouden op de hierboven vermelde MIC concentraties, terwijl die van het antibioticum serieel werden verhoogd. De MICs van de isolaten tegen colistine in afwezigheid en aanwezigheid van CCCP werden bepaald met behulp van een submicrofoon van CCCP (eindconcentratie van 10 mg/L) zoals reeds beschreven.De resulterende mic-vouwveranderingen na toevoeging van CCCP werden berekend als de verhouding tussen het MIC-niveau van het CCCP-vrije antibioticum en dat van het CCCP-toegevoegde antibioticum. Zoals eerder beschreven door Osei Sekyere, meldde Amoako28, die meldde dat het positieve criterium voor de aanwezigheid van effluxpompen in isolaten een ≥8-voudige afname van colistine MIC was na toevoeging van CCCP.

buitenste Membraaneiwitpatroon

een enkele kolonie van de geteste P. aeruginosa-isolaten werd gedurende 2 dagen gekweekt in 5 mL lb-bouillon bij 37°C met schudden bij 200 tpm. Cellen werden gecentrifugeerd bij 8000 toeren per minuut gedurende 5 minuten. Bacteriële pellets werden gesuspendeerd in 1 mL lysis buffer (0,05 M Tris HCL, 2% SDS, 10% glycerol), verwarmd bij 95°C gedurende 10 minuten. Vervolgens werden de monsters gedurende 10.000 toeren per minuut gedurende 30 minuten gecentrifugeerd. Ongeveer 50 µL geëxtraheerd eiwit werd gemengd met monsterbuffer (4 mL gedeïoniseerd water, 1 mL 0,5 M Tris HCL, 1,6 mL 10% SDS, 0,4 mL 2-mercaptoethanol, 0,2 mL 1% (g/v) Broomfenolblauw) (1:1) en gescheiden door 12% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel (SDS-PAGE).29

Lipopolysaccharide-SDS-Polyacrylamidegelprofiel voor Colistinegevoelige en Colistineresistente isolaten

LPS van de geteste isolaten werden geëxtraheerd en gezuiverd met behulp van Westphal, Jann30 en het gezuiverde materiaal geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE, gevolgd door koolhydraatspecifieke zilverkleuring.31

resultaten

isolatie van Pseudomonas aeruginosa en gevoeligheid voor antibiotica

van de 175 monsters van patiënten met verschillende infecties waren 75 monsters (42,8%) fenotypisch positief voor P. aeruginosa en positief voor toxA gen.Uit antimicrobiële gevoeligheidstesten bleek dat de geïsoleerde P. aeruginosa volledig resistent was tegen amoxicilline/clavulaanzuur en dat hoge resistentie werd waargenomen tegen ampicilline/sulbactam (68%), ceftazidim (63%) en azetreonam (60%). Matige resistentie werd waargenomen tegen zowel tobramycine als tigecycline (elk 50%). Bovendien werd lage resistentie tegen imipenem (6%) en meropenem (5,3%) aangetoond (figuur 1). Volgens de antibiotische gevoeligheidsresultaten werden de resistente isolaten geclassificeerd als MDR (96%), XDR (87%) en werd er geen isolaat geclassificeerd als PDR. Bovendien bleek dat van de 75 isolaten 16 isolaten (21,3%) resistent waren tegen colistine antibioticum met MIC ≥ 4µg/mL (variërend van 8 tot 256 µg/mL).

figuur 1 Antibioticaresistentiepatroon van alle geïsoleerde P. aeruginosa isolaten.

Bepaling van de Mcr-1 en Mcr-2 Genen

Mcr-1 gen werd waargenomen fenotypische in de colistine-resistente isolaten zijn door CDT waar de verschillen tussen de diameters van de remming van de Zones van colistine/EDTA en colistine schijven werden gemeten te worden ≥ 3mm. De resultaten toonden aan dat 6 isolaten (37.5%) laten een stijging zien in de diameter van de colistine/EDTA-schijf met 3 tot 10 mm in vergelijking met colistine schijf staan (Figuur 2).

Figuur 2 fenotypische detectie van mcr-positieve isolaten door middel van een gecombineerde schijfdiffusietest (CDT). (A): mcr-1 positieve stam toonde een toename van de zone diameter van schijven met colistin en EDTA ≥ 3mm in vergelijking met colistin alleen. (B): mcr-1 negatief isolaat vertoonde lichte verandering (1 mm) in de inhibitiezone diameter van colistine en EDTA schijf in vergelijking met colistine alleen.

verandering van Zeta potentiaal

aan de andere kant werd verandering van Zeta potentiaal assay gehouden als een fenotypische detectie van MCR genen, maar de resultaten toonden geen significante verandering in het zeta potentiaal behalve in 2 isolaten.

detectie van resistentiegenen

de genetische detectie van mcr-genen met behulp van conventionele PCR-techniek toonde aan dat 8 (50%) isolaten positief waren voor mcr-1, 6 daarvan positief voor CDT, terwijl 100% (16 isolaten) negatief waren voor mcr-2.

Antibiotische Gevoeligheid van Colistine-Resistente Isolaten

De gevoeligheid van de colistine-bestendig isoleren tegen andere antibiotica werd bepaald door Kirby-Bauer disk diffusie-methode, de resultaten toonden aan dat 100% van de isolaten waren resistent tegen Amoxicilline/clavulanic, terwijl de weerstand tegen Ampicilline/sulbactam, Cefepime en Tobramycine was 78.12%, 71.87% en 68.75% respectievelijk. De meest effectieve geneesmiddelen waren meropenem, imipenem en ciprofloxacine (Figuur 3)

Figuur 3 Antibioticaresistentiepatroon van colistin-resistente isolaten.

.

bepaling van remming van Effluxpompen door MIC-reductie met behulp van CCCP

door het effect van 0,5 MIC van CCCP op het MIC-colistine te bestuderen, werd vastgesteld dat slechts 3/16 isolaten (P6, P8 & P16) (18,75%) een vermindering van de MIC ‘ s van colistine ≥ 8 maal (Tabel 1) vertoonden in aanwezigheid van CCCP. Uit eerdere resultaten, het isolaat no. 16 bleek effluxmechanisme en mcr-1 gen te hebben.

Tabel 1 Colistineresistente isolaten, enkele mogelijke resistentiemechanismen tegen colistine en hun gevoeligheid voor andere antibiotica

uit Tabel 2 en Figuur 4 blijkt dat vijf banden met een molecuulgewicht van 66,7, 56,06, 47,8, 40,18 en 23.6 KDa waren stabiel in gevoelige en resistente isolaten, terwijl één band met een molecuulgewicht van 21 KDa alleen werd gevonden in colistin-resistente stammen die P1 (mcr-1 positief) en P12 (mcr-1 negatief) waren.

Tabel 2 molecuulgewicht en hoeveelheid % geëxtraheerde buitenmembraan eiwitten van colistine resistente en colistine gevoelige P. Aeruginosa

Figuur 4 buitenmembraan SDS-pagina van colistin resistente en gevoelige stammen. Baan 1: Eiwitmarker, rijstrook 2 en rijstrook 3: colistineresistente stammen (P1 & P12), rijstrook 4-6: colistineresistente stammen.

Lipopolysaccharide (LPS) SDS-PAGE

Lipopolysaccharide zilver-gekleurd SDS-PAGE toonde aan dat colistine-resistente mcr-1 negatieve isolaten (P3, P6 en P10) geen LPS-bandpatroon vertoonden (o-antigeen herhalingen of LPS-kern) dat de mogelijkheid van hun verlies en de resistentie van deze isolaten tegen colistine aan het licht bracht. Aan de andere kant, Colistin-resistente mcr-1 positieve stam toonde o-antigeen herhalingen (Figuur 5, rijstrook 5) die verschilt van o-antigeen herhaalt patroon van Colistin gevoelige stam (Figuur 5, rijstrook 4) terwijl beide toonde LPS kern. Deze resultaten kunnen wijzen op de aanwezigheid van gemodificeerde LPS in de mcr-1 positieve stam.

Figuur 5 LPS bandenpatroon. Rijstroken 1, 2 & 3: colistine-resistente mcr-1-negatieve stammen (P3, P6 & P10, respectievelijk), rijstrook 4: colistinegevoelige stammen en rijstrook 5: colistine-resistente mcr-1-positieve stam (P1). O-antigeen wordt herhaald in dozen en de pijl verwijst naar LPS-kern.

discussie

onlangs verschijnen pathogene bacteriestammen die resistent zijn tegen multidrugs wanneer de meeste beschikbare antibiotica niet effectief zijn.6,32-36 de polymyxins beschouwd als de laatste redmiddel voor de behandeling van multi-drug resistente bacteriële infecties, dus het bestuderen van de opkomst van colistin-resistent was een must. Polymyxins toonden hun activiteit door hun elektrostatische interactie tussen hen en de negatief geladen delen op lipide A van gramnegatieve bacteriën resulterend in de destabilisatie van het buitenmembraan en de lekkage van de cytoplasmic inhoud en lysis.37,38

de meest voorkomende oorzaak van polymyxineresistentie is LPS modificatie door toevoeging van 4-amino – 4-deoxy-l-arabinose (Lara4N) en fosfoethanolamine (gecodeerd door mcr-type genen) of galactosamine aan lipide a van de LPS-kern. Dientengevolge, beà nvloedt een daling van de netto-negatieve last van fosfaatresiduen de affiniteit van polymyxin aan het membraan of wegens het effect van twee-component regelgevende systemen (TCSs) pmrA/pmrB en phoP/phoQ.39

in onze studie ontdekten we colistineresistentie aan de hand van de resultaten van MICs, gevolgd door hun testen op de aanwezigheid van mcr-1 fosfoethanolamine transferase met behulp van fenotypische methoden en de detectie van mcr-1geen. Fenotypische methoden hangen af van het feit dat mcr-1 fosfoethanolamine zinkmetalloproteïne is. Zo, zal om het even welke daling van zink MICs van colistin in isolaten positief voor mcr-1 verminderen. Als mcr – 1-coderend enzym staat een zinkmetalloproteïne het gebruik van EDTA als metaalchelator toe om zink in media te verminderen en colistinmic ‘ s en het zeta-potentieel van mcr-1-positieve isolaten te beïnvloeden.40

onze studie toonde een hoge prevalentie van P. aeruginosa aan (42,8%). MDR P. aeruginosa kwam overeen met 96% van de totale isolaten en 87% was XDR. Hoge prevalentie van colistin-resistente P. aeruginosa (21.3%) werd ontdekt, wat het gevolg kan zijn van onvoldoende infectiebestrijdingsmaatregelen en misbruik van bactericide antibiotica in de intensive care-afdelingen van onze landelijke ziekenhuizen. Daarnaast wordt Colistin veel gebruikt in onze landen in de groeibevordering van voedselproducerende dieren, vooral in de pluimvee-industrie, terwijl carbapenems in noodsituaties worden gebruikt.Carbapenems vertoonde dus een waarneembare activiteit tegen de geteste organismen in vergelijking met colistine. Aan de andere kant werden onze resultaten waargenomen die hoger waren dan die gemeld door Liassine et al25 die meldden dat één isolaat van 300 isolaten van verschillende bacteriële species werd geïdentificeerd als P aeruginosa die resistentie tegen colistine vertoonde en mcr-1 gen bevatte.

gecombineerde schijfdiffusietest (CDT) en de door EDTA geïnduceerde verandering van zeta-potentiaal werden gebruikt als fenotypische methoden41,42 voor de detectie van mcr-1-gen. Uit de resultaten bleek dat geen isolaten positief waren voor mcr-2 en dat 8 (50%) isolaten van colistin-resistente isolaten mcr-1 positief waren, terwijl 2 isolaten van deze isolaten RZP > 2,5 vertoonden. Van de 8 mcr-1 positieve isolaten waren 6 isolaten positief voor CDT, terwijl twee mcr-1 positieve (stam No. P15 en P16) negatief waren voor CDT, wat te wijten kan zijn aan coproductie van aanvullend mechanisme van colistineresistentie dat interfereert met het effect van EDTA.21 Als, werd gevonden dat isolaat no. P16 (mcr-1-positief en CDT-negatief) was positief voor efflux.21,43-45 bovendien kunnen colistin-resistente isolaten die negatief waren voor mcr-1 mutaties hebben als gevolg van het langdurig gebruik van antimicrobiële stoffen.

verder hebben we colistin-resistente isolaten getest op de aanwezigheid van effluxmechanismen met behulp van CCCP (een effluxpompremmer) en het verschil in buitenste membraaneiwit en LPS SDS-PAGE profiel tussen gevoelige en resistente isolaten. Onze resultaten onthulden de aanwezigheid van efflux mechanisme bij 3 isolaten, terwijl een van hen mcr-1 positief was. Het buitenste membraaneiwitprofiel vertoonde één band met een molecuulgewicht van 21 KDa in de resistente isolaten P1 (mcr-1 positief) en P12 (colistin-resistente mcr-1 negatief). Bovendien, werd gevonden dat colistin-resistente mcr – 1 negatieve spanningen geen LPS bandenpatroon (o-antigeen herhaalt of LPS kern) maar mcr-1 positieve (P1) en Colistin gevoelige isolaten LPS kern maar verschillend o-antigeen herhaalt patroon toonden. Machado et al20 bestudeerden de rol van effluxpomp bij colistineresistentie bij Acinetobacter baumanni en vonden dat effluxactiviteit bijdraagt tot de heteroresistentie van A. baumanni zonder mutatie. Marjani et al43 toonden aan dat 22,5% van de geïsoleerde P. aeruginosa resistent was tegen colistine, wat dicht bij onze resultaten ligt en dat meer dan 50% van de colistine-resistente isolaten positief waren voor effluxpompen.

hoewel het exacte mechanisme van het doden van bacteriën door colistine of polymyxinen niet duidelijk bekend is, is het bekend dat hun binding aan de positief geladen peptiden en het negatief geladen lipide A een kritieke stap is. Dus testten we hun LPS SDS-PAGINAPROFIEL en een significant verschil tussen de geteste stammen werd waargenomen. In een studie uitgevoerd door Moffatt et al,46 werd gemeld dat het verlies van LPS resulteerde in het ontstaan van A. baumanii colistine resistent die optreedt als gevolg van de inactivatie van lipide a biosynthese genen (lpxA, lpxC, of lpxD). De eiwitpatronen van het buitenmembraan toonden de aanwezigheid aan van een molecuulgewicht van 21 KDa in colistin-resistente isolaten die kunnen overeenkomen met OprH volgens die gerapporteerd door Nicas en Hancock47 die meldden dat oprh expressie een rol speelt in de resistentie van Pseudomonas tegen polymyxinen en EDTA omdat OprH divalente kationen in het buitenmembraan vervangt, wat resulteert in het blokkeren van polycationische antibiotische opname. De vorige bevinding kan verklaren waarom stam no. P1 (mcr-1 positief) was negatief voor CDT.

conclusies

deze studie toonde een hoge prevalentie aan van MDR en XDR P. aeruginosa die colistineresistentie vertoonden bij patiënten die op de intensive care waren opgenomen en aan verschillende infecties leden. Ook, toonde het de aanwezigheid van verschillende mechanismen die in colistinresistentie kunnen resulteren. Dit wijst op de dringende noodzaak van het veranderen van de antibioticabehandelingsstrategieën voor zowel mens als dier.