Omzetting van het recalcitrante bestrijdingsmiddel chloordecon door Desulfovibrio sp.86 met een omschakeling van ringopening dechlorering naar reductieve sulfidatieactiviteit | Wetenschappelijke Rapporten

isolatie van Desulfovibrio sp.86
genoomanalyse van Desulfovibrio sp.86
Desulfovibrio sp.86 degradeert chloordecon tot bekende omzettingsproducten en een onverwachte zwavelhoudende verbinding
synthese van de chloordecthiolstandaard en bevestiging dat het transformatieproduct F1 identiek is aan chloordecthiol
het vermogen van Desulfovibrio sp.Voor de afbraak van chloordeconetransformatieproducten
onderzoek naar de incubatieomstandigheden die leiden tot bacteriële reductieve sulfidatie
Milieurelevantie van chloordeconreductieve sulfidatie

isolatie van Desulfovibrio sp.86

isolatie van Desulfovibrio sp.86 werd bereikt door het chloordeconenafbrekende consortium 865 met behulp van sulfaatreducerende condities. Aangezien bacterieel consortium 86, in staat chloordecon te transformeren, werd verkregen uit een verrijkt mineraal medium (MM) genaamd MM + 5, aangevuld met chloordecon, werd de belangrijkste chemische samenstelling behouden, maar elektrondonors en acceptoren werden gewijzigd. Verscheidene media formuleringen die worden gebruikt om sulfaat-verminderende bacteriën te verrijken gebruiken organische zuren zoals lactaat, als koolstof en energiebronnen (elektronendonor) en sulfaat dat als eletron-acceptor voor growth15,16,17,18 wordt gebruikt. In deze context werd pyruvaat in het MM + vloeibare medium vervangen door lactaat en werd sulfaat toegevoegd (Mmd vloeibare medium, zie “methoden” sectie). De verrijking werd verspreid op MMD-agar en de bruine Vibrio-achtige bacteriële kolonies (waargenomen onder optische microscoop) werden verder gezuiverd door twee extra plaatstrepen (Fig. S1). Een geïsoleerde bacteriestam bleek identiek te zijn aan Desulfovibrio sp.86 van consortium 86 gebaseerd op 100% identiteiten van hun 16S rRNA genen (1538 bp elk).

genoomanalyse van Desulfovibrio sp.86

het gehele genoom bestaat uit een enkel circulair chromosoom van 3.464.070 bp. CheckM-analyse19, uitgevoerd met 61 genomen en 284 geslachten, geeft aan dat het genoom tot de Deltaproteobacteriën behoort en dat de CheckM-volledigheid 100% is (nul essentiële marker ontbreekt). Het gemiddelde G + C-gehalte voor DNA is 58,06%. Een totaal van 3.342 coderende DNA-sequenties (CDSs) werden voorspeld voor het chromosoom, 4 pseudogenes en 10 Diverse RNAs (misc-RNA), 3 rRNA-operons, en 54 tRNA-genen.

de drie 16S rRNA-genen van Desulfovibrio sp.86 zijn identiek. Hun beste BLAST hits (NCBI) waren van uncultured Desulfovibrio sp. klonen van microbiële brandstofcellen zoals MFC63A04 (GenBank-toetredingsnummer : FJ823865; dekking 98%; identiteit 99,87%)20. Een fylogenetische boom met behulp van de beschikbare 16S rRNA van cultiveerbare bacteriën bevestigde de overeenkomsten tussen Desulfovibrio sp.86 en Desulfovibrio simplex dsm4141 (GenBank 16S rRNA toetredingsnummer: NR_117110; dekking 99%; identiteit 99, 22%; genomische sequentie niet beschikbaar) (Fig. S2) 21. Op genomisch niveau, Desulfovibrio sp.86 staat op de eerste plaats met Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27.774 genoom (GenBank:NC_011883). Niettemin, Desulfovibrio sp.86 deelt slechts 1.408 genen (43%) met D. desulfuricans (meer dan 80% aminozuren identiteit en 80% alignment dekking). Bovendien, de gemiddelde nucleotide identiteiten (ANI) tussen Desulfovibrio sp.De genomen van Desulfovibrio zijn lager dan de 95% Ani-afkapwaarde die algemeen wordt aanvaard voor de afbakening van soorten (Fig. S3) 22. Deze resultaten wijzen erop dat Desulfovibrio sp.86 is hoogstwaarschijnlijk een nieuwe soort van de desulfovibrio phylum. De aanwezigheid van twee superoxide dismutases en één catalase gen is verantwoordelijk voor zijn relatieve zuurstoftolerantie. Zoals verwacht, de Desulfovibrio sp.86 het genoom stelt een uitgebreide gencomplement voor zwavelmetabolisme tentoon, die de wegen van de zwavelademhaling met anorganische bronnen zoals sulfaat, sulfiet, bisulfiet en tetrathionate als elektronacceptoren omvat. Organische zwavelbronnen kunnen worden geleverd door fermentatieproducten van zwavelbiomassa (sulfoquinovose van sulfoquinovosyllipiden) sulfoacetaat, de zwavel niet-proteogene aminozuurtaurine via sulfoacetaldehyde, of alkaansulfonaten23.

Desulfovibrio sp.86 degradeert chloordecon tot bekende omzettingsproducten en een onverwachte zwavelhoudende verbinding

het chloordeconafbrekende vermogen van het geïsoleerde Desulfovibrio sp.86 stam werd onderzocht met behulp van GC-MS (gaschromatografie massaspectrometrie) en LC-HRMS (vloeibare chromatografie hoge resolutie massaspectrometrie) technieken in groeiomstandigheden met succes toegepast voor Desulfovibrio sp.86 isolatie (Mmd vloeibaar medium). Na2S werd gebruikt als reductiemiddel en een anaërobe N2/H2 (98/2; V/V) atmosfeer werd toegepast met behulp van een handschoenenkastsysteem. Deze incubatieomstandigheden leidden tot het volledig verdwijnen van het chloordeconesignaal in GC–MS en LC-HRMS, en resulteerden in vergelijkbare GC–MS en LC-HRMS TP-profielen als die verkregen met Citrobacter sp.866: monohydrochlordecon A1, pentachloorindeen B1, tetrachloorindenes B3-B4 en polychloorindenecarbonzuren C1-C2 en C3-C4 (Fig. 1 bis, b). In het handschoenenkastsysteem werden bacterieculturen uitgevoerd met glazen flacons van 100 mL met een hydrofobe poreuze film om gasuitwisseling mogelijk te maken en verontreiniging te voorkomen. Deze incubatievoorwaarde werd beschouwd als” vernieuwde atmosfeer ” – voorwaarde (RA). In dit systeem werd de atmosfeer regelmatig vernieuwd met N2 / H2 (98/2; V / V) en de doos werd niet thermostatisch geregeld zodat de temperatuur varieerde tussen 25 en 33 °C. Om de groei-en afbraakomstandigheden beter te beheersen, werd Desulfovibrio sp.86 culturen werden in MMD medium geplaatst met behulp van 100 mL glazen flacons, verzegeld met butylrubber septa, in een oven bij 30 °C. verzegelde flacons werden aanvankelijk gespoeld met N2/H2 (98/2; V/V) gas om anaerobiose te verzekeren. Deze incubatievoorwaarde werd beschouwd als” beperkte atmosfeer ” voorwaarden (CA).

na zes weken incubatie met chloordecon was het bestrijdingsmiddel niet langer detecteerbaar met dezelfde analysetechnieken. Tegelijkertijd verscheen een enkele Onbekende gechloreerde verbinding genaamd F1. Het was alleen detecteerbaar via GC-MS (25,6 min) (Fig. 1c). Net als in de eerder gerapporteerde culturen van chloordeconededegradatie5, 6, verscheen de belangrijkste chloordeconetransformatie tijdens de stationaire fase (Fig. 1e). Aangezien bij LC-HRMS geen zichtbare gechloreerde piek kon worden waargenomen (Fig. 1d), baseerden wij de structurele opheldering van F1 op de interpretatie van GC-MS gegevens (Fig. 1f). Aangenomen dat het hogere isotopische patroon gecentreerd op m / z 507.8 het moleculaire ion bevatte, stelden we twee mogelijke neutrale formules voor F1, C10Cl10O2H2 en C10Cl10SH2 voor. In-source fragmenten waren zeer vergelijkbaar met die waargenomen in polychloor bishomocubaan gebaseerde structuren, waaronder chloordecon, hydrochlordecones,chloordecol en mirex5,6, 24. Inderdaad, de isotopische patronen op m / z 201.0, 235.9 en 271.9 vermoedelijk voortgekomen uit de bekende in-source bishomocubane retrocyclodimerisatie en kwam overeen met positief geladen C5-fragmenten. Vergelijking met isotopensimulaties beperkte de mogelijkheid tot de volgende radicale ionen: +· +· en +·, met n = 0,1. Deze laatste bisoxygeneerde generieke formule bleek zeer onwaarschijnlijk omdat er een gem-diolfunctie of een gem-chloorhydrinedeel op de cyclopentenylring moest aanwezig zijn die bestand moest zijn tegen de zware GC-chromatografische omstandigheden (> 200 °C). In plaats daarvan concludeerden we dat een zwaveldeel, d.w.z. een thiol functie, was waarschijnlijk aanwezig op de bishomocubane polycycle. We stelden voor F1 de structuur afgebeeld in Fig. 2a en suggereerde de naam chlordecthiol, de zwavelanaloog van chloordecol (chloordecone alcohol).

synthese van de chloordecthiolstandaard en bevestiging dat het transformatieproduct F1 identiek is aan chloordecthiol

om de structuur van F1 te bevestigen, werd de standaard chloordecthiol chemisch gesynthetiseerd en volledig gekarakteriseerd. Om chemische reductieve sulfidatie van chloordecon te bereiken, waren twee stappen nodig. De eerste bestond uit de omzetting van de gem-diol-functie van chloordecon in evenwicht met de overeenkomstige ketonvorm20,25 in de zwavelanaloog, d.w.z. gem-thiol/thiocarbonylgroep. Om deze stap uit te voeren, worden fosforhoudende zwavelreagentia over het algemeen toegepast 26,27. Hier gebruikten we fosfor decasulfide (P4S10) ook wel Berzelius reagent27,28 genoemd volgens het protocol van Zaidi en collega ‘ s die met succes camphorthiol29 synthetiseerden (Fig. 2 bis). De tweede stap bestond uit de reductie van de gem-thiol intermediate met behulp van NaBH4. Na zuivering werd een witte vaste stof verkregen met een totaal rendement van 73% (Fig. 2 bis). 1D – en 2D-NMR analyse bevestigde de chlordecthiol structuur: (i) twee 1H signalen integreert elk voor één proton en aan elkaar gekoppeld (δ 3.78 ppm, d, J = 5.5 Hz en δ 2.01 ppm, d, J = 5.5 Hz), met een aan δ 3.78 ppm gecorreleerd aan een 13C-signaal verschoven downfield (δ 55.1 ppm) in HSQC experiment dat perfect account voor de CH-helft naast de thiol-functie en (ii) een totaal van zes zichtbaar 13C signalen reflecteren het vlak van symmetrie behouden in de huidige bishomocubane structuur (Fig. 2a, vijgen. S19-23). Hoewel in microbiële transformatie, kon F1 niet worden ontdekt gebruikend LC-HRMS hulpmiddel in de ontwikkelde voorwaarden, verstrekte een geconcentreerde steekproef van de synthetische standaard chloordecthiol een significant signaal. De aanwezigheid van een zwavelatoom en de verwachte neutrale formule C10Cl10SH2 werden bevestigd (Fig. 2c, d), en de ruwe formules C10Cl10O2H2 werd uitgesloten (Fig. 2b). Ten slotte toonde de analyse van GC-lidstaten de perfecte overeenkomst aan (d.w.z., dezelfde retentietijd van 25.6 min en dezelfde in-source massaspectra Fig. S6) tussen de synthetische standaard en TP F1, dus zeker toewijzen als chloordecthiol. Inderdaad, F1 vertegenwoordigt het eerste lid van een nieuwe familie van chloordecon TPs bezit voor de eerste keer een zwavelatoom.

het vermogen van Desulfovibrio sp.Voor de afbraak van chloordeconetransformatieproducten

verbindingen A1, B1, C1-C2 en F1 die representatief zijn voor de vier families van TPs die mogelijk gevormd zijn in aanwezigheid van Desulfovibrio sp.86 werden gesynthetiseerd volgens chemische protocollen die eerder werden gerapporteerd 6 en hierin ontwikkeld voor F1. Elk van hen werd geïncubeerd in aanwezigheid van Desulfovibrio sp.86 culturen onder omstandigheden waarvan is aangetoond dat ze reductieve sulfidatie bevorderen (verzegelde flacon; CA voorwaarden) of dechlorering met ringopening (open flacon; RA voorwaarden). Dual GC-MS en LC-HRMS monitoring van alle monsters werd uitgevoerd.

na een incubatietijd van één maand onder CA-omstandigheden werd 10-monohydrochlordecon A1 volledig omgezet in twee onbekende gechloreerde verbindingen die nauwelijks gescheiden werden met GC-MS (retentietijden: 24,3 min F2 en 24,5 min F3, Fig. 3, vijgen. S7–S11). Ze toonden een identiek in-source massaspectrum dat sterk leek op het F1 fragmentatiepatroon (Fig. S8). Alle gedetecteerde in-source fragmenten draaide zich om één chlooratoom minder dan hun analogen in F1 massaspectrum te bezitten. De verbindingen F2 en F3 werden dus verondersteld diastereoisomeren van 10-monohydrochlordecthiol te zijn (Fig. 3c). Dit werd bevestigd door de chemische synthese van de twee 10-monohydrochlordecthiolstandaarden uit 10-monohydrochlordecon A1 volgens de procedure die eerder werd toegepast voor de synthese van chloordecthiol F1 (Fig. S24-27). Deze chemische normen hadden dezelfde retentietijden (24,3 en 24,5 min) en dezelfde massaspectra vergeleken met de biologische F2 en F3 (Fig. S8). TPs B1, C1-C2 en F1 bleven onveranderd, zelfs na zes maanden incubatie met Desulfovibrio sp.86 onder CA voorwaarden.

na zes maanden incubatie onder RA-omstandigheden, werd chloordecthiol F1 gedeeltelijk omgezet in 10-monohydrochlordecthiolen F2 en F3, en twee andere onbekende gechloreerde soorten gedetecteerd met behulp van GC-MS, genaamd F4 (retentietijd: 17,9 min) en F5 (retentietijd: 26,6 min) (Fig. 3d, Fig. S12). Geen van deze twee verbindingen gaf een detecteerbaar signaal in LC-HRMS. GC-MS-analyse toegelaten om C10Cl6SH4 als ruwe formule voor F4 voor te stellen (Fig. S14), en C11Cl10SH4 voor F5 (Fig. S15). Methylchlordecsulfide werd chemisch gesynthetiseerd en volledig gekarakteriseerd door NMR (Fig. S28-31). De perfecte correspondentie van GC-retentietijden en GC-massaspectra van methylchlordecsulfide en biologisch F5 (Fig. S13) bevestigt zijn gepostuleerde identiteit. Opmerkelijk, de structuur van F5 (vijg. 3d) vertegenwoordigt een S-gemethyleerde vorm van F1. De exacte aard van F4 blijft onduidelijk (zie SI-aanvullende tekst). Alle andere TPs bleven ongewijzigd onder RA-omstandigheden.

samengevat onderging A1 (gevormd in Ra-omstandigheden) een reductieve sulfidatie net als chloordecon; onder beide incubatieomstandigheden leek polychloorindenes (B1 en C1-C2) niet afbreekbaar door Desulfovibrio sp.86, terwijl F1 (geproduceerd onder CA-omstandigheden) kan worden omgezet onder RA-omstandigheden (Fig . 3).

onderzoek naar de incubatieomstandigheden die leiden tot bacteriële reductieve sulfidatie

om de fysisch-chemische of fysiologische parameters die van invloed zijn op de transformatieroutes van chloordecon in de culturen van Desulfovibrio sp.86, GC-MS monitoring (B1 en F1 aanwezigheid als bewijs van RA en CA voorwaarden, respectievelijk) werd gekozen.

twee zwavelhoudende anorganische verbindingen, de reductant Na2S en de elektronenacceptor Na2SO4, waren aanwezig in het oorspronkelijke vloeibare Mmd-medium. Een eerste reeks experimenten in gesloten flacons met substitutie van Na2S door andere al dan niet zwavelhoudende reducerende stoffen, namelijk cysteïne en titaan(III) citraat (TiCi), leidde tot een vergelijkbaar niveau van chloordecthiol F1 (Tabel 1). Sporen van TP B1 werden ook waargenomen in alle experimenten, inclusief Na2S, de positieve controle (Tabel 1).

Tabel 1 invloed van het reductiemiddel op het chloordecon TP-profiel.

een tweede reeks experimenten werd ontworpen met Na2S als reductiemiddel en alternatieve zwavel-gebaseerde elektron acceptoren in verzegelde flesjes (Tabel 2). Het gebruik van met 90% 34S verrijkt anorganisch sulfaat resulteerde in een chloordecthiolproduct met een vergelijkbaar 34S-verrijkingsniveau (90% 34S-F1/10% F1, Fig. S16). GC-lidstaten analyse van cultuur headspace openbaarde ook de aanwezigheid van H234S en H3C34SH (Fig. S16), waaruit blijkt dat Desulfovbibrio sp.86 geproduceerd H2S uit sulfaat. Deze gassen werden in CA-omstandigheden in de kweekruimte gedetecteerd met behulp van MMD-medium, terwijl ze in RA-toestand die overeenkwam met de atmosfeer van het handschoenenkastje afwezig waren in de kweekruimte (Fig. S17). De afwezigheid van sulfaat remde Desulfovibrio sp niet.De groei heeft echter geleid tot de vorming van B1 (Tabel 2)5. De remplacement van sulfaat door sulfiet, bisulfiet of thiosulfaat leidde in alle gevallen tot de vorming van chloordecthiol F1.

Tabel 2 invloed van de op zwavel gebaseerde elektronenacceptor op het chloordecon TP-profiel.

een derde reeks experimenten met potten onderzocht het effect van de aard van de gasfase in contact met de cultuur. Tussen de voorwaarde Ra gebruikend open flesjes in handschoendoos en de voorwaarde CA gebruikend verzegelde flesjes in oven, verschilden verscheidene parameters (atmosferische aard en volume, temperatuur). Met behulp van een jar-systeem met meerdere flacons, bestuderen we selectief het effect van atmosferische vernieuwing op chloordeconetransformatie door Desulfovibrio sp.86 in Mmd medium. In beide gevallen werden open flacons met hydrofobe poreuze films geplaatst in potten die aanvankelijk waren gespoeld met een geselecteerd gas. Alle potten werden geïncubeerd bij 30 °C. Sommige werden meerdere malen gespoeld, om het handschoenenkastsysteem na te bootsen, terwijl andere gesloten werden gehouden.

potten 1-4 bevatten twee identieke open flacons gevuld met MMD, chloordecon en Desulfovibrio sp.86 entmateriaal en een negatieve abiotische controle. Onder hen werden twee potten tweemaal per week gespoeld, pot 1 met (N2 / H2 (98/2; V / V)), Pot 2 Met N2 (Fig. 4a), terwijl potten 3 en 4, aanvankelijk gespoeld met N2 en (N2 / H2 (98/2; V / V)) respectievelijk werden niet-ingevroren gelaten (Fig. 4b).

de laatste twee potjes (pot 5 en 6) bevatten drie open flacons gevuld met MMD, chloordecon en Desulfovibrio sp.86, plus een cultuur zonder sulfaat. Deze potten werden aanvankelijk gespoeld met (N2 / H2 (98/2; V / V)) en bleven gedurende 2 maanden onvervuld (Fig. 4c).

parallel aan de potten, twee verzegelde flacons gevuld met MMD zonder sulfaat, chloordecon en Desulfovibrio sp.86 werden gespoeld met exemporarily gesynthetiseerde H2S (Fig. S4).

na incubatie gedurende twee maanden bij 30 °C werd TP B1 gedetecteerd in flacons die in de gespoeld potten 1 en 2 waren geplaatst (tabel 3a), terwijl TP F1 alleen werd gevonden in flacons die in niet-geplette potten 3 en 4 waren geplaatst (tabel 3b). Bij de abiotische controles was geen TP aanwezig. In potten 5 en 6 was F1 aanwezig in zowel sulfaat-als sulfaatvrije Desulfovibrio sp.86 open culturen (tabel 3c). Op dezelfde manier, Desulfovibrio sp.In 86 sulfaatvrije culturen, gespoeld met H2S, werden significante niveaus van F1 TP aangetoond, terwijl er bij de negatieve controle geen transformatie werd waargenomen (tabel 3d).

Tabel 3 Invloed van de gasatmosfeer op het chloordecon TP-profiel.

een aanvullend chemisch experiment werd uitgevoerd om de invloed van H2S op de chloordeconetransformatie te beoordelen. Klassieke chemische protocol waardoor B en C TPs vorming, werd toegepast (chloordecon, titanium citraat, vitamine B12, water). Onder N2 atmosfeer werden B en C TPs verkregen, maar onder H2S atmosfeer werd alleen A1 geproduceerd (Fig. S18).

deze resultaten tonen duidelijk aan dat de vorming van chloordecthiol F1 een gesloten incubatiesysteem met een reducerende atmosfeer vereist. H2 als initiële gasatmosfeer is echter niet verplicht, terwijl de aanwezigheid van H2S vereist is. Chemisch voorkomt de aanwezigheid van H2S het ontchloreren van de ringopening.

Milieurelevantie van chloordeconreductieve sulfidatie

we hebben onze vorige verzameling van met chloordecon verontreinigde milieumonsters op Martinique (acht bodems en twee bedsedimenten) opnieuw onderzocht waarin verschillende niveaus van chloordecon-TPs waren opgesteld6. Onder de nieuwe zwavelhoudende TPs die hier worden gerapporteerd, vonden we aanzienlijke niveaus van F1 in de twee bedsedimenten monsters (927 en 928) bij een concentratie geschat rond 50 µg/kg en 20 µg/kg nat sediment, respectievelijk (tabel S1). Parallel, gegevens van de bacteriële populatiediversiteit die van metabarcoding analyse van deze steekproeven worden uitgegeven (Fig. 5, Fig. S5) werden verwerkt om een hiërarchische clustering van milieumonsters volgens hun taxonomische samenstelling6 te recupereren. Het werd opgemerkt dat sulfaatreducerende bacteriën veel meer aanwezig waren in bedsedimenten dan in de andere compartimenten, zoals eerder gemeld 30,31,32.

transformatie van het recalcitrante bestrijdingsmiddel chloordecon door Desulfovibrio sp.86 met een omschakeling van dechlorering met ringopening naar reductieve sulfidatieactiviteit