malowanie chromosomów
8 terytoriów chromosomowych
każdy chromosom zamiast być rozproszony w jądrze, zajmuje odrębną objętość, zwaną terytorium chromosomowym. Wykazano to poprzez malowanie chromosomów-technikę opartą na rybach, w której Genom jest hybrydyzowany z dużą liczbą sond specyficznych dla chromosomów, aby umożliwić wizualizację poszczególnych chromosomów w jądrze. Na radialne umiejscowienie chromosomu ma duży wpływ jego skład—chromosomy ubogie w geny mają tendencję do zajmowania pozycji bliżej peryferii jądrowej, podczas gdy chromosomy bogate w geny częściej znajdują się w kierunku wnętrza . Trend ten ilustruje ludzkie chromosomy 18 i 19, które są bardzo podobne pod względem wielkości, ale mają bardzo różny skład sekwencji: chromosom 18 jest ubogi w Gen, podczas gdy 19 jest bogaty w Gen. Laboratorium Bickmore ‘ a wykorzystało obszar chromosomowy ryb do zbadania pozycji dwóch chromosomów w jądrze i odkryło, że chromosom 18 był konsekwentnie zlokalizowany bliżej obrzeża jądrowego niż chromosom 19 zarówno w liniach limfoblastoidalnych, jak i fibroblastowych . Radialne pozycjonowanie chromosomów w jądrze również okazało się tkankowo specyficzne, z bliżej spokrewnionymi typami komórek wykazującymi bardziej podobne pozycjonowanie chromosomów . Ludzki genom zawiera również pięć akcentrycznych chromosomów, zawierających sekwencje rDNA-chromosomy 13, 14, 15, 21 i 22, które są zwykle skupione wokół jądra—miejsca transkrypcji i przetwarzania rybosomalnego RNA.
radialna zasada pozycjonowania chromosomów wpływa również na pozycjonowanie naprzemiennych segmentów bogatych w geny i ubogich w geny w chromosomach-w tym przypadku segmenty bogate w geny znajdują się bardziej centralnie, podczas gdy regiony ubogie w geny zajmują regiony bliżej peryferii. Ponadto, w obrębie terytoriów chromosomowych, transcriptionally nieaktywne segmenty znajdują się wewnętrznie i transcriptionally aktywne segmenty znajdują się na powierzchni terytorium . Układ ten umożliwia transkrypcyjnie aktywne regiony gotowy dostęp do maszynerii transkrypcyjnej i domen bogatych w czynniki metaboliczne mRNA, takie jak ogniska SC-35 . Jednak drobno-szczegółowa struktura terytoriów chromosomowych jest jeszcze niejasna, co odzwierciedla brak wiedzy o strukturach chromatyny, które je kształtują.
z punktu widzenia stabilności genomu ważną konsekwencją wzorców pozycjonowania chromosomów są translokacje, najczęstsze nieprawidłowości chromosomalne obserwowane w populacji ludzkiej. Jest dobrze ustalone, że fizyczna bliskość dwóch chromosomów w jądrze wpływa na prawdopodobieństwo translokacji zachodzącej między nimi (rys. 23.3).
rysunek 23.3. Korzystne położenie chromosomów w jądrze wpływa na częstotliwość translokacji.
chromosomy o tej samej preferowanej radialnej pozycji w jądrze (np. chromosomy 17 i 19) częściej biorą udział w translokacji niż chromosomy o innej radialnej pozycji (np. chromosomy 17 i 18).
analiza częstości występowania różnych translokacji pozapatogennych w populacji ludzkiej i preferowanych radialnych pozycji chromosomów w jądrze wykazała, że chromosomy o podobnych pozycjach jądrowych tworzą translokacje częściej niż oczekiwano Przez przypadek . W innym badaniu udało się wykazać bliskie sąsiedztwo między loci BCR i ABL, zaangażowanych w dobrze scharakteryzowaną translokację t(9; 22) tworzącą chromosom “Philadelphia” w przewlekłej białaczce szpikowej. Autorzy wykazali, że loci BCR i ABL były bliższe w limfocytach B niż w hematopoetycznych komórkach progenitorowych, co sugeruje, że specyficzne dla typu komórki aspekty organizacji jądrowej mogą przyczyniać się do powiązania niektórych translokacji z konkretnymi typami nowotworów. W 2013 roku Misteli Lab opublikowało badanie badające dynamikę przerw dwuniciowych i późniejszej translokacji w eleganckim systemie: komórki NIH3T3duo kodują niewielką liczbę miejsc enzymu restrykcyjnego scei zintegrowanych na różnych chromosomach, z niektórymi miejscami przylegającymi do tablicy LacO i innymi miejscami sąsiadującymi z tablicą TetO. Po indukcji przerwy przez enzym SceI możliwe było śledzenie przerw, które były oznaczone fluorescencyjnie znakowanymi białkami Lac (LacR) i Tet (TetR)-represor; na powstawanie translokacji wskazywała długotrwała, stabilna współlokalizacja sygnałów LacR i TetR. Autorzy byli w stanie wykazać, że większość translokacji jest tworzona przez loci, które są blisko zlokalizowane przed indukcją przerwania (model kontaktowy-pierwszy), a nie w wyniku ruchu przerw dwuniciowych do miejsc bliższych (model breakage-pierwszy).
poza metodami analizy terytoriów chromosomowych stosuje się dwie główne metody uzupełniające do badania trójwymiarowej organizacji genomu na poziomie struktury domeny wyższego rzędu: Metody oparte na rybach i metody przechwytywania potwierdzeń chromosomów . FISH opiera się na hybrydyzacji fluorescencyjnie znakowanych sond do wizualizacji poszczególnych loci, określonych części genomu lub całych chromosomów. Zapewnia migawkę struktury jądrowej na poziomie pojedynczej komórki, ale wadą jest to, że jest czasochłonny i zapewnia ograniczoną ilość informacji w niskiej rozdzielczości. Techniki przechwytywania konformacji chromatyny (3C) polegają na “zamrożeniu” struktury jądrowej przez sieciowanie interakcji wewnątrz jądra, ligowaniu fragmentów DNA utrzymywanych w pobliżu przez sieciowanie, a następnie PCR lub sekwencjonowaniu następnej generacji w celu identyfikacji hybrydowych fragmentów DNA, wskazujących na kontakty. W najbardziej wyrafinowanym końcu techniki te mogą teoretycznie zidentyfikować wszystkie możliwe interakcje w całym genomie, ale istnieją również wady. W przeciwieństwie do ryb, techniki 3C działają na populacjach komórek, a nie na poziomie pojedynczej komórki, tworząc średnią populacyjną, która może odzwierciedlać wiele różnych konfiguracji kontaktu na poziomie pojedynczej komórki. Pomimo zastrzeżeń, metodologie 3C były bardzo wpływowe w dziedzinie organizacji genomu 3D, przyczyniając się do koncepcji topologicznie kojarzonych domen (TADs). TADs są definiowane jako regiony o wymiarach ∼900 kb, gdzie mapy kontaktów wykazują zwiększone interakcje; Badania oparte na rybach wykazały, że sondy zlokalizowane w TAD są fizycznie bliżej niż sondy Nie zlokalizowane w tym samym TAD, ale oddzielone podobną “liniową” odległością genomu . Pełny ludzki genom dzieli się na około 2000 tad, które pokrywają się również z rozkładem znaków histonowych i innymi cechami genomu, takimi jak czas replikacji (opisany później). Jednak nie są one specyficzne dla typu komórek, a kwestia, jaki poziom organizacji strukturalnej odzwierciedlają i ich znaczenie funkcjonalne, jest nadal otwarta do dyskusji. Co ciekawe, wzorzec częstotliwości translokacji obserwowany z terytoriami chromosomów można również przypisać do poziomu organizacji TAD-badanie przeprowadzone na komórkach B wykazało, że prawdopodobieństwo translokacji między dwoma loci jest silnie związane z częstotliwością kontaktu między nimi, zdefiniowaną przez Mapy kontaktu generowane przez potwierdzenie chromosomu.
