vergelijkende Genomica van Clostridium bolteae en Clostridium clostridioforme onthult soortspecifieke genomische eigenschappen en talrijke veronderstelde antibioticaresistentiedeterminanten

Algemene kenmerken van genomen onthullen intra-en interspeciesvariaties

in totaal werden 1 tot 21 Contig ‘ s gegenereerd uit samenstel van reads uit Illumina (134 tot 185-voudige dekking) voor de zes stammen van C. bolteae (Tabel 1). In totaal werden 10 tot 48 contigs gegenereerd (82 tot 264-voudige dekking) voor de zes stammen van C. clostridioforme. De totale genoomgrootte varieerde tussen soorten en stammen. De grootte van C. bolteae varieerde van 6159 kb Voor stam 90A7 tot 6480 kb voor stam 90B3 met respectievelijk 5833 en 6059 DNA-codering sequenties (CDSs) en vier 16S rRNA genen. De genoomgrootte van C. clostridioforme was kleiner, van 5467 kb Voor stam 90A3 tot 5970 kb voor stam 90A6 met 5231 tot 5916 CDSs, respectievelijk, en vier 16S rRNA genen. De fylogenetische boom gebaseerd op de 16S rRNA sequenties toonde aan dat de bestudeerde C. bolteae en C. clostridioforme nauw verwant waren aan C. hathewayi, C. aldenense, C. citroniae, C. saccharolyticum en C. symbiosum, leden van de Clostridium cluster XIVa van Firmicutes, zoals eerder gerapporteerd (gegevens niet getoond).

genomen van C. bolteae en C. clostridioforme zijn grote genomen, waar genetische redundantie heerst (gegevens niet getoond). De overtollige genen waren betrokken bij een verscheidenheid aan metabole routes, waaronder koolstofmetabolisme, transport, ijzermetabolisme en aminozuurbiosynthese. De verschillen in het aantal CDs ‘ s tussen genomen weerspiegelden variatie in genetische redundantie meer dan winst of verlies van bepaalde functies. Bovendien integreerden genomen mobiele elementen zoals transposons, Insertiesequenties, plasmiden of Fagen (integrase, capside-eiwit,…) die duiden op laterale genoverdracht. Sommigen van hen droegen antimicrobiële resistentiegenen (zie hieronder).

om het pangenoom van de twee soorten te onderzoeken, hebben we de 97.210 CDSs die verkregen werden uit de 12 nieuwe sequenced genomen vergeleken met die van vijf andere genomen (C. bolteae BAA613, C. bolteae WAL-14578, C. clostridioforme CM201.1, C. clostridioforme 2149FAA.1, en C. clostridioforme WAL-7855). Alle CDSs ‘ s werden geclusterd met behulp van het BlastClust algoritme bij hoge stringency, boven een 90% sequence identity cut-off en 90% lengte overlap. In totaal werden 10.530 clusters gevonden. Slechts 2294 (21,78 %) clusters werden gedeeld door de twee soorten.

door alleen genomen te gebruiken die nieuw zijn gesequenced, schatten we het (species) kerngenoom en (stamspecifieke) genen van de zes C. bolteae en de zes C. clostridioforme (Tabel 1). Een totaal van 3714 genen vormden het kerngenoom van C. bolteae. Het aantal stamspecifieke genen in deze soort varieerde van 73 tot 846. In C. clostridioforme, definieerden 3660 genen het kerngenoom. Een totaal van 2409 clusters werden gedeeld door de twee soorten; 1305 genen waren specifiek voor C. bolteae en 1251 voor C. clostridioforme.

C. bolteae 90A7 en 90B8 hadden het grootste aantal unieke genen voor deze soort (respectievelijk 735 en 846). C. clostridioforme 90A8, met 1006 (17 %) unieke genen had het grootste aantal stamspecifieke genen in deze studie. Deze stammen integreerden een groot aantal mobiele elementen. Sommige unieke CDs ‘ en werden geannoteerd als transporters of regelaars. Weinigen van hen waren betrokken bij afweermechanismen (antimicrobiële resistentiegenen..) of metabole routes. De meeste van hen, vaak omgeven door CDSs van fagen of transposons, waren van onbekende functies (gegevens niet weergegeven).

functionele verschillen tussen species in de kern genomen

de uitdaging van onze studie was het leveren van betrouwbare informatie uit Concept genomen. Daarom hebben we onze Analyse gericht op de kern genomen. De classificatie van het CDSs volgens het Clusters van Orthologe groepen (COGs) systeem toegestaan om een overzicht van de functies weergegeven door de twee soorten te geven. De kern genomen van C. bolteae en C. clostridioforme werd verrijkt (meer dan 7% van het totaal aantal overeenkomende COG ‘ s) in COG-categorieën K, E, G en R met betrekking tot transcriptie (309 en 290 CDSs), Aminozuurtransport en-metabolisme (335 en 276 CDSs), Koolhydraattransport en-metabolisme (431 en 425 CDSs) en algemene functievoorspelling (366 en 331CDSs) (Tabel 2).

terwijl C. bolteae en C. clostridioforme zijn fenotypisch gerelateerd, het patroon van functies verkregen door verandering in COG annotatie verschilde tussen de twee soorten (Tabel 2). 30 extra CDSs van de Nucleotide transport en metabolisme (F), 97 CDSs van de aminozuur transport en metabolisme (E) en 79 CDSs codering voor Signaaltransductiemechanismen (T) categorieën waren specifiek voor C. bolteae. 40 CDSs codering voor de celwand/membraan / envelop biogenese (m), 50 CDSs voor replicatie, recombinatie en reparatie (L) en 18 CDSs voor de lipide transport en metabolisme (I) categorieën waren specifiek voor C. clostridioforme. Verschillen tussen metabole routes in C. clostridioforme en C. bolteae lijken groot genoeg te zijn om de afbakening van de soort te ondersteunen.

onder de koolhydraatroutes hadden C. bolteae en C. clostridioforme verschillende systemen voor de assimilatie van lactose, die verschillen in hun fosforyleringsstatus, intermediaire metabolieten en bio-energetica (aanvullend dossier 1: tabel S1). Genen die coderen voor een β-galactosidase, dat lactose hydrolyseert en glucose en galactose oplevert, werden gevonden in beide soorten. Een alternatieve lactose katabole route, het lactose / cellobiose afhankelijke fosfotransferasesysteem (lac / cel-PTS) werd gevonden in bijna alle genomen van C. bolteae. Het Lac / cel-PTS-operon, eerder beschreven in C. acetobutylicum, bestaat uit genen voor de 6-fosfo-β-galactosidase, fosfoglyceraatmutase en lichenan operon transcriptionele antiterminator en uit twee kopieën van genen voor de lactose/cellobiose familie IIC, IIB en IIA componenten. Door een dergelijk systeem wordt lactose gefosforyleerd aan de C-6 koolstof en wordt het geïnternaliseerde lactose-6-fosfaat afgebroken in galactose-6-fosfaat en glucose door de 6-fosfo-β-galactosidase. Bovendien ontbraken het gen voor de 6-fosfo-β-galactosidase en de genen voor de lactose/cellobiose-familiecomponenten in C. bolteae 90A7. Het is waarschijnlijk dat dit systeem, induceerbaar door cellobiose of lactose en gereguleerd door verschillende onderdrukkers (beschreven in andere Grampositieve bacteriën ) verantwoordelijk is voor het lactose-negatieve fenotype in C. bolteae . Door gebruik te maken van ons annotatiesysteem ontdekten we een galactose operonrepressor (GalR) onder lacI-familie regulatoren, in C. clostridioforme (alle, behalve 90A8), maar niet in C. bolteae. De laboratoriumexperimenten zijn nodig om te bepalen hoe de transcriptiefactoren van de twee species voorkeuren in het gebruik van bepaalde koolhydraten over anderen bemiddelen.

andere onderscheidende kenmerken tussen de twee soorten waren CDSs-codering voor secundaire metabolieten biosynthese en transport en katabolisme, die alleen werden gevonden in C. bolteae (Tabel 2).

interessant is dat het aantal genen van de celmotiliteit en secretiecategorie (n) (34 en 18 CDSs) verschillend was tussen de twee soorten. Onder hen, vonden we CDSs coderen flagella motiliteit erkend als essentiële virulentie factoren voor de meeste motiele pathogenen. In totaal vertegenwoordigden vierentwintig genen (46 clusters + 3 wezen) het flagellaire operon in de genomen van C. bolteae. Onder hen, onthulden de genen voor flagellin (fliC) en flagellar GLB (fliD), één van de veelvoudige cel-oppervlakte adhesins van de bacteriën, clusterspecificiteit en microevolution. Genen die coderen voor fliD werden vertegenwoordigd door één cluster en twee extra genen in C. bolteae 90A7 en 90B8. FliC sequenties van C. bolteae 90A9, 90B3 en 90B8 vormden één cluster, die van 90A5 en 90B7 geclusterd in een andere groep, en sequenties van C. bolteae 90A7 bleven wezen (unieke genen) na clustering (Fig. 1). Ze waren nauw verwant aan flagellinsequenties van C. citroniae en C. hathewayi, andere Clostridium spp. van de groep XIVa, af en toe geïsoleerd van menselijke infecties. Bovendien, C. bolteae 90A9 en 90B3 deelden een tweede operon van slechts 19 genen in syntheny, waaronder een flagellingen (flaA) die nauw verwant is aan die van C. clostridioforme (63% identiteit). Gebaseerd op geconserveerde residuen L87, Q88, R89 en Q96 kritisch voor TLR5 signalering en flagellin polymerisatie, werden deze proteã nen voorspeld pro-inflammatoire eigenschappen te hebben . In C. clostridioforme codeerden twintig genen (57 andere clusters) georganiseerd in één operon het flagellaire apparaat. FlaA-sequenties van C. clostridioforme behoorde tot een fylogenetische groep nauw verwant aan flagellinopeenvolgingen van eubacterium cellulosovens die van de pens worden geïsoleerd. Over het geheel genomen waren flagellingenen en loci-organisatie gerelateerd aan flagella verschillend tussen soorten (aanvullend bestand 2: Tabel S2 en aanvullend bestand 3: Tabel S3), wat suggereert dat motiliteit, chemotaxis en het optreden van potentiële interacties met het dikke darmslijmvlies soortspecifiek zijn .

op afstand gebaseerde fylogenetische boom van flagellingenen. Waarden op knooppunten kwamen overeen met bootstrappercenten verkregen uit fylogenetische bomen op basis van meerdere sequentieuitlijningen door respectievelijk ClustalW, Tcoffee of Promals. Gen namen en, wees-of clusternummers werden aangegeven

Species differences in pathways for butyrate synthesis

vergelijking van hele genoomsequenties toonde aan dat pathways for butyrate synthesis, die een sleutelrol spelen in de gezondheid van de dikke darm bij de mens, aanwezig waren in C. bolteae en C. clostridioforme.

de twee soorten produceerden butyraat op verschillende en complementaire manieren (Fig. 2, aanvullend bestand 4: tabel S4). Alle C. clostridioforme, met uitzondering van 90A8, bevatten een locuscodering voor de Acetyl-CoA-route (van Acetyl-CoA tot butyryl-CoA), met inbegrip van genen voor de bèta-hydroxylbutyrylCoA-dehydrogenase (hbd), thiolase (thl), crotonase (cro), butyryl-CoA-dehydrogenase (bcd) en twee elektronenoverdrachteiwitten (ETF-Alfa, ETF-bèta) (aanvullend dossier 4: tabel S4). Alleen, C. bolteae 90A8 en C. clostridioforme 2149FAA.1 bevatte een andere vermeende bcd (74.9 % identiteit) in hun genomen (gegevens niet weergegeven). De locus samenstelling en rangschikking waren vergelijkbaar met die in Faecalibacterium prausnitzii, een belangrijke butyraat producent van de menselijke dikke darm . Het Acetyl-CoA pad werd niet gevonden bij C. bolteae. Beide soorten deelden genen voor de twee hydroxy-glutaryl-CoA dehydrogenase (HgCoAd) en de glutaconyl-CoA decarboxylase (Gcd) van de Glutaraatroute die via bcd-genen kan leiden tot crotonyl-CoA en butyryl-CoA .

verschillende routes voor butyraatsynthese die mogelijk aanwezig zijn in genomen van C. clostridioforme en C. bolteae. In vaste lijnen: gevonden in C. bolteae en C. clostridioforme; vetgedrukte gestreepte lijnen: alleen gevonden in C. clostridioforme ; in fijne gestreepte lijnen: alleen gevonden in C. bolteae 90A5 en 90B7 (voor meer details, zie aanvullend bestand 4: tabel S4). Genen (eiwit namen) worden weergegeven. Ato, Acetyl-CoA acetyltransferase; Bcd, butyryl – COA deshydrogenase; Buk, butyraatkinase; But, butyraat-acetoacetaat CoA-transferase ; Cro, crotonase ; Stichting electron transfer proteïne ; Ggd, glutaconyl-CoA-decarboxylase ; Hbd, Acetoacetyl-CoA-reductase ; 4Hbt, 4-hydroxyboterzuur CoA transferase ; HgCoAd, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase ; Ptb, fosfaat butyryltranferase; Thl, thiolase

De uiteindelijke conversie van butyryl-CoA-butyraat kunnen worden uitgevoerd door de butyraat kinase (buk) en de phosphotransbutyrylase (ptb) in beide soorten (Extra bestand 4: Tabel S4). De groep Buk-sequenties van C. clostridioforme vertakt in de omgeving van de BUK-sequentie van C. citroniae op de fylogenetische boom (aanvullend bestand 5: Figuur S1). Buk sequenties van C. bolteae vormden verschillende monofyletische groepen en sequenties verdeeld over de fylogenetische bomen, suggereren polymorfisme en / of functionele variaties van het enzym in deze soort. Andere genen voor transferasen van de lysineroute (ato—alfa en bèta subeenheid; but-acetaat COA transferase), ontdekt in de buurt van de butyraat locus in zes genomen van C. clostridioforme, kunnen worden betrokken als uiteindelijke enzymen. De genen van de 4-aminobutyrate weg (4hbt) kunnen een ander alternatief voor de eindstap in C. zijn. bolteae 90A5, 90B7, WAL14578 en BAA613 .

de butyryl-CoA: acetaat-COA-transferase (but) van de acetyl-CoA-Route, de laatste stap in de butyraatproductie die overheerst in Clostridium XIVa, werd niet gevonden in de genomen van de gemeenschappelijke kern noch in de genomen van de bestudeerde C. bolteae . In de menselijke darm, eerdere studies op colonische isolaten van gezonde individuen hebben aangetoond dat maar de weg overheerst . De verdere studies zijn nodig om het effect van butyraatproductie door de glutarateweg op gezondheid van colonic cellen, in het bijzonder in autisme te beoordelen waar C. bolteae is overvloedig .

Identificatie van antibioticaresistentiedeterminanten

Geneesmiddelenresistentiegenen die niet waren herkend door geautomatiseerde annotatie werden geïdentificeerd door homologisch sequentieonderzoek op ARDB. Resistentiegenen werden voorspeld op een waarde tot 40% identiteit (50% van de positieve substituties) op 70% van de lengte boven de gewoonlijk aanbevolen afkapwaarde (zie lijst in Tabel 3). Vervolgens werden het gengehalte en de genetische organisatie van microbiële resistentieloci van de zes C. bolteae en de zes C. clostridioforme vergeleken met eerdere gegevens verkregen uit C. clostridioforme CM201. 1 in ons laboratorium.

omdat sequentiegebaseerde voorspellingen mogelijk determinanten kunnen identificeren die niet leiden tot antimicrobiële resistentie, werd een gevoeligheidstest uitgevoerd om informatie te verkrijgen over de voorspelde respons van bacteriën op antibiotica. De stammen in deze studie toonden resistentiepatronen, waaronder ampicilline, macroliden, lincomycine en quinolonen, nu gebruikelijk in anaëroben (Tabel 4). Zowel genomische gegevens (CDSs en Annotaties) als fenotypische gevoeligheidstesten werden beschouwd om antibioticaresistentiedeterminanten te identificeren (tabellen 3 en 4). Voorlopige analyses voor het klonen van bepaalde genen werden ook uitgevoerd om hun capaciteit om antibioticaresistentie te verlenen te controleren (zie hieronder).

genen voor resistentie tegen antibiotica gebruikt voor de behandeling van anaërobe infecties

in totaal werden 76 clusters en 21 stamspecifieke genen geïdentificeerd die mogelijk betrokken zijn bij antimicrobiële resistentie (Tabel 3). Het is opgenomen van 42 tot 50 CDSs in C. bolteae en 48 tot 58 CDSs in C. clostridioforme. Van 27 tot 42 CDSs per genomen waren gerelateerd aan geneesmiddelenresistentiemechanismen voor bètalactams, glycopeptiden, macroliden, lincosamiden en metronidazol.

zeven clusters die betrokken zijn bij bètalactamresistentie worden gedeeld of deel uitmaken van het kerngenoom van de twee soorten (Fig. 3). Drie typen bètalactamasen, waaronder Klasse A bètalactamase, klasse C bètalactamase, Klasse D bètalactamase en verschillende metallo-enzymen werden herkend in de twaalf genomen. Alle bestudeerde stammen, geselecteerd op hun resistentie tegen ampicilline, deelden het gen blaCLO1, eerder gevonden in C. clostridioforme CM201.1 (ongepubliceerd), maar de structuur van integrative conjugative element (ICE) waargenomen in CM201.1 werd niet gevonden in de nieuwe gesequenced genomen. Het gen blaCLO1 geeft resistentie tegen aminopenicillinen en carboxypenicillinen in E. coli en de activiteit ervan wordt geremd door clavulanaat en sulbactam. Negen aminozuurveranderingen werden waargenomen in bètalactamasen van C. bolteae 90A9, 90B3 en 90A8. Dit nauw verwante bèta-lactamase werd geflankeerd door insertiesequenties (IS66) en een vermoedelijk gen voor Klasse D bèta-lactamase (COG 2602), ook beschreven in Clostridium sp M62/1 uit de menselijke darmmicroflora (HMP-project). Genen voor klasse C beta-lactamases, eerder gevonden in de chromosomen van enterische bacteriën (COG2680), waren ook aanwezig in C. bolteae en C. clostridioforme.

verspreiding van antibioticaresistentie genen gedeeld tussen en binnen de kern van C. bolteae en C. clostridioforme. Genen die ten minste 90% lengte overlappen en 90% gelijkenis werden als homologen beschouwd. Resistentiegenen werden voorspeld op een waarde tot 40% identiteit (50% van positieve substituties) op 70% lengte door homologie sequentieonderzoek op ARDB. Voor alle C. clostridioforme en sommige C. bolteae 23S rRNA methyltransferase CFR-achtig

een groot aantal voorspelde genen (32 CDSs) was betrokken bij resistentie tegen glycopeptiden (aanvullend dossier 6: figuur S2). C. clostridioforme 90A8 was de enige stam met alle genen die nodig zijn voor glycopeptide resistentie in overeenstemming met het fenotype (MIC > 256 mg/l). Vancomycine resistentie in deze stam werd toegeschreven aan een vanB-type operon gedragen door een Tn1549-achtig element. Helaas, leidt een schrapping van tien nucleotiden binnen het relaxase gen van Tn1549 tot het onvermogen van 90A8 om vancomycineresistentie in vitro over te brengen . De andere genomen van C. clostridioforme omvatten een deel van het vand-type vancomycine resistentieoperon, maar het D-Ala-Lac ligase vand gen werd verstoord door een stopcodon dat leidde tot een afgekapt eiwit (aanvullend dossier 6: figuur S2). Bovendien ontbraken vanH en vanY, die respectievelijk een D-lactaatdehydrogenase en een DD carboxypeptidase coderen. Ook de genomen van C. bolteae bevatte vier CDSs, homolog van vanRG vanug vanG vanyg, die een onvolledig en niet-functioneel operon vormden door het ontbreken van een serine racemase-gen. Het grote aantal CDSs-coderingen voor glycopeptideresistentie (inclusief vanD of vanG waarvan bekend is dat ze chromosomaal en niet overdraagbaar zijn) in de genomen van C. bolteae en C. clostridioforme, suggereert dat ze deel uitmaken van voorouderlijke hele operonen, die zijn geëvolueerd in afwezigheid van antibiotische selectieve druk . De aanwezigheid van onvolledige van operon is intrigerend, maar gelijkaardige waarnemingen in andere anaëroben die in microbiomen zoals Clostridium difficile 630 of Ruminococcus spp.leven., zijn gemeld .

homologen met het gen adenylyltransferase dat resistentie tegen lincosamiden verleent, waren aanwezig in het kerngenoom van beide soorten (Fig. 3). LnuA genen van C. clostridioforme en C. bolteae hadden 70 tot 72 % identiteit met orthologen gevonden in respectievelijk C. hathewayi en C. citroniae. C. clostridioforme 90B1 en 90A6 bevatten een extra lnu-gen (68% identiteit met LnuA90A5), zonder sporen van mobiele elementen. Lincomycine resistentie komt vaak voor bij C. bolteae en C. clostridioforme, vaak geassocieerd met resistentie tegen clindamycine. LnuA-eiwitten van de twee soorten vertoonden 51 tot 54% van de identiteit met Lnua van Staphylococcus, wat gemeenschappelijke functionaliteit suggereert, maar de rol van lnu-genen is moeilijk vast te stellen vanwege de aanwezigheid van andere veronderstelde mechanismen . Evenzo waren alle stammen resistent tegen erytromycine, terwijl twee genen homolog voor het erythromycine ribosoom methylase gen, ermB, alleen werden voorspeld in de genomen van C. clostridioforme 90A4 en 90A8. Overexpressie van multidrug effluxpompen en Macrolide-en verschillende Macrolide-Lincosamide-Streptogramine B—specifieke effluxsystemen, zoals MacB, MefA, VgaA, MsrA/MsrB en CcmA (Tabel 3, aanvullend dossier 7: figuur S3), die in de onderzochte genomen worden aangetroffen, kan leiden tot resistentie tegen macrolide en lincosamide . Bovendien werden twee clusters CDSs-codering voor xenobiotische acetyltransferasen gerelateerd aan VatB (48% identiteit) gevonden in de genomen van de kern van elk van de species (Fig. 3). VatB inactiveert virginiamycine , maar hier werd de resistentie niet gedetecteerd met antimicrobiële gevoeligheidstesten (Tabel 4).

Een cluster van CDSs-homologen met de genen voor metronidazolresistentie (nim) werd gedetecteerd in de genomen van beide soorten, en metronidazol was zeer actief op de onderzochte soorten . In Bacteroides fragilis is aangetoond dat verhoogde expressie van NIM-genen wanneer stroomafwaarts van IS-elementen leidt tot metronidazolresistentie . Bij gebrek aan IS direct vóór de nim-genen moet het mechanisme om metronidazolresistentie tegen C. bolteae en C. clostridioforme te verkrijgen, nog worden vastgesteld.

onverwachte waarneming van nieuwe resistentiegenen

met betrekking tot andere geneesmiddelenresistenties, onthulden genoomgegevens genen gerelateerd aan chlooramfenicol en rifampine resistentiemechanismen (Tabel 3). In de meeste genomen van elke soort vonden we CDSs codering voor een groep chlooramfenicol acetyltransferase die chlooramfenicol kan inactiveren. Alleen C. bolteae 90B3 en 90B8 waren echter resistent tegen chlooramfenicol. Het genoom van Stam 90B8 bevatte een tweede kopie van het katgen dat wordt overgedragen door een Tn4451-achtige transposon (96 en 90% identiteit met Tn4451 en Tn4453, respectievelijk). Het 90B3 genoom bevatte een CDS homolog aan het gen cfr codage voor 23S rRNA methyl-transferase grotendeels verspreid in Gram-positieve bacteriën. Zoals verwacht was Stam 90B3 ook resistent tegen florfenicol, tiamuline en linezolide (MIC = 16 mg/l). Andere 23S rRNA methyltransferase (CFR-achtige) CDSs werden gedetecteerd in een omgeving rijk aan transposeerbare elementen (Tn 6103-6110-CTn4) in de genomen van C. clostridioforme en C. bolteae 90A5 en 90B7, maar de rRNA methylering bleek geen invloed te hebben op de gevoeligheid voor chlooramfenicol (Fig. 3).

de analyse van genomische gegevens maakte het mogelijk CDSs-homologen te herkennen aan rifampine-ADP-ribosyltransferase (arr) genen in C. bolteae maar niet in C. clostridioforme. Er werden geen mobiele elementen of sporen van mobiele elementen gevonden rond de arr genen, wat erop wijst dat ze inheems waren bij deze soort. Deze nieuwe Arr sequenties vertakt in de buurt van ARR eiwitten van C. saccharoperbutylacetonicum en enkele cyanobacteriën op de fylogenetische boom (aanvullend bestand 8: figuur S4). Ze waren verschillend van ARR-2-eiwitten van Enterobacteriaceae en van Arr-eiwitten van Mycobacterium en Streptomyces spp.. Alle stammen, behalve 90A7, waren gevoelig voor rifampine. In afwezigheid van mutaties in rpoB (waarvan bekend is dat ze verantwoordelijk zijn voor rifampine resistentie), resistentie van C. bolteae 90A7 (MIC: 32 mg/l) was waarschijnlijk te wijten aan positieve selectie van mutaties in aar Cbol90A7. Gevoeligheid voor rifampine van andere C. bolteae was waarschijnlijk te wijten aan het gebrek aan promotoren stroomopwaarts van arr (zoals voorspeld in de silico-analyse) of aan nucleotidesubstituties binnen arr die leidden tot aminozuurvervanging en functionele inactivatie (gegevens niet getoond).Wat betreft de resistentie van alle stammen tegen moxifloxacine en ciprofloxacine, vertoonden alle stammen van C. bolteae verschillende substituties in het “quinolon-resistance–determining region” (QRDR) van gyrB. We vonden geen substituties in dit gebied voor gyrA, noch beschreven in het eiwit van de quinolon-resistente epidemische stam, C. difficile 027 . Daarom was GyrB waarschijnlijk het aangewezen doelwit bij het verkrijgen van quinolonresistentie bij deze twee soorten. Bovendien, verscheidene CDSs codering voor acrb inner membraantransporteur aanwezig waren in alle spanningen. Deze transporters maken deel uit van een resistance-nodulation-division multidrug effluxpomp, waarvan bekend is dat deze de efflux van chinolonen bij sommige gramnegatieve bacteriën verhoogt . Verdere studies zijn nodig om hun invloed op het verlies van gevoeligheid van Clostridium spp.te bepalen. op fluorochinolonen.

over het algemeen kunnen vergelijkbare resistentieprofielen tegen antibiotica in C. bolteae en C. clostridioforme het gevolg zijn van verschillende mechanismen.

genen voor resistentie tegen antibiotica die minder actief of inactief zijn tegen Clostridium spp

de genomen van C. bolteae en C.clostridioforme droeg één of twee kopieën van het undecaprenylpyrofosfaatfosfatase-gen bacA, en 2 tot 5 kopieën van de effluxpompgenen, bcrA, die betrokken zijn bij bacitracineresistentie, in overeenstemming met hun lage gevoeligheid . We vonden ook een cluster van CDSs homoloog aan het dihydrofolaat reductase gen, dfrA20 (41% identiteit / 97% lengte) van Pasteurella multocida in het kerngenoom van beide soorten dat de slechte activiteit van trimethoprim op onze Clostridium spp zou kunnen verklaren. . Daarnaast bevatte C. clostridioforme 90A6 een CD ‘ s die identiek waren aan Dfra van Enterococcus faecium. Dit gen gedetecteerd in een omgeving rijk aan mobiele elementen is consistent met een nieuw voorbeeld van horizontale overdracht tussen Enterococcus spp. en Clostridiales.Interessant is dat de genomen van C. bolteae of C. clostridioforme verschillende resistentiegenen bevatten tegen antibiotica die van nature inactief zijn op deze soorten. Vijf CDSs ‘ s waren homologen van genen die fosforylaat, acetylaat of adenylaataminoglycosiden bevatten. Vier van deze vermeende resistentiegenen werden gedetecteerd in een omgeving van mobiele elementen. Drie genen, aadE, sat4 en aph (3′)-III, die resistentie tegen respectievelijk streptothricine, streptomycine en kanamycine verlenen, werden in C. clostridioforme 90A3 (twee kopieën), 90A6 en 90B1 aangetroffen in een transposon dat werd afgebakend door twee IS1182 kopieën. De gedetecteerde aph(3′)-III was identiek aan de aph(3′)-III, een deel van het multidrugbestendige plasmide PF856 van E. faecium , ook gerelateerd aan een intern domein (99% identiteit) van een SSCmec-element van Staphylococcus aureus HT20040085. Evenzo werd het aminoglycoside 6-adenylyltransferase gen ant(6′)-Ia, dat resistentie tegen streptomycine verleent, gedeeld door C. clostridioforme 90A1, 90A3 (2 kopieën), 90A4, 90A6 (2 kopieën) en C. bolteae 90A7. Het adenylyltransferasegen aad(9′)-b dat resistentie tegen streptomycine/spectinomycine bemiddelt, werd gevonden in C. bolteae 90B3. Twee kopieën van de acetyltransferase aac (6′) – Im waren ook aanwezig in het genoom van C. clostridioforme 90B1. Homologen van AAC (6’) – Im die resistentie verlenen tegen tobramycine en amikacine resistentie werden ook gevonden in E. coli( 96% identiteit), Coprococcus sp, C. difficile en Enterococcus faecium (gegevens niet getoond). Bovendien werden drie CDSs-coderingen voor een aminoglycoside kinase (APH), waarvan bekend is dat het wijd verspreid is in Grampositieve bacteriën, ook waargenomen bij alle stammen .Bij C. bolteae en C. clostridioforme werden ook talrijke tetracycline resistentiegenen ontdekt. Zij omvatten zowel effluxgenen zoals tet40, als de determinanten van de ribosoombescherming zoals tetO, tetW, en tet32, die eerder als circulerend in darmmicroflora onder ver verwante bacteriën worden gerapporteerd .