Stabilisatie van heterochromatin door KLOK bevordert de cel van de stam van verjonging en regeneratie van kraakbeen

Antilichamen

Voor western blotting: anti-KLOK (#5157, 1:1,000), anti-HP1a (#2616S, 1:1,000) en anti-HP1y (#2619, 1:3,000) van Cell Signaling Technology; anti-KAP1 (Ab22553, 1:2000) zijn, anti-Lamin B1 (Ab16048, 1:1,000) en anti-LBR (Ab32535, 1:1.000) stand van Abcam; anti-β-actin (sc-69879, 1:3,000) van Santa Cruz Biotechnology.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) uit R&D-systemen.

Voor flowcytometrie: anti-CD73 (550257, 1:200), anti-CD90 (555595, 1:200), anti-CD44 (550989, 1:200), anti-HLA-ABC (560168, 1:100), anti-CD34 (555822, 1:200), anti-CD43 (560198, 1:200), anti-CD45 (555482, 1:200), anti-CD14 (555398, 1:200) en anti-CD19 (555415, 1:200) van BD Biosciences; anti-CD105 (17-1057-41, 1:200) en anti-PDPN (17-9381-42, 1:200) van eBioscience (San Diego, CA, verenigde staten), anti-CD29 (303004, 1:200) en anti-CD13 (301705, 1:200), anti-CD166 (343903, 1:200) en anti-CD164 (324805, 1:200) van Biolegend (San Diego, CA, USA).

celcultuur

CLOCK+ / + hESCs (hESCs, line H9, Wicell Research Institute) en CLOCK−/− hESCs werden gehandhaafd op voederlagen die bestonden uit mitomycine C-geïnactiveerde muis embryonale fibroblasten (MEFs) in hESC-kweekmedium. Het hESC-kweekmedium bevatte DMEM / F12( Thermo Fisher Scientific), 20% KnockOut Serumvervanging (Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM niet-essentiële aminozuren (NEAAs, Thermo Fisher Scientific), 2 mM GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 55 µM β-mercaptoethanol (Thermo Fisher Scientific), 1% penicilline/streptomycine (Thermo Fisher Scientific) en 10 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea). Als alternatief werden hESCs gekweekt op Matrigel (Bd Biosciences, San Jose, CA, USA)-gecoate platen in mTeSR medium (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada).

zowel hESC-afgeleide hmsc ‘s als primaire hmsc’ s werden gehandhaafd in MSC-medium dat mema (Thermo Fisher Scientific) bevat, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (Cat# 10099-141, Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM NEAAs (Thermo Fisher Scientific), 1% penicilline/streptomycine (Thermo Fisher Scientific) en 1 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea).

CRISPR / Cas9-gemedieerde genbewerking in hESCs

CRISPR / Cas9-gemedieerde genbewerking werd uitgevoerd via eerder beschreven methoden met enkele wijzigingen.33,34,65 in het kort, een guide RNA targeting exon 5 van CLOCK (CLOCK-gRNA) werd gekloond in een Grna cloning vector (#41824, Addgene) (aanvullende informatie, Tabel S1). Na behandeling met een ROCK inhibitor Y-27632 (S1049, Selleck) gedurende 24 uur, werden hESCs (5 × 106) geresuspendeerd in 100 µL Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) die de plasmidecocktail bevatten, die bestond uit het donorplasmide met de homologiearmen, CLOCK-gRNA en hCas9 (#41815, Addgene), en gegalvaniseerd in een 4D-Nucleofectorsysteem (Lonza). De cellen werden toen op MEF-voedercellen gezaaid. G418 (100 µg/ mL, 11811023, Thermo Fisher Scientific) werd toegevoegd om positieve selectie 2-4 dagen na elektroporatie in werking te stellen. Na 2 weken selectie werden G418-resistente klonen geplukt en overgebracht naar een 96-wells plaat voor verdere karakterisering en uitbreiding. Genomic PCR en het westelijke bevlekken werden gebruikt voor genomic het uitgeven identificatie. Daarnaast verwijderden we de neomycine-resistentiecassette in CLOCK−/− hESCs via elektroporatie met de pcag-FLpo-2A-puro vector. Drie dagen na transfectie, werd 1 µg/mL puromycine (Thermo Fisher Scientific) gebruikt om puromycine-resistente cellen 48 uur te verrijken. na 8-12 dagen van selectie, werden de opkomende kolonies geplukt en uitgebreid voor verdere studie.

hmsc generatie en karakterisering

hMSCs werden onderscheiden van hESCs na een eerder gepubliceerd protocol.25,86,87 in het kort, hESCs werden gesplitst in embryoïde lichamen (EBs) en behandeld met differentiatiemedium (Mema (Invitrogen) aangevuld met 10% FBS (Cat# 10099-141,Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1mM NEAAs (Thermofisher Scientific), 10 ng/mL bFGF, 5 ng/mL TGFß, en 1% penicilline/streptomycine (Gibco)) op met Matrigel beklede platen gedurende 10 dagen tot 95% samenvloeiing. Vervolgens werden de samenvloeiende MSc-achtige cellen verteerd en bedekt op met Matrigel beklede platen behandeld met MSC-kweekmedium dat mema (Invitrogen) bevat aangevuld met 10% FBS, 0,1 mM NEAAs, 1 ng/mL bFGF en 1% penicilline/streptomycine (Gibco). Toen, werden de samenvloeiende MSc-als cellen overgegaan aan gelatine-met een laag bedekte platen. De hMSCs werden gezuiverd met verschillende antilichamen die corresponderen met hmsc-specifieke markers (CD73, CD90 en CD105) door FACS. De cd73, CD90 en CD105 triple-positive cellen werden verder gekarakteriseerd door oppervlakteantigenmarkers, waaronder positieve markers, zoals CD44, CD166, CD29, HLA-ABC en CD13, en negatieve markers, zoals CD34, CD43, CD45, CD164, CD14, CD19 en PDPN. De functionaliteit van hMSCs werd verder geverifieerd door differentiatie naar chondrocyten, adipocytes en osteoblasten. De osteoblasten, chondrocyten en adipocyten afgeleid van hMSCs werden gekenmerkt door von Kossa kleuring (gms 80045.3, GenMed Scientific Inc., USA) en osteocalcine kleuring (wijst op osteogenese), toluïdine blauw (T3260, Sigma) en aggrecan kleuring (wijst op chondrogenese), en olie rood o (O1391, Sigma) kleuring (wijst op adipogenese) volgens de instructies van de fabrikant.

isolatie en kweek van primaire hMSCs

primaire hMSCs werden geïsoleerd uit het tandvlees van verschillende individuen.23,33,34,65 de van het tandvlees gescheiden weefsels werden in kleine (1 mm2) stukjes gesneden met behulp van een schaar in TrypLE™ Express enzym (1 ×) plus Dispase IV en vervolgens bij 37 °C gedurende 30 minuten geïncubeerd. De verteerde weefselsuspensies werden geneutraliseerd door MSC-kweekmedium en gecentrifugeerd bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De resulterende pellets werden geresuspendeerd in MSC-kweekmedium dat MEMa (Invitrogen) bevat, aangevuld met 10% FBS (Gibco), 1 ng/mL bFGF en 1% penicilline/streptomycine (Gibco) en geplateerd op gelatine-gecoate platen voor de groei van primaire hMSCs.

Luciferase reporter assay

het per2-dLuc plasmide was een vriendelijk geschenk van E. E. Zhang.88 cellen met PER2-dLuc werden gekweekt tot samenvloeiing in 24-Wells kweekplaten en gesynchroniseerd met 20 µM forskoline (S2449, Selleck) gedurende 2 uur. het medium werd vervolgens vervangen door MSC kweekmedium met 0,25 mM luciferin (LUCK-1G, GoldBio). Cellen werden gedurende 5-7 dagen gemonitord in een LumiCycle luminometer bij 37 °C; de gegenereerde gegevens werden geanalyseerd met LumiCycle Analysis software (Actimetrics). De gegevens van de eerste 24-uurs cyclus werden uitgesloten van onze statistische analyse.

in vitro hmsc-synchronisatie en circadiaanse analyse

hmsc ‘ s werden op gelatine-gecoate platen met MSC-medium geplateerd tot 95% samenvloeiing. Voor synchronisatie, werden de cellen dan behandeld met 20 µM forskolin 2 h en opnieuw opgeslagen in MSC-medium na het wassen tweemaal met PBS. Cellen werden verzameld vanaf 24 uur post-synchronisatie op 3 uur intervallen voor 9 tijdpunten, gevolgd door RNA-extractie en RT-qPCR-detectie. De niet-parametrische test JTK_CYCLE werd gebruikt voor het verifiëren van circadiaanse oscillaties zoals eerder beschreven.89 tijdsverloop threads van hMSCs met zowel p als q waarden < 0,05 werden beschouwd als ritmisch.

Western blotting

cellen werden gelyseerd in SDS-buffer met 4% SDS en 100mm Tris-HCl. De eiwitconcentratie werd gekwantificeerd gebruikend een BCA-kwantificeringsuitrusting (Thermo Fisher Scientific), en ~20 µg eiwit per steekproef werd onderworpen aan SDS-pagina en elektrotransferred aan PVDF membranen (Millipore). Vervolgens werden membranen Geblokkeerd met 5% melk en geïncubeerd met primaire antilichamen en vervolgens met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen. Immunoreactieve banden werden gevisualiseerd in een ChemiDoc XRS + systeem (Bio-Rad). Statistische analyses werden gekwantificeerd door Image J software (NIH). Elke groep had drie onafhankelijke experimenten. Statistische significanties werden beoordeeld door een T-test van een tweestaart ongepaarde Student.

Transmissieelektronenmicroscopie

late passage (P9) CLOCK+/+ en CLOCK−/− hMSCs werden enzymatisch geoogst met TrypLE (Thermo Fisher Scientific) en gecentrifugeerd bij 500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De resulterende pellets werden ‘ s nachts gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS (pH 7,4) op ijs. De cellen werden vervolgens gedehydrateerd in een gesorteerde reeks ethanolen, permeabilized en ingebed in Lowicrylhars HM20. Secties (200 nm) werden verkregen en afgebeeld met een Spirit transmission electron microscope (FEI Company) werkend bij 100 kV.

Immunofluorescentiekleuring

cellen gezaaid op coverslips (Thermo Fisher Scientific) werden tweemaal gewassen met PBS. Vervolgens werden de cellen gefixeerd met 4% PFA gedurende 30 min, gepermeabiliseerd met 0,4% Triton X-100 in PBS gedurende 30 min en Geblokkeerd met 10% donkey serum in PBS (Jackson Immuno Research) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na blokkering werden cellen ‘ s nachts geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 °C. Vervolgens werden cellen drie keer gewassen met PBS, geïncubeerd met secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en drie keer gewassen met PBS. Kernen werden gekleurd met Hoechst 33342 (H3570, Thermo Fisher Scientific). Beeldvorming werd uitgevoerd met een Leica SP5 confocal systeem. De statistische analyse van aantal, intensiteit en gebied van fluorescentiesignalen werden gekwantificeerd door de software van Beeldj (NIH). De cellen werden verzameld van drie biologische replicaten. Statistische significanties werden beoordeeld door een T-test van een tweestaart ongepaarde Student. De 3D reconstructie van h3k9me3 kleuring zoals weergegeven in Fig. 2f werd uitgevoerd door seriële z-stack sectionering met 50 nm intervallen in een conventionele modus voor maximaal 50 beelden met een Leica SP5 confocal systeem en verder verwerkt voor 3D-reconstructie door Imaris software (Versie 7.4.2) zoals eerder beschreven.90

SA-β-gal kleuring assay

SA-β-gal kleuring werd uitgevoerd zoals beschreven in eerdere studies.33,34 in het kort, cellen werden gefixeerd met fixatiebuffer (2% formaldehyde en 0.2% glutaaraldehyde) gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Vervolgens werden vaste cellen ‘ s nachts gekleurd met verse kleuroplossing bij 37 °C. Gezichtsvelden werden willekeurig geselecteerd in elk putje, en het percentage SA-β-gal-positieve cellen werd bepaald met behulp van ImageJ-software. Elke groep had drie biologische replicaten. Statistische significanties werden beoordeeld door een T-test van een tweestaart ongepaarde Student.

klonale expansietest

een klonale expansietest werd uitgevoerd zoals eerder gemeld.34,65 in het kort, 6000 cellen per put werden gezaaid in 6-put platen en gekweekt voor 9-12 dagen. Cellen werden tweemaal gewassen met PBS, gefixeerd met 4% PFA en 1 uur lang gekleurd met 0,2% kristalviolet bij kamertemperatuur. Gezichtsvelden werden gescand door een scanner en verder gemeten door ImageJ software (NIH). Elke groep had drie biologische replicaten. Statistische significanties werden beoordeeld door een T-test van een tweestaart ongepaarde Student.

Co-IP

HEK293T-cellen getransfecteerd met plasmiden die Flag-Luc of Flag-CLOCK uitdrukken en Hmscs werden gelyseerd in CHAPS lysis buffer (120 mM NaCl, 0.3% CHAPS, 1 mM EDTA, 40 mM HEPES (pH 7,5) en volledige proteaseremmercocktail (Roche)) bij 4 °C gedurende 4 uur en werden vervolgens gedurende 40 minuten gecentrifugeerd bij 14.500 × g bij 4 °C. Voor Co-IP met exogene eiwitten werden de supernatanten gemengd met Anti-Flag antilichaam-gekoppelde parels (A2220, Sigma) en ‘s nachts geroteerd bij 4 °C. Voor Co-IP met endogene eiwitten werden de supernatanten’ s nachts gemengd met de aangegeven antilichamen bij 4 °C met rotatie en vervolgens geïncubeerd met eiwit A/G-PLUS Agarose parels (sc-2003, Santa Cruz) gedurende nog eens 4 uur bij 4 °C met rotatie. De parels werden zes keer gewassen met CHAPS-buffer en vervolgens geëlueerd met Vlagpeptides of door in 1× SDS-ladingsbuffer 10 min voor western blotting te koken.

LC-MS/MS-analyse en eiwitidentificatie

de door immunoprecipitatie verkregen geëlueerde eiwitten werden onderworpen aan 10% SDS-PAGE en gekleurd met coomassie brilliant blue (WB-0101, Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd). De gelbanden die de eiwitmonsters bevatten, werden uitgesneden, in kleine pluggen gesneden, gedehydrateerd (100% acetonitril), gereduceerd (10 mM DTT in 25 mM NH4HCO3 gedurende 45 min bij 56 °C) en gealkyleerd (40 mM joodaceetamide in 25 mM NH4HCO3 gedurende 45 min bij kamertemperatuur in het donker). Vervolgens werden de gelpluggen gedroogd en verteerd met sequencing-grade gemodificeerd trypsine (40 ng per band) in 25 mM NH4HCO3 ‘ s nachts bij 37 °C. tenslotte werd mierenzuur tot een eindconcentratie van 1% gebruikt om de enzymatische reactie te beëindigen. De resulterende oplossing werd vervolgens overgebracht naar een monsterflacon voor LC-MS/MS-analyse.

de nanoLC-MS / MS-experimenten werden uitgevoerd op een Q Exactive massaspectrometer (Thermo Scientific) in data-afhankelijke modus, waardoor MS-gegevens konden worden verzameld met een hoge resolutie van 70.000 (m/Z 200) over een M/z-bereik van 300-1.600. De ruwe gegevens van Q Exactive analyse werden geanalyseerd met Proteome Discovery (versie 1.4) gebruikend de Sequest ht zoekmachine voor eiwitidentificatie en Percolator voor valse (FDR) analyse van het ontdekkingstarief. De gegevens werden doorzocht aan de hand van de uniprot human protein database (bijgewerkt op 06-2013). FDR-analyse werd uitgevoerd met Percolator en FDR < 1% werd vastgesteld als drempelwaarde voor eiwitidentificatie. Het peptide vertrouwen werd geplaatst aan hoog voor peptide het filtreren.

RT-qPCR en RNA-Seq

totaal RNA werd geëxtraheerd uit gekweekte menselijke cellen of muizengewrichten met behulp van TRIzol (Thermo Fisher Scientific), en genomisch DNA werd verwijderd met behulp van een DNA-vrije kit (Thermo Fisher Scientific). cDNA werd gegenereerd met het Go Script Reverse Transcription System (Promega). RT-qPCR werd uitgevoerd met behulp van qPCR Mix (Toyobo) in een CFX384 Real-Time systeem (Bio-Rad). Elke groep had vier putreplicaten. Statistische significanties werden beoordeeld door een T-test van een tweestaart ongepaarde Student. Alle RT-qPCR experimenten werden uitgevoerd met ten minste drie experimentele replicaten en onafhankelijk herhaald voor ten minste twee keer. Voor RNA-seq van muizengewricht werden de kniegewricht-RNA-monsters van dezelfde behandelingsgroep van oudere muizen, geïnjecteerd met Lentivirussen met expressie van Luc (n = 12 muizen) of CLOCK (n = 12 muizen) gelijkelijk gemengd in Massa, en RNA-seq werd uitgevoerd met twee technische replicaten. Voor HMSC RNA-seq, werden twee biologische replicaten onderzocht. Een het rangschikken bibliotheek werd geconstrueerd gebruikend een de Bibliotheekvoorbereidingsuitrusting van NEBNext Ultra RNA voor Illumina volgend protocol van de fabrikant. De gegenereerde bibliotheken werden gesequenced op Illumina HiSeq X-Ten platforms met gepaarde-end sequencing met 150-bp leeslengtes. De kwaliteitscontrole en het rangschikken werden uitgevoerd door de technologie van de NoVo gen Bioinformatica. Primers gebruikt voor qPCR werden getoond in Aanvullende Informatie, tabel S2.

RNA-seq gegevensverwerking

de RNA-seq gegevensverwerking pijplijn is eerder gemeld.34 RAW gepaarde-einde reads werden bijgesneden in Trim Galore software (Versie 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Clean reads werden in kaart gebracht aan de UCSC menselijke hg19 genoom of muis mm10 genoom met behulp van hisat2 (Versie 2.0.4).91 De sam bestanden zijn geconverteerd naar BAM bestanden door SAMtools met de parameter “-s-b-q 10”.92 vervolgens werden de leestellingen berekend door HTSeq (versie 0.11.0), en werden alleen afgebeelde reads van hoge kwaliteit (mapping quality > 20) behouden.93 de fragmenten Per Kilobase per miljoen (FPKM) waarde voor elk gen werd berekend met behulp van StringTie (Versie 1.2.3).94 Differentially expressed genes (Degs) werden berekend met DESeq2 package (Versie 1.22.2) met de cut-off “q value (adjusted p value, padj) < 0,05 en |log2 (fold change)| > 1 Voor hmscs of |log2 (fold change)| > 0,5 voor muizengewrichten”. De analyse van de verrijking van de Genontologie (GO) werd uitgevoerd met ToppGene.95 gen set verrijkingsanalyse werd uitgevoerd door GSEA (Versie 2.2.4). SASP gen set werd verkregen uit een eerdere studie.42

DamID-seq

pLgw V5-EcoDam en pLgw EcoDam-V5-EMD waren geschenken van Prof. DamID-seq werd uitgevoerd zoals beschreven,58 met modificaties. In het kort, de Dam en Dam-EMD lentivirussen gegenereerd uit HEK293T cellen werden geconcentreerd door ultracentrifugatie op 19.400× g gedurende 2,5 uur. de virus pellets werden geresuspendeerd in PBS. CLOCK+/+ en CLOCK− / − hMSCs werden gezaaid in zes-putschalen met 2 × 105 cellen per put. Elke groep had drie biologische replicaten. De volgende dag werd het kweekmedium vervangen door 2 mL vers kweekmedium dat ofwel Dam ofwel Dam-EMD lentivirus bevat. 72 uur na transductie werden cellen geoogst en werd genomisch DNA geïsoleerd met behulp van een DNeasy bloed & Weefselkit (69504, Qiagen). Dpni (R0176S, New England Biolabs) spijsvertering, adapter ligation, dpnii (R0543S, New England Biolabs) spijsvertering, PCR versterking en zuivering werden uitgevoerd zoals eerder beschreven.58 voor adapter het in orde maken, werd vergroot DNA sonicated en verteerd met AlwI (R0513S, New England Biolabs). De bibliotheek van DNA werd geconstrueerd gebruikend een de Bibliotheekvoorbereidingsuitrusting van Nebnext Ultra DNA voor Illumina (E7370s, New England Biolabs). De bibliotheken werden samengevoegd en onderworpen aan paired-end sequencing met 150-bp leeslengtes op Illumina NovaSeq sequencers.

DamID-seq gegevensverwerking

ruwe reads van Dam en Dam-EMD gegevens voor klok+/+ en klok−/− hMSCs werden bijgesneden in Trim Galore software (Versie 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmed reads werden in kaart gebracht aan het menselijk HG19-genoom van UCSC met behulp van Bowtie 2 (Versie 2.2.9).96 PCR duplicaten werden verwijderd met de Markduplicaten.jar programma in Picard Gereedschap. Vervolgens werden reads gesorteerd met SAMtools (versie 1.6). Om het effect van het rangschikken van bias en diepte te minimaliseren, werden verwerkt leest van drie replicaten voor elke steekproef samengevoegd. Dan, werd hetzelfde aantal (110 miljoen) van hoogwaardige leest voor elk celtype willekeurig geselecteerd voor stroomafwaartse analyse. Om de DamID signalen te visualiseren, berekenden we de log2 ratio van de Reads Per Kilobase per miljoen in kaart gebrachte reads (RPKM) van de Dam-EMD en Dam signalen (log2 (Dam-EMD/Dam)) in klok+/+ en klok−/− HMSCS voor elke 10-bp bin met behulp van het bamCompare programma in deepTools (Versie 2.5.4-2-5ee467f) software.

voor de identificatie van LAD− regio ‘ s in klok+/+ en klok−/-hMSCs, berekenden we eerst de DamID signalen (log2 ratio van de RPKM van de Dam-EMD en Dam signalen (log2 (Dam− EMD/Dam)) in klok+/+ en klok−/-hMSCs voor elke 2-kb bin met behulp van het bamCompare programma in deepTools (Versie 2.5.4-2-5ee467f) software. Vervolgens implementeerden we het R-pakket voor hidden Markov-modellen met T-emissies (hmmt) (Versie 0.1), om LADs (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R) te identificeren.

om de DamID− signalen in LAD− regio ‘s tussen klok+/+ en klok−/− hMSCs te vergelijken, hebben we lad− regio’ s die zijn geïdentificeerd in klok+/+ en klok−/ – hMSCs samengevoegd in union-regio ‘ s en het relatieve DamID-signaal berekend (DamID-signaal in klok – / – hMSCs minus DamID-signaal in klok+/+ hMSCs) voor elke lad-regio van de Unie. Vervolgens werden de relatieve DamID-signalen voor LAD-regio ‘ s uitgezet met behulp van het R-package-RIdeogram (versie 0.2.2), zoals weergegeven in aanvullende informatie, Fig. S4d.97

ChIP-qPCR en ChIP-seq

kortom, 1 × 106 CLOCK+/+ en CLOCK−/− hMSCs werden gecrosslinkt in 1% (vol / vol) formaldehyde in PBS gedurende 8 min bij kamertemperatuur, en de reactie werd beëindigd door incubatie met 125 mM glycine gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Vervolgens werden de monsters nog eens 10 minuten op ijs gelyseerd. Na sonicatie in covaris S220 focused-ultrasonicator (Covaris) en centrifugatie gedurende 10 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C, werden supernatanten ‘ s nachts bij 4 °C geïncubeerd met eiwit a Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, 10004D) geconjugeerd met een anti-klok antilichaam, een anti-H3K9me3 antilichaam of konijn IgG. Vervolgens werden elutie en omgekeerde crosslinking uitgevoerd bij 68 °C gedurende 2 uur in een thermomixer. Dan, werd DNA geà soleerd via phenol-chloroform-isoamyl alcohol extractie en ethanolprecipitatie. Gezuiverd DNA werd onderworpen aan qPCR voor de evaluatie van klok of h3k9me3 bezetting bij herhaalde opeenvolgingen. De verrijkte fragmenten werden gebouwd in bibliotheken zonder de integratie van spike-in controles via KAPA Hyper Prep Kits met PCR Library Amplification / Illumina serie (KK8504, New England Biolabs) volgens de instructies van de fabrikant. Alle experimenten werden ten minste twee keer uitgevoerd met vergelijkbare resultaten. Statistische significanties werden beoordeeld door een T-test van een tweestaart ongepaarde Student.

ChIP-seq gegevensverwerking

voor de verwerking van H3k9me3 ChIP-seq gegevens werden Ruwe reads bijgesneden met Trim Galore software (Versie 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmed reads werden in kaart gebracht aan het menselijk HG19-genoom van UCSC met behulp van Bowtie 2 (Versie 2.2.9).96 Dubbele reads werden verwijderd met de Markduplicaten.jar programma in Picard Gereedschap. Vervolgens werden reads gesorteerd met SAMtools (versie 1.6). Om het effect van het rangschikken van bias en diepte te minimaliseren, werden verwerkt leest van drie replicaten voor elke steekproef samengevoegd. Dan, werd hetzelfde aantal (130 miljoen) van hoogwaardige leest voor elk celtype willekeurig geselecteerd voor stroomafwaartse analyse. Om de Spaander-seq signalen te visualiseren, berekenden wij de genormaliseerde gelezen tellingen door de rpkm-waarden voor elke bin 10 bp te bepalen. Voor h3k9me3 peak calling, SICER (versie V1. 1) werd gebruikt met de parameter “-w 200-g 3”.98 alleen de zogenaamde h3k9me3 pieken met een cutoff FDR van 1% of hoger werden behouden.

voor de identificatie van “h3k9me3 bergen” werd het h3k9me3 signaal in tellingen per miljoen (CPM) in elke h3k9me3 piek berekend. Wij rangschikten toen de pieken van H3K9me3 in de Orde van het verhogen van h3k9me3 signaal en plofte de Spaander van h3k9me3-seqbezetting in klok+/+ en klok−/− hMSCs, zoals getoond in aanvullende informatie, Fig. S4f. deze percelen lieten een duidelijk punt zien waar het h3k9me3 bezettingssignaal snel begon toe te nemen. Vervolgens werden de buigpunten van deze krommen bepaald. Verder definieerden we h3k9me3 pieken boven de buigpunten als “h3k9me3 bergen” en h3k9me3 pieken onder die punten als typische h3k9me3 pieken.

ATAC-seq

ATAC-seq werd uitgevoerd zoals eerder beschreven.99 in het kort werden in totaal 50.000 cellen tweemaal gewassen met PBS en geresuspendeerd in 50 µL lysis buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1% (v/v) Nonidet P40 substituut). De suspensie van kernen werd vervolgens gecentrifugeerd bij 500 × g gedurende 10 min bij 4 °C, gevolgd door de toevoeging van 50 µL transposeringsreactiemix (10 µL 5 × TTBL-buffer, 4 µL tte-mix en 36 µL nucleasevrij H2O) uit een TruePrep DNA Library Prep Kit V2 voor Illumina (Vazyme Biotech). De monsters werden vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd. De bibliotheken werden toen vergroot en gezuiverd gebruikend de de Bibliotheekvoorbereidingsuitrusting V2 van TruePrep DNA voor Illumina (Vazyme Biotech). De bibliotheekkwaliteit werd beoordeeld met behulp van een fragment analyzer. Tenslotte werden bibliotheken gesequenced op Illumina HiSeq X-Ten platforms met gepaarde-end sequencing met 150-bp leeslengtes.

ATAC-seq gegevensverwerking

voor de verwerking van ATAC-seq gegevens werden Ruwe reads bijgesneden met Trim Galore software (Versie 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmed reads werden in kaart gebracht aan de UCSC human hg19 genoom met behulp van Bowtie 2 (Versie 2.2.9) met de parameter “- X 2000-N 1-L 25-no-mixed-no-discordant-t”.96 duplicaten werden verwijderd met de Markduplicaten.jar programma in Picard Gereedschap. Dan, reads werden gesorteerd met SAMtools (versie 1.6) software. Vervolgens werden verwerkt leest van drie replicaten voor elk monster samengevoegd. Om de ATAC-signalen te visualiseren, hebben we elk gelezen met 250 bp uitgebreid en de gelezen tellingen genormaliseerd met de RPKM-waarde voor elke 10-BP bin. Voor Atac peak calling werd MACS2 (versie 2.1.1.20160309) gebruikt met de parameter “–nomodel –shift 0 –extsize 250 –call-summits”.100 alleen Atac-pieken met q-waarden < 0,01 werden behouden. ATAC-pieken geïdentificeerd in klok+ / + maar niet in klok – / – hMSCs werden gedefinieerd als” gesloten “ATAC− pieken; ATAC− pieken geïdentificeerd in klok – / – maar niet in klok+/+ hMSCs werden gedefinieerd als” geopende ” ATAC-pieken. Schatting van de genomische verdeling van de gebruikte ATAC-pieken annotatePeaks.pl programma in homer software.101

beoordeling van de reproduceerbaarheid van de sequentiegegevens

om de reproduceerbaarheid van de H3k9me3-ChIP-seq-en ATAC-seq-gegevens te evalueren, werd de Euclidische afstand tussen de replicaten als volgt berekend: reads werden geteld en genormaliseerd door de RPKM op een 2-kb bin grootte. Vervolgens werd de Euclidische afstand berekend in R (versie 3.5.1) om de reproduceerbaarheid te evalueren. Lagere Euclidische afstanden betekenen hogere correlaties. Om de reproduceerbaarheid van DamID-seq-gegevens te evalueren, werd hoofdcomponentanalyse (PCA) uitgevoerd in R (versie 3.5.1). Om de reproduceerbaarheid van RNA-seq gegevens te evalueren, werden de verspreidingsdiagrammen getrokken gebaseerd op de geregulariseerde logaritme (RLOG)-genormaliseerde gelezen telling met DESeq2, en de Pearson correlatiecoëfficiënt tussen replicaten werd berekend.

dierproeven

voor analyse van teratoomvorming, NOD / SCID muizen (6-8 weken oud, gekocht bij Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd) werden geïnjecteerd met 3 × 106 klok+/+ of klok− / − hESCs in een Matrigel: mTeSR (1:4) oplossing. Teratomen werden 8-12 weken na injectie geoogst voor verdere analyse.

voor hmsc-transplantatietests werd 1 × 106 CLOCK+/+ of CLOCK− / − hMSCs, getransduceerd met Lentivirussen met Luc-expressie, geïnjecteerd in de TA-spier van naakte muizen (6-8 weken oud). Muizen werden vervolgens behandeld met D-luciferin (LUCK-1G, GoldBio) en imaged met een Ivis Spectrum imaging systeem (Xenogen, Caliper, Waltham, MA, USA). Bioluminescentie beelden werden verkregen in “auto” modus. Elke groep had zes biologische replicaten. Statistische significanties werden beoordeeld door een T-test van een tweestaart ongepaarde Student.

voor de veroudering-geassocieerde klokniveaudetectie werden muizen van verschillende leeftijden (jong, 1 maand, n = 5 muizen; oud, 15 maanden, n = 10 muizen) geëuthanaseerd en werden de gewrichten verzameld voor RT-qPCR analyse. Statistische significanties werden beoordeeld door een T-test van een tweestaart ongepaarde Student.

om te beoordelen of lentivirale toediening van CLOCK verouderingsgerelateerde syndromen kon verlichten, werden lentivirussen met Luc-expressie (n = 14 muizen) of CLOCK (n = 13 muizen) geïnjecteerd in de gewrichtsholtes van 18 maanden oude muizen (gekocht bij SPF (Beijing) Biotechnology) en aangevuld na 8 weken injectie. Loopbandexperiment werd uitgevoerd op een tijdstip van 15 weken na de eerste injectie van Lentivirussen met expressie van Luc of klok. In detail werden muizen getraind op een loopband (SA101, SANS) bij een helling van 5° gedurende 3 dagen gedurende 20 min per dag, met een snelheid van 0 tot 20 m/min. Op de testdag liepen de muizen op de loopband met een beginsnelheid van 0 m/min, waarna de snelheid met 2 m/min werd verhoogd tot 20 m / min. De hele looptijd was vastgesteld op 20 min. De frequentie van milde elektrische schokstimulans werd geregistreerd en geanalyseerd (Luc, n = 14 muizen; klok, n = 13 muizen). Micro-CT-scanning werd 16 weken na de eerste injectie uitgevoerd (Luc, n = 14 muizen; klok, n = 13 muizen). Muizen werden vervolgens geëuthanaseerd en de gewrichten werden verzameld voor histologische beoordeling (Luc, n = 14 muizen; klok, n = 13 muizen) en mRNA kwantificering (Luc, n = 12 muizen; klok, n = 12 muizen). Statistische significanties werden beoordeeld door een T-test van een tweestaart ongepaarde Student.

histologie en immunohistochemie

voor histologische analyse werden geoogste muizengewrichten gefixeerd met 4% PFA gedurende 2 dagen en ingebed in paraffine na ontkalking gedurende 14-21 dagen. Secties (5 µm) werden gekleurd met fast green FCF (0,02%) en safranine O (0.1%) volgens de instructies van de fabrikant.

immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd met behulp van de DAB-kleuringmethode zoals eerder beschreven, met enkele wijzigingen.33,34,102 eerst werden de objectglaasjes gedeparaffiniseerd en gerehydrateerd met behulp van xyleen en verschillende concentraties alcohol. Antigeenherwinning werd uitgevoerd met trypsine (ZLI-9010, ZSGB-BIO) – vertering gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Waterstofperoxide (3%) werd gebruikt om de endogene peroxidase-activiteit te blokkeren door gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. De objectglaasjes werden vervolgens Geblokkeerd met 10% donkey serum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en geïncubeerd met een anti-P16-antilichaam (Ab54210, Abcam, 1:200) bij 4 °C ‘ s nachts en met een secundair antilichaam (PV-6002, ZSGB-BIO) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur voordat DAB-kleuring (ZLI-9017, ZSGB-BIO).

ethische verklaringen

de bij deze studie betrokken experimenten volgden de principes voor het aanvraagformulier voor ethische goedkeuring voor onderzoek met dieren en werden vooraf goedgekeurd door de Institutional Animal care and Use Committee van het Instituut voor zoölogie (Chinese Academie van Wetenschappen). De muizen werden verdoofd met isofluraan en er werd euthanisatie uitgevoerd met CO2, gevolgd door cervicale dislocatie.

statistische analyse

statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van Graph-Pad Prism-Software. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± SEM of SD. Vergelijkingen werden uitgevoerd met tweestaart unpaired Student ‘ S t-test. P-waarde (p) < 0,05 werd als statistisch significant gedefinieerd.