Refining the phylum Chlorobi by resolve the phylogeny and metabolic potential of the representant of a deeplictching, uncultivated lineage

Genomic reconstruction of NICIL-2

Microbial community compositional analysis of thermofiele bacterial consortia adapted to grow on biomass substraten (cellulose, xylaan en switchgrass) als hun enige koolstofbron bij 60 °C consequent geïdentificeerd een alomtegenwoordig OTU97 die ver verwant was aan gekweekte leden van de phylum Chlorobi (Eichorst et al., 2013, 2014). Het metagenomic rangschikken van een consortium dat op ionisch-vloeibaar voorbehandelde switchgrass wordt aangepast om te groeien, waarin Chlorobi-verwante OTU97 overvloedig was, werd uitgevoerd om de phylogeny en metabolisch potentieel van de bevolking te begrijpen die door deze OTU97 werd vertegenwoordigd. Assemblage (zie materialen en methoden) en geautomatiseerde binning (Wu et al., 2014) van het metagenoom van dit consortium leverde 20 genomische bakken op( aanvullende tabel S3), waaronder de meest voorkomende bakken een populatie waren die nauw verwant was aan chitinophagaceae stam NYFB (61,8%), die geïsoleerd was uit een verwante verrijking geteeld op cellulose (Eichorst et al., 2013), en de Chlorobi-gerelateerde bin (23,1%). De bakken met >1% omvatten meerdere niet-gecultiveerde populaties die clusteren met de Paenibacillaceae (bakken 003 en 006), een niet-gecultiveerde populatie die clusteren met Verrucomicrobia onderverdeling 3 (bin 004) en een populatie die nauw verwant is aan de Thermobipora bispora (bin 005), een actinobacterieel thermofiel.

De Chlorobi-gerelateerde bin werd NICIL-2 genoemd (voor Newby Island Compost ionische vloeistof-2 in abundant). De analyse van de voorspelde eiwitten van het nicil-2-genoom kwam overeen met de identificatie ervan als een populatie die ver verwant is aan leden van het FCB-superfylum, waarbij de Bacteroideten (33%) en Ignavibacteriën (15,7%) de nauwst verwante eiwitsequenties hebben (figuur 1). Het teruggewonnen nicil-2 Concept genoom was relatief klein (2,67 Mbps) en bijna compleet (95,3%; 102 van de 107 single copy marker genen in 152 scaffolds). De lengte van N50 voor het nicil-2 Concept genoom was 168 929 bp en de grootste contig was 1.1 MB, hetgeen erop wijst dat de meeste steigers een hoogwaardige assemblage vormden (Tabel 1).

de verdeling van de best-matched lineage voor alle nicil-2 eiwitten. De Percentages worden geschat door eiwittellingen die aan elke afstamming overeenkwamen te delen tegen het aantal van alle nicil-2 proteã nen. Zie materialen en methoden voor details.

fylogenetische analyse van NICIL-2

een 16S rRNA gen (1451 bp) werd teruggevonden in het nicil-2 Concept genoom. Het ribotype dat het nauwst verwant is aan het 16S rRNA gen van NICIL-2 (>99% identiek) werd gesequenced uit een fosmid kloon (JFF029_06) teruggevonden in een thermische stroom (70 °C) in een Japanse goudmijn sequentie (Nunoura et al., 2005). 16S rRNA genen van gekweekte vertegenwoordigers van de Bacteroideten en Chlorobi waren <85% identiek aan de nicil-2 sequentie. Een fylogenetische boom die door het uitlijnen van 16S rRNA genopeenvolgingen met betrekking tot NICIL-2 wordt geconstrueerd toonde aan dat de lijn die NICIL-2 bevatten van Bacteroidetes en Chlorobi verschillend was (Figuur 2). De nicil-2 lijn bevatte twee lijnen van afdaling gebaseerd op de temperatuur van de monsternemingsomgeving. De hoge temperatuurcluster (in rood afgebeeld in Figuur 2) omvatte ribotypen die voornamelijk werden teruggevonden in hoge temperatuuromgevingen variërend van 55 °C tot 80 °C, zoals de kloon OPB56 (Hugenholtz et al., 1998). De tweede cluster omvatte ribotypes die voornamelijk werden teruggevonden in gematigde temperatuuromgevingen variërend van 20 °C tot 32 °C (in het groen afgebeeld in Figuur 2). Aangezien OPB56 de eerste kloon was die aan deze fylogenetische cluster is gelieerd, wordt de afstamming die NICIL-2 bevat aangeduid als de OPB56 clade. Een uitgebreide weergave van de 16S rRNA genboom is afgebeeld in aanvullende figuur S1.

De maximale waarschijnlijkheid phylogenetic boom die voor de nieuwe lijn NICIL-2 wordt gebouwd gebruikend het gen van 16S ribosomal RNA. De clade die het dichtst bij Soort NICIL-2 lag, was afkomstig van een fosmide geïsoleerd uit een Japanse goudmijn (Nunoura et al., 2005). De temperatuurbereiken van de soorten werden bepaald aan de hand van de literatuur die met elk NCBI-toetredingsnummer is geassocieerd. De bewoonbaarheidstemperatuur voor de soorten werd gekenmerkt door rood (>55 °c), groen (20-32 °C) of zwart (onbepaald). Schaalbalk geeft 0,05 veranderingen per nucleotideplaats aan. Details voor het bouwen van bomen worden verstrekt in materialen en methoden. De uitgebreide fylogenetische boom die alle knooppunten toont kan worden gevonden in aanvullend figuur S1. Een full colour versie van deze figuur is beschikbaar op het Isme Journal online.

om de phylogenetic affiliatie van NICIL-2 en de opb56 clade vollediger te vestigen, werden de extra ribosomal eiwitopeenvolgingen verkregen uit gegevens die van natuurlijke steekproeven worden teruggekregen. Homologen van 22 geconserveerde ribosomale genen in NICIL-2 werden gevonden in twee Japanse Thermal spring fosmid klonen (JFF029_C06 en JFF027_B02). Deze reeks 22 ribosomal proteã nen werd gebruikt om metagenomic gegevensreeksen van milieu ‘ s op hoge temperatuur te onderzoeken. De volledige reeksen van deze behouden ribosomal genen werden geà dentificeerd in vier metagenomic gegevensreeksen die uit milieu ‘ s op hoge temperatuur worden verkregen. De geautomatiseerde verzameling van deze datasets herstelde zes bijna complete (>90% complete) ontwerp genomen die sequenties bevatten voor de geconserveerde 22 ribosomale eiwitten in het nici-2 genoom en de Japanse goudmijn fosmid klonen (aanvullende tabel S4). Vijf van de zes aaneengeschakelde eiwitopeenvolgingen geclusterd met in de OPB56 lijn met NICIL-2, terwijl één van opeenvolgingen van Yellowstone Fairy valt geclusterd met Ignavibacteria (figuur 3a). Deze fylogenetische boom toonde aan dat de Chlorobea, Ignavibacteriën en OPB56 een monofyletische clade vormden met een hoog vertrouwen (97%). De Bacteroideten vormden een aparte cluster, en de familie Rhodothermaceae, waarvan de verwantschap met de Bacteroideten in twijfel is getrokken (Nolan et al., 2009), met een hoge betrouwbaarheid (>80%) bij de Bacteroideten waren aangesloten. Een tweede fylogenetische boom werd geconstrueerd door een uitlijning van 86 enige kopie genen samen te voegen die onder Bacteroidetes, Chlorobi en Fibrobacter worden gedeeld (figuur 3b). Deze boom reproduceerde de topologie waargenomen voor het gen opgebouwd uit de 22 ribosomale genen, verdere ondersteuning van de aansluiting van de Chlorobea, Ignavibacteria en OPB56.

De maximum likelihood fylogenetische boom gebouwd voor de roman afkomst NICIL-2 met behulp van (een) 22 ribosomaal eiwit en (b) 86 single-kopiëren eiwitten gedeeld onder de Bacteroidetes, Chlorobea, Ignavibacteria, OPB56 en Fibrobacter clusters. Schaalbalk geeft 0,1 veranderingen per aminozuurplaats aan. Details voor het bouwen van bomen worden verstrekt in materialen en methoden.

een complementaire benadering van het begrijpen van evolutionaire relaties tussen Bacteriodetes en Chlorobi is geweest om indels in geconserveerde proteã nen te identificeren (Gupta en Lorenzini, 2007). Inserties in DNA-polymerase III (28 aa) en alanyl-tRNA synthetase (12-14 aa) die bewaard worden onder de GSB en afwezig zijn onder de Bacteriodetes werden toegeschreven als kenmerkend voor het phylum Chlorobi. Alignments van deze twee eiwitten (aanvullende figuren S2 en S3) geven aan dat de DNA-polymerase III-insertie in de GSB-eiwitsequenties niet aanwezig is in de voorspelde eiwitten van de Ignavibacteriën en NICIL-2-genomen, terwijl 2-3 aminozuren van de insertie in de GSb-alanyl-tRNA-synthetasesequenties behouden blijven in de Ignavibacteriën en nicil-2-eiwitsequenties.Metabole reconstructie van NICIL-2

de fysiologie van NICIL-2 werd afgeleid door metabole reconstructie en het metabole potentieel ervan in vergelijking met vertegenwoordigers van GSB (Chlorobaculum tepidum), Bacteroidetes (Rhodothermus marinus en Salinbacter ruber) en Ignavibacteria (Ignavibacterium album en Meliobacter roseus). Genen die fotosynthese-gerelateerde eiwitten coderen, waaronder homologen van C. tepidum ‘ s fotosynthetische reactie centrum subeenheden (CT1020, PSCS, psC, pscD), chlorosome envelop eiwitten (csmABCDEFHIJX), en bacteriochlorophyll a eiwitten (fmoA), zijn afwezig in alle andere genomen, onderscheidend de GSB in deze vergelijkende set (Eisen et al., 2002). Een visuele samenvatting van de metabole reconstructie is weergegeven in Figuur 4. Voor volledige geninformatie, vaknummers en afkortingen, zie de aanvullende tabellen S5 en S6.

gereconstrueerd metabolisme van NICIL-2 afgeleid uit het opnieuw geassembleerde genoom. Voor volledige geninformatie, vaknummers en afkortingen, zie de aanvullende tabellen S5 en S6. De rode tekst vertegenwoordigt enzymen of biosynthetische wegen die uit het genoom ontbreken. Blauwe, groene en paarse pijlen geven respectievelijk ATP, NADH en NADPH stroom aan.

koolstofmetabolisme

het nici-2-genoom codeert een complete set genen voor glycolyse, de TCA-cyclus en gluconeogenese (Figuur 4). Genen voor de rTCA-cyclus, die aanwezig zijn en tot expressie komen voor autotrofe koolstoffixatie in de GSB, zijn afwezig. Verder wijst de aanwezigheid van genen die cofactoren coderen voor liponzuur in de pyruvaatdehydrogenase-en α-ketoglutaraat dehydrogenase-complexen erop dat de TCA-cyclus in de oxidatieve richting werkt. Het grootste deel van de rTCA-cyclus is gereconstrueerd in R. marinus en I. album, met inbegrip van meerdere pyruvaat-ferredoxine-oxidoreductasen en α-ketoglutaraat-ferredoxine-oxidoreductasen, twee vereiste enzymen voor de rTCA-cyclus. Het I. album en R. marinus genomen missen ATP-afhankelijk citraat lyase, een kritisch enzym om de rTCA cyclus te voltooien (Buchanan and Arnon, 1990). Er is voorgesteld dat I. album een ATP-onafhankelijk citraat lyase mag gebruiken om te functioneren in de rTCA cyclus in plaats daarvan, hoewel deze claim is niet experimenteel getest en noch I. album noch R. marinus zijn aangetoond autotrophisch te groeien (Liu et al., 2012a).

ondanks de hoge relatieve abundantie in aangepaste culturen die op plantaardige biomassa groeien, had NICIL-2 een verrassend beperkte enzymatische capaciteit om complexe biomassa te deconstrueren. De vergelijking van het metabole potentieel voor polysaccharide hydrolyse tussen de 20 bakken die uit het metagenoom van voorbehandelde-switchgrass verrijking worden geëxtraheerd, toonde aan dat NICIL-2 relatief minder genen voor cellulose en hemicellulose deconstructie heeft in vergelijking met andere leden van de microbiële gemeenschap (aanvullend figuur S4). In het bijzonder hebben stam NYFB, de verrucomicrobiële populatie en veelvoudige grampositieve Firmicutes uitgebreidere repertories van genen voor polysaccharidehydrolyse. Aanvullende inspectie van de gereconstrueerde opb56-gelieerde genomen uit hoge temperatuur natuurlijke monsters toonde aan dat het gebrek aan genen voor polysaccharide hydrolyse gebruikelijk was voor deze clade. Onder de genomen clustering met de Bacteroidetes en Chlorobi, R. marinus, M. roseus en Yellowstone Obsidian Pool Bin 062, die clusters met de Ignavibacteriën, bezat een uitgebreid repertoire van glycoside hydrolasen om de plantaardige biomassa te deconstrueren. Deze analyses suggereren dat NICIL-2 en verwante leden van de OPB56 clade waarschijnlijk niet betrokken zijn bij de primaire deconstructie van biomassa in de aangepaste gemeenschap en natuurlijke omgevingen. Het is denkbaar dat NICIL-2 op suikermonomeren of oligomeren kan groeien; nochtans, werd slechts één voorspeld disaccharidetransportergen geà dentificeerd in het genoom.

hoewel de selectie voor NICIL-2 onder aërobe omstandigheden plaatsvond, kan het de capaciteit voor fermentatie bezitten. Genen voor de fermentatieve productie van ethanol zijn aanwezig (via alcoholdehydrogenase, EC 1.1.1.1), terwijl genen voor formiaat (via pyruvaatformiaat lyase, EC 2.3.1.54), lactaat (via lactaatdehydrogenase, EC 1.1.1.27) en propionaat (via methylmalonyl-CoA carboxyltransferase, 2.1.3.1) ontbreken. Het nicil-2 genoom codeert een gen voor fosfotransacetylase (EC 2.3.1.8), maar niet voor acetaatkinase (EC 2.7.2.1), die beide nodig zijn voor fermentatieve acetaatproductie. Zowel I. album als M. roseus bevatten genen voor de productie van lactaat en acetaat, terwijl C. Tepidum dat niet doet.

stikstof-en zwavelmetabolisme

genen voor ammoniumassimilatie, glutaminesynthase (EC 6.3.1.2) en glutamaatsynthase (EC 1.4.1.13) werden gedetecteerd in het nicil-2-genoom. Er werden echter geen genen geïdentificeerd voor ongelijke nitraatreductie, assimilatie van nitraatreductie, denitrificatie, stikstoffixatie en nitrificatie. C. tepidum codeert nif-genen die nodig zijn voor N2-fixatie, terwijl M. roseus (Kadnikov et al., 2013), I. album (Liu et al., 2012a) en R. marinus (Nolan et al., 2009) niet doen. C. tepidum is een obligaat zwaveloxidator en kan daarom sulfide, thiosulfaat, sulfiet en elementaire zwavel oxideren. C. tepidum oxideert sulfide bij voorkeur tot elementair zwavel, vervolgens elementair zwavel en thiosulfaat tot sulfaat (Chan et al., 2008). Bovendien kan sulfiet worden geoxideerd wanneer het in het groeimedium wordt geleverd, maar het kan C. Tepidum niet ondersteunen als enige elektronendonor (Rodriguez et al., 2011). NICIL-2, I. album, M. roseus, R. marinus mist alle genen die nodig zijn voor de oxidatie van gereduceerde zwavelverbindingen.

biosynthese van aminozuren

het nici-2-genoom mist veel sleutelgenen voor de biosynthese van aminozuren. De volledige wegen worden gecodeerd voor alanine, arginine, asparagine, aspartaat, β-alanine, glutamaat, glycine, lysine en methionine. NICIL-2 mist ilvC en leuABCD en bezit daarom onvolledige routes voor de biosynthese van valine, leucine en isoleucine. Hetzelfde geldt voor de I. het genoom van het album ontbrak aan alle genen die nodig zijn voor de biosynthese van valine, leucine en isoleucine uit pyruvaat, met uitzondering van de vertakte keten amino transferase (ilvE), terwijl M. roseus en C. Tepidum volledige pathways bevatten. Noch NICIL-2 noch I. album codeert genen die nodig zijn voor Proline biosynthese uit glutamaat (proBAC), terwijl zowel C. Tepidum als M. roseus dat doen. Het serbgen voor biosynthese van serine ontbreekt in NICIL-2, I. album, M. roseus, en wordt gevonden in sommige GSB, waaronder C. Tepidum. NICIL-2 kan ook aminozuren als groeisubstraten gebruiken. Complete degradation pathways are present for branched-chain amino acids (leucine, isoleucine and valine), similar to pathways observed in ‘Candidatus Thermochlorobacter aerophilum’ (Liu et al., 2012b).

Electron transport

The major electron transport chain components were identified in the NICIL-2 genomes including: NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I, EC 1.6.5.3), membrane-bound succinate dehydrogenase (Complex II, EC 1.3.5.1), quinol-oxidizing alternative Complex III (ACIII) (Yanyushin et al., 2005; Pereira et al., 2007), several cytochrome c oxidases (Complex IV, EC 1.9.3.1) and an F-type H+-transporting ATPase (Complex V, EC 3.6.3.14). NICIL-2 contains one complete set of genes for NADH:ubiquinone oxidoreductase (14 subunits, nuoABCDEFGHIJKLMN), although they are not assembled in one operon (Supplementary Figure S6). In plaats daarvan zijn de meeste genen onafhankelijk gerangschikt over de grootste nicil-2 scaffold (nuoGHI, nuoJK, nuoF, nuoD, nuoE en nuoMN), en de resterende genen worden gevonden op drie kleinere scaffolds (nuoAB, nuoL en nuoC), wat aangeeft dat de afwezigheid van een operonstructuur geen artefact van assemblage is. C. tepidum bevat één set genen die coderen voor de NADH:ubiquinonoxidoreductase zonder nuoEFG (11 subeenheden). I. album en M. roseus bevatten twee sets nuoABCDHIJKLMN en één set nuoEFG elk (aanvullende figuur S6). Interessant is dat Complex I van NICIL-2 het nauwst verwant is aan die van Rhodothermus marinus en Salinibacter ruber van de Bacteroideten, die beide één complete set genen voor NADH bevatten:ubiquinonoxidoreductase (figuur 5a). Homologen voor de 11 complexe I-subeenheden werden ook geïdentificeerd in alle zes nicil-2 gerelateerde bakken die uit Yellowstone en Great Boiling Spring werden teruggevonden, en een aaneengeschakelde assemblage van deze eiwitsequenties die werden geclusterd met de sequenties van NICIL-2.

buren die aaneengeschakelde eiwitbomen van Complex I (a) en alternatief Complex III (b) samenvoegen. Getallen tussen haakjes geven het aantal subeenheden aan dat gebruikt wordt om de boom te bouwen. Schaalbalk geeft x veranderingen per aminozuurplaats aan.

De ACIII is een nieuwe klasse van bacteriële membraan oxidoreductasen gevonden in organismen die vaak het BC1 complex missen (Yanyushin et al., 2005). De ACIII van R. marinus (Pereira et al., 2007; Refojo et al., 2013) en filamenteuze anoxygene fototrofe bacterie Chloroflexus aurantiacus (Gao et al., 2009, 2013) is gezuiverd en bestudeerd. Onlangs, werden grote aantallen genclusters die voor aciii subeenheden coderen, met variaties in constitutie en organisatie, gevonden in een waaier van bacteriële genomen (Refojo et al., 2013). Bijvoorbeeld, R. marinus bevat de genen actABCDEF in een operon dat codeert zes aciii subeenheden; homologen van deze gencluster zijn geïdentificeerd in meerdere leden van de Bacteroideten (Thiel et al., 2014). Een fylogenetische boom toont de relatie van ACIII uit NICIL-2 tot zijn naaste verwanten (figuur 5b). De GSB bezitten geen ACIII en zijn daarom niet vertegenwoordigd in deze boom. “Candidatus Thermochlorobacter aerophilum, dat geen lid is van de GSB, codeert echter een ACIII die waarschijnlijk functioneert in aërobe ademhaling (Liu et al., 2012b). Het is belangrijk op te merken dat zowel I. album als M. roseus uniek zijn onder deze set van ACIII omdat ze vijf subeenheden bevatten, waarbij de actDE-subeenheden geïdentificeerd worden als een fusie-eiwit. Een volledige aanvulling van genen coderend voor alle aciii subeenheden, die uit twee NICIL-2-verwante genoombins van de Yellowstone Metagenomes werden teruggevonden, werden gevonden om actDE fusie te bevatten en met I. album en M. roseus geclusterd. NICIL-2 bevat deze fusie niet en de genen voor het Aciii-Complex zijn nauwer verwant aan R. marinus en S. ruber.

nici-2 terminale elektronenacceptoren omvatten een type-aa3 cytochroom-c-oxidase (Complex IV) en mogelijke alternatieve cytochroom-C-oxidasen, geannoteerd als CoxMOP. Het is onwaarschijnlijk dat NICIL-2 microaerofiel is omdat Type cbb3-oxidasen niet werden gedetecteerd in het genoom. Bovendien werd cytochroom bd niet ontdekt. Ter vergelijking, zowel I. album als M. roseus genomen bevatten genen voor cbb3 type cytochroom c oxidase en een cytochroom BD complex.

het nicil-2-genoom bevat een onvolledige set mengenen voor de synthese van menaquinon. Een complete menaquinone biosynthetische pathway bevat menFDHCEBAG (Bentley en Meganathan, 1982) en het nicil-2 genoom bevat alleen menBAG. Ter vergelijking, C. tepidum en I. het album bevat volledige men pathways, terwijl de M. roseus en R. marinus genomen annotaties hebben voor alle benodigde genen behalve menb en menh, respectievelijk. Homologen van genen die enzymen coderen van de alternatieve menaquinon biosynthetische Route, de futalosine route (Arakawa et al., 2011), werden onopgemerkt in NICIL-2. Ubiquinon biosynthetische genen zijn ook afwezig. Het nicil-2 genoom kan onvolledige dekking op dit gebied hebben en de extra mensengenen kunnen met een volledig geassembleerd genoom worden gevonden. Als alternatief kan NICIL-2 quinone uitwisselen met andere leden van de Gemeenschap, zoals waargenomen voor het fototrofe consortium ‘Chlorochromatium aggregatum’ (Liu et al., 2013).

Flagella en chemotaxis

genen die coderen voor eiwitten voor het basale lichaam, haak en filament zijn aanwezig in het nicil-2-genoom. NICIL-2 mist echter genen die chemotaxis-machines coderen, behalve één regulerend eiwit, CheY. De GSB worden beschouwd als niet-beweeglijk en missen chemotaxis en flagella, terwijl I. album, M. roseus en R. marinus flagellaire en chemotaxis machines hebben.