Wat is colony PCR?

Colony PCR is een snelle PCR-methode met hoge doorvoer om de aanwezigheid of afwezigheid van ingebracht DNA in plasmide rechtstreeks uit de bacteriekolonies te bepalen.Moleculair klonen is een van de meest populaire methoden voor DNA-transformatie sinds lange tijd. Voor het bepalen van de aanwezigheid of afwezigheid van de DNA-insert moeten we echter transformatieexperimenten uitvoeren.

Colony PCR is een nieuwe methode waarbij we door het ontwerpen van de ingevoegde DNA-specifieke primers, kunnen identificeren of ons DNA van belang is ingebracht in het plasmide of niet.

het is echter niet zo eenvoudig als we hier bespreken.

in dit artikel zullen we ons richten op de kolonie PCR in het bijzonder, het principe van de kolonie PCR, de voordelen en beperkingen.

daarvoor moeten we verschillende termen en onderwerpen begrijpen. We beginnen ons onderwerp vanaf de basis. De inhoud van het artikel is,

“een plasmide is het bacteriële cirkeldna dat onafhankelijk van het bacteriële chromosoom repliceert en in de genmanipulatie en genoverdracht wordt gebruikt.”

het genetische klonen is een traditioneel moleculair genetisch hulpmiddel dat al lang in de laboratoria wordt gebruikt. In het kort, in het klonen van genen, wordt het gen van ons belang ingebracht in het plasmide door kunstmatige middelen. Dit DNA wordt onafhankelijk van het bacteriële chromosoom herhaald.

plasmiden worden eigenlijk gebruikt om vele kopieën van korte segmenten van DNA te produceren. Omdat bacteriën zich sneller vermenigvuldigen dan andere organismen, kunnen we veel kopieën van het gen van ons belang genereren door het in te brengen in het bacteriële plasmide.

F-plasmide, Col-plasmide, degradatief – plasmide en resistentieplasmide zijn verschillende veel voorkomende soorten plasmiden die in bacteriën worden aangetroffen.

bovendien kan het plasmide werken als een moleculaire drager die korte DNA-segmenten van de ene cel naar de andere overbrengt.

We hebben een verbazingwekkend diepgaand artikel behandeld over plasmide DNA. Lees het hier: plasmide DNA-structuur, functie, isolatie en toepassingen.

behalve bacteriën bevatten verscheidene andere prokaryoten ook plasmide-DNA. De belangrijkste functie van het plasmide in bacteriën is voor hun overleving in de ruwe voorwaarden.

aangezien het plasmide het gen van ons belang overbrengt, is het zeer belangrijk om te bepalen of ons gen van belang al dan niet in het plasmide wordt ingebracht.

hiervoor kunnen we verschillende methoden gebruiken, zoals PCR en microbiële kweek.

plating de kolonies nemen meer tijd in beslag en de gevoeligheid van de methode is ook niet goed. De kans op besmetting is altijd hoog in bacteriekweekmethoden.

de resultaten zijn dus niet nauwkeurig.

onze PCR helpt hier ook. Met behulp van de kolonie PCR methode, kan een DNA-insert worden bepaald of geà dentificeerd.

1. How to set up a DNA extraction lab: A comprehensive guide (chemicals, instruments and other utilities).Chromosoom 6P deletie: een reden voor geen pijn, geen honger en geen slaap

Wat is Colony PCR?

kolonie-PCR is de modificatie van de conventionele PCR waarbij de bacteriekolonies direct als PCR-sjabloon worden gebruikt.

het plasmide-DNA dat het DNA van ons belang bevat, wordt versterkt in cyclisch-temperatuurafhankelijke omstandigheden.

de grafische weergave van de PCR van de kolonie is weergegeven in onderstaande figuur,

principe van kolonie-PCR:

de bacteriële kolonie die het plasmide bevat kan direct worden versterkt met behulp van twee sets primers. De insert – specifieke primers die de insertievolgorde versterken en vector-specifieke flankerende primers, die het plasmide-DNA behalve het ingevoegde DNA versterken (flankerende gebieden aan beide zijden van het insert).

door gebruik te maken van de insert flankerende primers (die de rest van het DNA versterken) kan de grootte van onze DNA-insert worden bepaald.

een bacteriële kolonie wordt geplukt en direct toegevoegd aan het mastermix dat alle PCR-reagentia bevat. Bovendien, door één aanvankelijke het verwarmen stap aan PCR toe te voegen, komt plasmidedna uit de bacteriecel en vergroot in de reactie.

dit is het basisprincipe van de kolonie-PCR, maar het kan worden aangepast afhankelijk van de vereisten.

het Protocol van kolonie-PCR:

de kolonie-PCR is een van de uitstekende modificatie van de conventionele PCR. In plaats van malplaatjedna, worden de bacteriële kolonies direct aan de reactie toegevoegd. Daarnaast worden Taq DNA-polymerase, primers, PCR-reactiebuffer en DD/W toegevoegd aan de PCR-reactie.

hier in de kolonie PCR is de selectie van primers zeer belangrijk. Ook de selectie van primers hangt af van het doel van ons experiment.

wat voor soort informatie willen we van ons PCR-experiment in de kolonie?

1. 1. 1. alleen informatie over de aanwezigheid of afwezigheid van de insert.
      2. informatie over de grootte van de insert.
      3. informatie over de oriëntatie van de insert.

afhankelijk van dat verschillende PCR primers zijn ontworpen voor de kolonie PCR.

de insert – specifieke primers binden aan de specifieke locatie aan beide zijden van het ingevoegde DNA van ons belang. Als het goed in het plasmide wordt overgebracht, kunnen deze primers aan het binden anders kan het niet kunnen binden.

deze primerset geeft informatie over de aanwezigheid of afwezigheid van de insert.

Oriëntatiespecifieke primers zijn unieke primers waarbij één primer zich in de insert bindt en een andere primer zich bindt aan de plasmide-DNA-sequentie (andere sequentie dan het DNA van de insert).

dit type primer set geeft informatie over de oriëntatie van ingevoegde DNA van ons belang. Als ons tussenvoegsel-DNA niet goed in de vector is geligeerd, kan de primer specifiek aan die kant van de opeenvolging niet binden, en zullen wij de versterking niet krijgen.

plasmide – specifieke primers zijn ook even belangrijk als de oriëntatie-specifieke primers. Deze set primers zijn ontworpen vanuit het flankerende gebied van de insert die zich bindt aan de buitenkant van het DNA van ons belang.

deze set primer helpt om de grootte van de insert te bepalen. Het breidt andere gebieden dan het tussenvoegseldna uit.

De PCR-reactie voor het uitvoeren van de kolonie PCR is als volgt,

Component	Concentratie	Hoeveelheid
Master mix (Speciale voor de Kolonie PCR)	1X	12µL
PCR-reactie buffer Met 2 mm MgCl2*	1X	5µL
Forward primer	10	1µL
Reverse primer	10	1µL
Supernatant		3µL
Water		3µL
Totaal	———	25µL

De procedure van de kolonie PCR:

Goed, de kolonie PCR hoeft niet geëxtraheerde DNA.

we halen hier geen DNA uit. In plaats daarvan, worden verscheidene andere methodes gebruikt voor het verhogen van de gevoeligheid van de reactie.

Ok, waarom halen we geen DNA uit het plasmide-DNA?

omdat de reden eenvoudig is, is het celmembraan van de bacteriële cel zeer glad.

we hadden het celmembraan van de bacteriële cel al besproken. Lees het hier: verschillende soorten DNA-extractiemethoden

een bacterie bevat een zacht celmembraan dat gemakkelijk kan worden gelyseerd door het met hoge snelheid te verhitten of te centrifugeren.

ook hebben we geen bacterieel eigen DNA nodig. Het doorgevende cirkelplasmide is aanwezig in het cytoplasma van de bacteriën daarom worden de extra zuiveringsstappen niet eveneens vereist. Door het celmembraan te breken, is ons template DNA klaar voor de versterking.

Ok, laten we snel gaan door de methode voor het verkrijgen van goede plasmide DNA.

neem met behulp van de steriele picker verschillende bacteriekolonies en breng deze over in de buis van Eppendorf.

Voeg nu de buffer toe en meng het goed. Je kunt ook D/W gebruiken.Verwarm het monster gedurende 20 minuten in het kokende waterbad.

vertex het voorzichtig.Centrifugeer Het monster gedurende 2 minuten bij hoge snelheid.Breng het supernatans over in een andere tube en gebruik het als model-DNA.

aan de reactie wordt een monster van 20µL toegevoegd.

aanvullende informatie:

waarom supernatant en niet pellet? DNA is een biomolecule van het leven. Het plasmide-DNA is nog kleiner dan het bacteriële nucleaire DNA. Het bevat slechts verscheidene genen tot 1000bp tot 20.000 bp.

door het enkel te centrifugeren, komt het lichtere plasmide-DNA uit de cel en wordt het in het supernatant geplaatst, terwijl de pellet eiwitten en nucleair DNA bevat, zodat we het niet gebruiken.

komt nu ter zake.

ons plasmide is klaar voor amplificatie.

bij een andere methode,

gebruik de bacteriële kolonie direct.

deze methode is een combinatie van Hotstart-PCR en colony-PCR.

de bacteriekolonies worden geplukt en aan de PCR-reactiebuis toegevoegd.

de buizen worden in de PCR-machine geplaatst. Een extra verwarmingsstap wordt toegevoegd.

door het 5 tot 7 minuten te verhitten, komt het plasmide-DNA uit de cel.

nu versterken de insert – specifieke primers het DNA dat we hebben ingebracht. En de flankerende primers versterken de rest van het DNA.

de versterking gebeurt gedurende 20 tot 25 cycli. De fietsen voorwaarden voor de kolonie PCR is hieronder,

PCR-de Stappen	Initiële Denaturatie	Denaturatie	Gloeien	Extension	Laatste verlenging
Temperatuur	95 C	95 C	55-65 C	72 C	72 C
Tijd	3min	10 sec	45 sec	50 sec	5 min
	——-	——-	25 cycli	—–	——-

lees het interessante artikel over conventional PCR: A Complete Guide of the polymerasekettingreactie

Tips for improvement:

gebruik slechts enkele kolonies, omdat veel kolonies de kans op niet-specifieke bindingen vergroten.

Gebruik positieve controle en negatieve contol.

bij een positieve controle werd de flankerende primer gebruikt, zelfs als de insert niet aanwezig is, geeft de PCR-reactie DNA-band van het plasmide-DNA aan, wat aangeeft dat de reactie die We bereidden correct is.

gebruik als negatieve controle het niet-getransformeerde plasmide (plasmide zonder insert-DNA), dit plasmide-DNA wordt alleen versterkt als de insert aanwezig is.

als insert gebruiken korte DNA-sequenties, langere DNA-sequenties verhogen de kans op niet-specifieke bindingen en falen van PCR-reactie.

gebruik bovendien kortere PCR-programma ‘ s.

de belangrijkste toepassing van kolonie-PCR is bij de identificatie van correcte ligatie en insert-DNA in bacteriën en gistplasmide.

na voltooiing van de PCR-reactie van de kolonie worden de PCR-producten uitgevoerd op de 2% agarose gel. De resultaten van het experiment zijn weergegeven in onderstaande figuur,

Let nu zorgvuldig op de resultaten, de M is de 3000bp moleculaire DNA-marker. Veronderstel, is het DNA van ons belang, “tussenvoegsel” een fragment van 400bp dat in het plasmide wordt ingevoegd.

zie Baan 2: Het 400 bp-fragment van ons inzetstuk.

We ontwierpen flankerende primers op 100bp afstand van beide zijden van de insert. Als de flankerende primer het DNA samen met de insert versterkt is het product 600 bp, zie de baan 3 (400 bp van insert DNA + 200 BP flankerend gebied).

nu, zie Baan 1, is het een positieve controle zonder de insert of een normaal plasmide zonder het getransformeerde DNA. Vandaar dat de flankerende primers slechts 200 bp DNA versterken.

zie Baan 1, 200bp-fragment van DNA zonder insert (positieve controle).

Let nu op rijstrook 4. Baan 4 is het resultaat van de oriëntatie-specifieke primers. De oriëntatie-specifieke primer is een combinatie van insert-specifieke primer en flankerende regio-specifieke primer.

een primer van insert DNA en een primer van de flankerende regio-specifieke primer worden geselecteerd voor oriëntatie-specifieke primer amplificatie.

daarom wordt 100 BP fragment van de flankerende regio primer en 400bp van de insert DNA versterkt en 500 BP fragment van DNA wordt waargenomen in baan 4.

rijstrook 5 is de insertspecifieke controle die 400 BP DNA-fragment geeft.

rij 6 is de negatieve controle zonder de sjabloon. Door negatieve controle kan elke verontreiniging worden geïdentificeerd. De reactiebuis bevat alle ingrediënten behalve de sjabloon. Dus idealiter zijn er geen DNA-banden aanwezig in deze baan.

als een DNA-band wordt waargenomen, is het monster verontreinigd.

voordelen van kolonie-PCR:

• de techniek is snel en kosteneffectief.
• verder zijn de nauwkeurigheid en specificiteit van de techniek hoger.
• de set-up is eenvoudig, net zoals de conventionele PCR, DNA-extractie en plasmide zuivering zoals moeizame stappen niet nodig zijn.
• voor de identificatie van het DNA van de insert is geen restrictievertering nodig.
• het gehele experiment kan binnen 90 minuten worden voltooid.

nadelen van kolonie-PCR:

• de methode is kosteneffectief, snel en betrouwbaar, maar elke mutatie in de insert kan niet worden gedetecteerd.
• bovendien kan de sequentiegegevens niet worden verkregen door de PCR van de kolonie. we moeten sequencing doen voor de bevestiging van de DNA transformatie.
• de kans op vals-positieve resultaten is groot.

Lees meer;

1. Wat is een multiplex PCR?

na afloop van het experiment wordt het monster verzonden voor de sequencing waar de DNA-sequentie van ons belang kan worden bepaald.

we kunnen zelfs multiplex PCR doen door zowel insert-specifieke primers als plasmide-specifieke primers te combineren.

conclusie:

hoewel de PCR van de kolonie de beste keuze is voor de identificatie van genoverdracht, is de enige PCR-techniek van de kolonie niet voldoende om de resultaten te interpreteren. Het zou mogelijk kunnen zijn dat sommige veranderingen huidig in het tussenvoegsel, die niet door PCR kunnen worden ontdekt.

voor de bevestiging van de resultaten is DNA-sequencing vereist. Na het bepalen van de volgorde van de volgorde kunnen we zeggen of ons gen van belang correct is ingebracht of niet.