Type III collageen is cruciaal voor collageen I-fibrilogenese en voor normale cardiovasculaire ontwikkeling

resultaten en discussie

ES (J-1) cellen (22) werden getransfecteerd met een doelvector die een Col3a1 genoom DNA-fragment bevat waarin het promotorgebied van het gen en het eerste exon dat het signaalpeptide codeert werden verwijderd (Fig. 1 bis). Gerichte ES cel klonen werden geïdentificeerd door Zuidelijke vlek analyse en gebruikt voor blastocyst injectie (Fig. 1b boven). Mutant muizen werden afgeleid van twee onafhankelijk gerichte ES cel klonen en geïdentificeerd door Southern blot analyse (Fig. 1B lager). Eiwitanalyse van staartcollageen en huidcollageen toonde aan dat heterozygote mutante muizen ongeveer 50% minder type III collageen hebben, terwijl er geen type III collageen werd gedetecteerd bij homozygote mutante dieren (Fig. 1C).

mutante dieren waren vruchtbaar, maar alleen heterozygote muizen waren fenotypisch normaal. Homozygote gemuteerde muizen vertoonden een gemiddelde overlevingskans van 5% bij het spenen, waarbij de meeste sterfgevallen optraden binnen de eerste 48 uur na de geboorte (Tabel 1). De precieze oorzaak van de neonatale letaliteit is niet duidelijk omdat de dode pups werden gekannibaliseerd voordat ze konden worden onderzocht, en lichtmicroscopische histologische analyse van levende homozygote mutanten van pasgeborenen heeft geen grove abnormaliteit aangetoond. Volwassen homozygote gemuteerde muizen leken normaal, behalve dat ze ongeveer 15% kleiner waren dan hun wild-type nestgenoten van hetzelfde geslacht (gegevens niet getoond). De gemiddelde levensduur van de homozygote mutant muizen was echter ongeveer 6 maanden of een vijfde van de normale levensduur. Autopsie toonde aan dat het scheuren van de bloedvaten de belangrijkste oorzaak was van de verkorte levensduur van deze muizen (Tabel 2). De plaatsen van breuk waren sporadisch en meestal geassocieerd met grote bloedvaten. Histochemische analyse werd uitgevoerd om het defect dat de kwetsbaarheid van de bloedvatwand veroorzaakt vinden. Fig. 2 A en B tonen een doorsnede van een normale abdominale aorta. De wand van de aorta bestaat uit intima en media (Fig. 2A, pijl) en adventitia (Fig. 2 A en B, pijlpunten). Medium bestaaatt uit elastische vezels (vijg. 2B, grote pijlen) en gladde spiercellen (Fig. 2B, kleine pijlen) en verstrekt de elasticiteit van de aorta terwijl adventitia hoofdzakelijk type I collageenfibrillen omvat en de verwijding van de aorta beperkt. Fig. 2C toont een dwarsdoorsnede van een ontleden aneurysma van de abdominale aorta van een homozygote mutant muis. De breuk kruiste de media (pijl), wat leidde tot een bloed gevulde kanaal (ster) tussen media en adventitia (pijlpunten) en gedeeltelijk stortte het lumen van de aorta. De adventitia scheurde uiteindelijk elders, en bloed lekte in de buikholte zoals het geval is bij mensen met dodelijke aorta aneurysma (20). De algemene rangschikking van de elastische vezels en de gladde spiercellen (Fig. 2D) was vergelijkbaar met die van de controles (Fig. 2B). De intensiteit en verdeling van extracellulair matrixmateriaal en de donkere kleuring in de adventitia en tussen elastische vezels en gladde spiercellen in de intima van gemuteerde muizen (Fig. 2D) waren vergelijkbaar met die van wild-type controles (Fig. 2B). Onder de lichtmicroscoop werden geen duidelijke afwijkingen van hart en middelgrote en kleine slagaders waargenomen bij mutante dieren (gegevens niet getoond).

naast aneurysma vertoonden gemuteerde muizen frequente darmvergroting en incidentele darmruptuur, resulterend in de dood (Tabel 2). Ongeveer 60% van de homozygote gemuteerde muizen vertoonde huidlaesies, waarvan de ernstigste zich voordeed als een open wond van ≈1 cm lengte in het schoudergebied, die volledig in de huid doordrong en onderhuids weefsel blootlegde (Fig. 3). De wonden waren niet te wijten aan gevechten tussen dieren, omdat ze werden waargenomen bij dieren die afzonderlijk gekooid. Lichtmicroscopische analyse van huid, darm en andere inwendige organen, waaronder lever en Long, heeft geen openlijke afwijkingen bij mutante dieren aangetoond (gegevens niet getoond).

om de structurele defecten in mutante dieren te definiëren, werden elektronenmicroscopische analyses van aorta en hart uitgevoerd. Fig. 4 toont aan dat de collageenvezels zich tussen gladde spiercellen of tussen gladde spiercellen en elastische vezels (Fig. 4A, pijlen) waren afwezig of ernstig verminderd in de media van mutante aorta (Fig. 4B, pijlen). Het meest opvallend, in de adventitia waar de meerderheid van collageen type I is, was de diameter van collageenfibrillen van de mutante aorta zeer variabel (vergelijk Fig. 4 D tot en met C). Toen de fibrillen werden geteld en de diameter van deze fibrillen werd gemeten in een bepaald gebied van de adventitia, vonden we dat het aantal fibrillen in mutanten was teruggebracht tot ongeveer een derde van die van wild-type terwijl de gemiddelde diameter van de fibrillen in mutanten was ongeveer tweemaal die van wild-type muizen (Fig. 5). Net als bij de aorta, waren de collageenfibrillen tussen epicardium en myocardium verminderd of ontbraken en waren de microvilli van het epicardium onderontwikkeld in het hart van gemuteerde muizen (gegevens niet getoond).

naast het cardiovasculaire systeem, werden de huid, darm, lever, en Long van gemuteerde muizen onderzocht door elektronenmicroscopie. Zoals bij de adventitia van de aorta, fibrillen collageen I in mutante huid (Fig. 4F, pijlen en pijlpunten) waren ongeorganiseerd en waren zeer variabel in diameter in vergelijking met die van wild-type muizen (Fig. 4E, pijlen). Deze verandering werd ook waargenomen in de lever en longen van gemuteerde muizen (gegevens niet getoond). Bovendien waren collageenfibrillen afwezig of sterk verminderd in de submucosa en serosa van gemuteerde darmen (gegevens niet getoond) wat erop wijst dat collageenfibrillen in deze gebieden meestal type III collageenfibrillen zijn.

eerdere studies waarbij gerichte mutaties in Col1a1 -, Col2a1 -, Col5a2-en Col9a1-genen werden geïntroduceerd, hebben belangrijke inzichten opgeleverd in de functie van deze collagenen (24-27). Hier tonen we aan dat type III collageen een cruciale rol heeft in de fibrilogenese, wat een belangrijk onderdeel is van de ontwikkeling van organen zoals het cardiovasculaire systeem, de darm en de huid. Het ontbreken van type III collageen verstoorde de fibrilogenese en resulteerde in een gebrekkige ontwikkeling en functioneel falen van deze organen. Onder fysiologische omstandigheden, is type III collageen niet alleen een essentieel onderdeel van fibrillen in weefsels zoals de media van aorta maar ook een belangrijk regelgevend element in type I collageenfibrilogenese. Onze resultaten suggereren dat type III collageen de diameter van type I collageen fibrillen reguleert, die dient als een mechanisme om te voldoen aan de fysiologische behoeften van verschillende weefsels of van een weefsel in verschillende ontwikkelingsstadia. Het fenotype van type III collageendeficiënte muizen lijkt sterk op de klinische manifestaties van type IV–patiënten met het syndroom van Ehlers-Danlos bij wie de dood het gevolg is van een bloedvat-of intestinale breuk (20). Deze gemuteerde muizen zouden daarom goede diermodellen moeten blijken te zijn voor het begrijpen van deze ziekte en mogelijk het testen van therapeutische benaderingen.