COLO 205

cultura bem sucedida das suas células:

*leia a informação técnica importante que se segue antes de tratar as linhas celulares fornecidas pelo ECACC*. Esta informação também está disponível como PDF no nosso menu principal, em “suporte ao Cliente” (Clique aqui).

armazenamento de células congeladas

após a recepção, as ampolas congeladas devem ser transferidas directamente para o azoto líquido de fase gasosa sem demora, a menos que se destinem a ser utilizadas imediatamente. Não utilize o congelador a -80°C como alternativa, o que resultará em perda de viabilidade.

como manipular as células congeladas após a recepção

ao receber um carregamento de linhas celulares congeladas fornecidas pela ECACC, é importante que o utilizador final preste imediatamente atenção ao envio. O conselho técnico que acompanha as linhas celulares deve ser consultado antes de remover ampolas do gelo seco. O tratamento correto imediatamente após a recepção é fundamental para estabelecer com sucesso a linha celular no laboratório do usuário final.

no momento em que uma linha de células é ordenada, os usuários finais também devem considerar as condições de cultura para a nova linha de células e certifique-se de que o meio apropriado estará disponível quando as células chegarem.

importância da contagem de células

Faça uma contagem de células viável quando ressuscitar e colher culturas de células. Uma das razões mais comuns para a incapacidade de estabelecer células em cultura é devido ao uso de uma densidade de semeadura de células viável incorreta no momento da ressuscitação, ou seja, células semeadoras muito baixa ou muito alta. Isto pode ser evitado através da realização de uma contagem de células viável e seguindo a densidade de semeadura recomendada.

para a linha celular específica com que está a trabalhar, leia as informações fornecidas na página “Descrição” da nossa página web. Essa informação também pode ser encontrada na folha de dados da linha celular, que será fornecida a você como uma cópia em papel com o envio da linha celular. A densidade de semeadura é mostrada na informação de rotina da subcultura. Ao semear as células imediatamente após a ressuscitação, utilize a extremidade média a superior do intervalo de densidade de semeadura indicado.

reanimação de células congeladas

é importante manusear as ampolas congeladas com cuidado; usar um casaco de laboratório, máscara facial e luvas totalmente protectoras. Em ocasiões raras ampolas podem explodir com o aquecimento devido à expansão de nitrogênio líquido residual preso.

1. Num armário de segurança microbiológica, segure um tecido embebido em álcool a 70% à volta da tampa da ampola congelada. Rode o casquilho um quarto de volta para libertar qualquer azoto líquido residual que possa estar preso. Reformular o boné. Transfira rapidamente a ampola para um banho de água de 37oC até que apenas um ou dois pequenos cristais de gelo, se houver, permaneçam (1-2 minutos). É importante descongelar rapidamente para minimizar quaisquer danos nas membranas celulares.Nota: Não imergam totalmente a ampola, pois isto pode aumentar o risco de contaminação.

2. Limpe a ampola com um tecido embebido em álcool a 70% antes da abertura.

3. Pipetar todo o conteúdo da ampola para um tubo estéril (por exemplo, capacidade de 15 ml). Em seguida, adicionar lentamente 5 ml de meio pré-aquecido que já foi complementado com os componentes apropriados. Determinar a densidade celular viável utilizando a coloração azul de trypan, um hemocitómetro e um microscópio invertido para a contagem das células ou um método de contagem de células equivalente. Transferir o volume adequado de suspensão celular para atingir a densidade de semeadura celular recomendada na entrada de dados da linha celular.

para as linhas celulares aderentes: ajustar o volume do meio e, se necessário, a dimensão do frasco, de modo a obter a densidade de semeadura das células recomendada na folha de dados da linha celular. Um passo de pré-centrifugação para remover o crioprotetor normalmente não é necessário, uma vez que a primeira mudança de mídia irá remover o crioprotetor residual. Se for, então isso será especificado na folha de dados. Se as células forem utilizadas imediatamente (por exemplo, para um ensaio com base em células), em vez de subculturadas, pode ser aconselhável efectuar um passo de pré-centrifugação para remover o crioprotector.

para linhas celulares de suspensão*: um passo de pré-centrifugação para remover crioprotetor é recomendado. sedimentar as células por centrifugação a 150 x g durante 5 minutos e ressuspender a célula em meio fresco utilizando o volume adequado para obter a densidade de semeadura correcta.

1. Incubar os frascos à temperatura e ao nível de CO2 recomendados na folha de dados. Se for utilizada uma incubadora alimentada com CO2, o frasco deve dispor de uma tampa de ventilação que permita a troca de gases.

culturas de Hibridomas de Congeladas

quando se recupera culturas de hibridoma do congelado, não é incomum que o crescimento inicialmente seja mais lento do que o esperado e pode haver uma diminuição observada na viabilidade. O estabelecimento de uma cultura em proliferação activa pode levar até 2 semanas.

na reanimação é essencial um passo de centrifugação para remover o crioprotetor. Descongelar rapidamente a ampola congelada num banho de água a 37°C durante 1-2 minutos. Transferir o conteúdo para um tubo de centrifugação e adicionar lentamente 5-10 ml de meio de crescimento pré-aquecido+. Remover uma amostra para contar. Centrifugar a 100 x g durante 2-3 minutos a células de sedimento e a uma densidade relativamente elevada de 5-7 x 105 células/ml. Colocar o frasco de cultura plano e observar regularmente até que sejam observadas células em proliferação viáveis.

+muitas vezes culturas de hibridoma podem se beneficiar de ser ressuspendidos com meios complementados com 20% de FBS no estágio crítico inicial do estabelecimento de cultura imediatamente após a ressuscitação.

procedimento para as células congeladoras

a ECACC recomenda, por precaução, a congelação de uma reserva da(s) Sua (s) Linha (s) celular (s) logo após a recepção (entre 2 – 4 x 106 células/ml).

o guia seguinte é oferecido para a preparação e criopreservação de linhas celulares.

1. Colher as células na fase logarítmica de crescimento da mesma forma utilizada para a subcultura de rotina. Para as linhas celulares aderentes, colher o mais próximo possível de 80-90% de confluência.

2. O procedimento padrão é utilizar 90% de soro + 10% de crioprotector para todas as linhas celulares, salvo especificação em contrário na ficha de dados. Permitir 1 ml para cada ampola. A maioria das linhas celulares pode ser congelada no meio de cultura apropriado, complementada com 20% de soro e 10% de crioprotetor. Este é geralmente DMSO, mas em certos casos é recomendado glicerol. Se o DMSO não for adequado, será especificada uma alternativa na folha de dados da linha celular.

3. Células de sedimento por Centrifugação, por exemplo, 150 x g durante 5 minutos. Ressuspender os pellets celulares no meio de congelamento adequado para obter uma concentração final entre 2 – 4 x 106 células/ml e pipetar 1 ml para cada ampola.

4. Congelar as células a uma velocidade de arrefecimento compreendida entre 1-3oC / min, utilizando um congelador controlado por uma velocidade programável ou alternativa1. Quando a temperatura atingir pelo menos-130oC, transfira a ampola para um recipiente de armazenamento de azoto líquido em fase gasosa.

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