Infecciosas necrótico hepatite causada por Clostridiumnovyi tipo B em um cavalo: relato de caso e revisão de theliterature | Jiotower

Infecciosa, hepatite necrótica (INH) é causada por Clostridium novyitype B. A doença geralmente afeta ovinos, na qual também é conhecido como”black doença”, dada a escura, a descoloração do tecido celular subcutâneo, causado byintense congestão venosa visto no carcaças de animais que morrem desta doença.6 embora se considere que a INH também ocorre noutras espécies, incluindo bovinos, caprinos e cavalos, a informação disponível sobre esta doença é muito limitada em animais diferentes dos ovinos.2,3,19,15 além disso,devido à sua natureza anaeróbica estrita, o isolamento e a identificação de C. novyi Tipo B raramente são alcançados.15 por esta razão, os relatórios de INH são geralmente limitados a presumptivediagnose com base na histopatologia, teste de anticorpos fluorescentes (FAT) e/orimmunohistoquímica (IHC). O tipo de C. novyi é rarelydetermined. Aqui apresentamos um caso confirmado de INH equina causada por C.novyi Tipo B, e também rever a literatura sobre a doença.

a 14-y-old, 511-kg bay Quarter Horse gelding was submitted to the San Bernardinobranch of the California Animal Health and Food Safety Laboratory System forpostmortem examination and diagnostic workup. O animal tinha uma história 3-d de sinais neurológicos progressivos, temperatura rectal de 38,8–40,5°C, e tinha sido tratado sem sucesso com fármacos anti-inflamatórios não esteróides, antes da morte.Uma autópsia completa foi realizada ~6 h após a morte.

na autópsia, o cavalo estava em boas condições nutricionais, com uma quantidade adequada de reservas de gordura, e em estado moderado de decomposição pós-morte. Houve descoloração amarela da esclera, tecido subcutâneo e adiposo, e articularcartilagens. Hemorragias equimóticas multifocais a suffusivas estavam presentes em mostruscos, serosa do trato intestinal, mesentério, baço, pleura e músculos intapilares do coração. O sangue venoso era vermelho-preto profundo. O pericardialsac foi distendido com uma grande quantidade de fluido serossanguíneo, e havia ~5L de um fluido similar contendo abundantes fios de fibrina na cavidade abdominal.O fígado foi acentuadamente aumentado e tinha bordas arredondadas; o lobo esquerdo era firme, Vermelho-escuro a preto, e tinha numerosas bolhas subapsulares e parênquimas profundas de gás e fibrina abundante sobre a cápsula(Fig. 1A). No corte deste lóbulo, havia uma área pálida de ~15 cm de diâmetro, cercada por uma fina borda hemorrágica (Fig. 1B). A meningesuperação do cérebro e da medula espinhal estava difusamente congestionada, e havia hemorragias eleteciais por todo o córtex cerebral. Não foram observados outros grossesões significativos no resto da carcaça.

Amostras de cérebro, pulmão, coração, diafragma, fígado, baço, estômago, intestino,pâncreas, glândula supra-renal, mesentério, rins e bexiga, foram coletados andfixed em 10% tamponada de formalina (pH 7,2) por 48 h e processados rotineiramente para theproduction de 4 µm de espessura hematoxilina e eosina (H&E) manchadas de seções. As secções hepática e renal também estavam manchadas com manchas de Gram e Okajima,respectivamente.

amostras de fígado foram colhidas assepticamente e submetidas a uma cultura aeróbica e anaeróbica em placas de ágar de 5% de ovinos durante 48 horas. A PCR foi realizada para o vírus do Nilo Ocidental (WNV) em amostras agrupadas do sistema nervoso central e para o herpesvírus equid 1 (EHV-1)num esfregaço nasal. Uma tela de metal pesado incluindo chumbo, manganês, ferro,mercúrio, arsênico, molibdênio, zinco, cobre e cádmio foi realizada em amostras de fígado.O líquido cefalorraquidiano foi testado para detecção de anticorpos contra Sarcocystisneurana usando uma gordura indireta. Os esfregaços de fígado foram processados pela gordura para Clostridium chauvoei,Clostridium septicum, Clostridium sordelli, e C. novyi using conjugates comerciais (VMRD, Pullman, WA). Além disso,secções do fígado fixas à formalina, com parafina, foram processadas por uma imunoperoxidasetechnica indirecta para C. novyi, utilizando um kit comercial (sistema RTU VECTASTAINElite ABC, laboratórios vectoriais, Burlingame, CA). A peroxidaseactividade endógena foi extinta com uma solução de peróxido de hidrogénio a 3%, seguida de tratamento pepsint para a recuperação de antigénios. As amostras foram, então, incubadas com BackgroundPunisher (Biocare Medical, Concord, CA) para bloquear a ligação não específica, beforeincubation com cabra anti–C. novyi anticorpo policlonal (VMRD) at37°C por 60 min. Cromogénio novarado Vector foi utilizado para visualização (Vectorlaboratórios). Foram utilizadas secções do fígado incubado com soro de cabra normal em vez de anticorpos primários, como controlo negativo. Fígado de uma vaca em quec. a novyi foi identificada pela cultura e a PCR foi utilizada como um controlo positivo.

amostras de fígado foram processadas para extração de ADN (QIAamp DNA FFPE tissue kit, Qiagen,Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O ADN extraído foi utilizado como modelo para um ensaio de PCR multiplex para amplificar segmentos dos flagelinenos (fliC) de C. septicum, C. novyi tipo A, C. novyi type B, C. chauvoei, and Clostridium hemolyticum, asdescribed previously.17 adicionalmente, desenvolvemos um PCR convencional para amplificar um segmento do theC. gene da toxina alfa do tipo B de novyi (TcnA) (GenBank accession JENV01000127.1), o principal factor de virulência deste organismo. Foram desenhadas as seguintes sequências de oligonucleótidos: 5 ‘- TGATGTTGACCATCCTCTCT-3′ (CNtBaF) e 5′-CCTTATGCAAGGGATGGCG-3’ (CNtBaR),que amplificam um fragmento de ADN ~342-bp do gene-alvo. A PCR convencional foi realizada num volume total de 25 µL contendo 5 µL de ADN extraído, 0.25 µL de cada primário (10 µM), 7 µL de água sem nucleases e 12,5 µL de PCR Master Mix(2X, Promega, Madison, WI), contendo TAQ ADN polimerase (pH 8, 5, 50 U/mL), dNTPs(400 µM) e MgCl2 (3 mM). Os perfis dos termocicladores foram os seguintes:94°C durante 5 min, 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min e 72°C durante 1,5 min, seguidos de uma extensão final a 72°C durante 7 min. As amostras foram mantidas a 4°Cuntil as reacções PCR foram visualizadas sob a luz ultravioleta na bromidrato de etidiumbrometo (Amresco, Solon, OH) manchada a 1% de agarose gels (Agarose SFR, Amresco). Dnaextraído de C. as culturas de novyi Tipo B (ATCC 25758), C. novyi tipo A, C. septicum, C. chauvoei e C. hemolyticum foram utilizadas como controlos positivos. A água em vez do ADN foi usada em acções de controlo negativas.Microscopicamente, a cápsula do fígado foi coberta por fibrina abundante misturada com celdebris, e havia bolhas subapsulares e profundas enfisematosas parenquimais de vários tamanhos. A descoberta mais marcante foi a necrose multifocal a focalmente extensivecoagulante, cercada por uma borda de grande número de neutrófilos viáveis e dodegeneratos, hemorragia, fibrina, destroços celulares, e grandes agregados de varas bacterianas gram-positivas, alguns dos quais tinham esporos subcterminais (Fig. 1C,, D).D). Na intervenção da selecção e no fígado menos afectado, verificou-se estase biliar, multifocalemorreias e necrose fibrinóide segmental a difusa dos vasos sanguíneos, muitos dos quais continham também trombos fibrina. O epitélio tubular renal tinha vacuolização mildcytoplasmática, e os moldes proteicos e granulares estavam presentes no lúmenof túbulos renais. Os moldes manchados positivamente com a mancha de Okajima (Fig. 1E). No cérebro,houve congestão difusa, perivascularhemorrências multifocais e aleatoriamente dispersas, e expansão moderada a marcada do espaço de Virchow-Robin com edema acidofílico. O peritoneu visceral foi coberto por fibrina abundante misturada com um grande número de neutrófilos viáveis e degenerados; a maioria dos vasos sanguíneos peritoneais estavam congestionados e/ou continha trombos fibrina. Algumas pequenas artérias e veias no córtex e na medula da glândula supra-renal também apresentavam trombos de fibrina. Thespleen tinha congestão vascular e multifocais parenquimais e capsularhemorrhages. Os pulmões estavam difusamente congestionados e tiveram hemorragias multifocais e edema, além de alguns vasos sanguíneos contendo trombos fibrina. Foram observadas hemorragias multiesubendocárdicas, subepicárdicas e subpleurais.

a grande maioria das varetas intralesionais gram-positivas observadas no fígado foram positivas para C. novyi IHC(Fig. 1F). A gordura deu positivo para C.novyi, mas negativo para as outras espécies clostridiais testadas. As amostras de fígado deram positivo para os genes de C. novyi Tipo B do fliCand TcnA, e negativo para os genes flicos dos outros clostrídia testados(Fig. 2). As amostras de líquido cefalorraquidiano deram negativo para o teste de anticorpos Imunofluorescentes de S. neurona. A PCR para WNV e EHV-1 foi negativa. Não foi atingido crescimento bacteriano significativo por aeróbia ou anaeróbica. O ecrã de metais pesados revelou uma elevada concentração de amostras de indutores de ferro (1500 ppm; intervalo de referência: 100-300 ppm).

fizemos um diagnóstico presuntivo de INH com base em mudanças grosseiras e microscópicas, juntamente com os resultados de gordura e IHC para C. novyi. O diagnóstico de INH produzido por C. novyi Tipo B foi confirmado pela detecção PCR dos genes fliC e TcnA deste organismo. Tanto quanto sabemos, apenas 6 casos de suspeita de Nhi foram relatados anteriormente em cavalos. Três casos ocorreram na Austrália,8,9,11 e um na Nova Zelândia, 23 na Escócia, 19 e nos Estados Unidos (Montana).16 nesses casos, um diagnóstico presuntivo foi baseado em gross e microscopiclesions juntamente com a detecção de C. novyi por FAT,9,16,19 IHC,23 e/ou cultura.9,19 no entanto, o tipo de C. novyiinvived não foi determinado em nenhum desses casos.

C. novyi é um bacillus anaeróbico gram-positivo, formador de esporos, que é comumente encontrado no solo e nas fezes de animais.15 é classificado nos tipos A, B E C com base na gama de toxinas produzidas.4C. a novyi tipo A produz principalmente a alfatoxina letal indutora de edema (TcnA) e a fosfolipase não letal, a toxina gama; esta bactéria é associada a gangrena gasosa do homem e dos animais, actuando normalmente em conjunto com outra clostridia. C. novyi Tipo B também produz TcnA, em adição à necrosante e toxina beta hemolítica, embora a primeira seja considerada o factor de virulência mais importante para a patogénese da INH. C. novyi Tipo C é considerado não toxigénico e não patogénico.13, 15 C. hemolítico foi anteriormente conhecido como C. novyitype D, e ainda é referido por este nome por alguns autores; portanto, nós discutimos este microorganismo aqui. C. haemolyticum alsoproduces toxina beta, mas em quantidades muito maiores do que C. novyitype B; esta toxina é considerada o principal fator de virulência deste microrganismo,e é responsável por bacillary hemoglobinúria (BH), uma doença affectingmainly gado, que seja clinica e patologicamente muito semelhante ao INH.11,10,14

os esporos de C. novyi são altamente resistentes às condições ambientais e, uma vez que os esporos são normalmente encontrados no solo, os animais de pastagem podem ingeri-los com frequência.6,19 embora não esteja totalmente provado,o dogma atual é que, após a ingestão, os esporos de C. novyi Tipo B são absorvidos do intestino e chegam ao fígado através da circulação portal, após o que eles respondem a outros órgãos. Os esporos são fagocitizados e permanecem latentes em Kupffercells do fígado, e em macrófagos do baço e medula óssea.2, 6 INH tem sido, com frequência, considerada como a contrapartida do BH, uma vez que ambas as doenças são consideradas como ocorrendo após lesão hepática, causando necrose e as condições associadas anaeróbias que são necessárias para a germinação de esporos latentes e para a produção de toxinas.14 a migração de formas imaturas de Fasciola hepática através do fígado é considerada o factor predisponente mais importante tanto para a HB como para os ruminantes Ininos, e ambas as doenças são mais comuns em áreas com elevada prevalência de fasciolíase.1 INH de ruminantes também tem sido associada com Cysticercustenuicollis e outros parasitas, incluindo Fascioloidesmagna, Dicrocoelium dendriticum, andThysanosoma actinoides,2,6,15,21 embora o papel destes parasitas na patogênese da doença não tem sido demonstrada.No entanto, qualquer lesão hepática que conduza à geração de condições anaeróbias pode ser um factor de aumento da INH. Estes incluem, mas não se limitam a, liverabscesses, biopsias, alterações de gordura, telangiectasia e agentes tóxicos. Uma vez que o TcnA é produzido e liberado pelas formas vegetativas de C. novyi Tipo B, a sua actividade monoglicosil transferase inactiva várias proteínas de ligação guanosina-5′-trifosfato (GTP) nas células do hospedeiro, resultando na inalteração e redistribuição do citoesqueleto de actina.O TcnA também interrompe o sistema de vimentina e tubulina.7.18 estas alterações parecem ser mais dramáticas no endotélio capilar, o que conduz à disseminação do extravasamento do fluido constatado na INH15 e, provavelmente, à trombose multissistémica observada no cavalo do nosso relatório. Em ovinos, a natureza altamente aguda da doença dificulta a detecção de sinais clínicos, com animais geralmente encontrados mortos. Nos casos em que são observados sinais, estes são não específicos, e incluem fraqueza, letargia, anorexia,hipertermia, taquipneia, hiperpneia e, finalmente, recumbência. As alterações clinicopatológicas podem incluir neutrófilos com mudança para a esquerda, azotemia,acidose metabólica e aumento das actividades das enzimas hepáticas e musculares.15,19

dado que apenas 6 casos de INH presumível foram descritos anteriormente em cavalos,as informações epidemiológicas, clínicas e patológicas disponíveis são escassas. Com base neste número limitado de casos, não existe uma predisposição aparente de sexo ou raça para a INH equina, e tanto os animais jovens como os adultos podem ser afectados. O curso clínico é geralmente mais longo em cavalos do que em ruminantes, com duração de 12-72 h,E o resultado sempre foi fatal. Os sinais clínicos variam de leves a severedepression e a relutância em se mover, sinais neurológicos, incluindo ataxia e headtilt, hyperemic e/ou ictérico membranas mucosas e esclera ocular, dor abdominal,e decúbito.20,23 num caso em que foi realizada a abdominocentese,foi obtida uma quantidade aumentada de fluido turvo com elevada concentração de proteínas e gravidade específica.9

os perfis Clinicopatológicos de cavalos com INH são altamente variáveis e podem representar diferentes fases de toxemia e lesões hepáticas. Estas alterações podem incluir neutrófilos com um deslocamento esquerdo, actividade enzimática elevada, trombocitopenia, hiperfibrinogenemia, hiperbilirrubinemia e deconcentração de electrólitos.Adicionalmente, foram notificados tempos parciais de tromboplastina, protrombina e trombina aumentados.Estas alterações, em combinação com os microtrombos Capilares observados, induzem uma coagulação intravascular disseminada, um processo susceptível de ocorrer durante o curso de toxemia e hemólise em animais grandes.22,23 o consumo de factores de coagulação, a sua diminuição de síntese devido à insuficiência hepática e a acção sinérgica do TcnA no endotélio vascular são responsáveis pelas hemorragias generalizadas observadas em casos de Inh.

embora o icterus não esteja descrito em ruminantes, os cavalos podem por vezes exibir este sinal associado com INH.19,23 Icterus parece estar relacionado à gravidade dos danos hepáticos e, em certa medida, à hemólise, como no nosso caso, em que a hemoglobina foi visualizada nos túbulos renais pela mancha de Okajima. O cavalo em oustudy tinha aumentado moderadamente a concentração de ferro no fígado, sugerindo um processo hemolítico.5 este nível de ferro no fígado é, no entanto, um achado comum em corridas de cavalos a partir de uma variedade de causas e é muitas vezes considerado um achado incidental associado com congestão e autólise pós-morte (observações não publicadas dos autores).

embora se possa supor que os cavalos são mais susceptíveis do que outras espécies à acção da toxina beta hemolítica produzida por C. novyitype B, as alterações hemoglobinúricas não foram descritas em casos presumíveis de Inh.16,23 em comparação com C. haemolyticum, C. novyi Tipo B produz níveis mais baixos de toxina beta;15 portanto, sua contribuição para a patogênese da INH é presumida como beminor, causando algum grau de hemólise em cavalos, mas não o suficiente para induzir mudanças significativas associadas à hemoglobinúria. Além disso, nenhum dos casos anteriores excluiu o papel de C. hemolyticum como agente causador da doença, pelo que não é possível tirar conclusões finais desses casos. C. O hemolítico esteve implicado num caso de peritonite séptica numa égua por identificação com MALDI-TOF; no entanto, não foi tentada a identificação da PCR ou da toxina nesse caso específico.11

o factor predisponente para a INH nos cavalos nem sempre foi determinado, embora as migrações hepáticas de F. hepatica e trematodes relacionados, bem como membros da família Strongylidae, tenham sido sugeridas.9. 12. 19 adicionalmente,o tratamento antelmintico antes do teonset de sinais clínicos tem sido sugerido como um potencial gatilho da doença,9,16, 23 presumivelmente por causar algum grau de necrosisassociação hepática com a destruição de parasitas migratórios. No entanto, não existem provas científicas que sustentem esta hipótese. Infelizmente, no nosso caso, não foram determinados factores prévios.

como no nosso caso, a maioria dos relatórios anteriores descreveram um único foco (múltiplo num caso19) de necrose que afeta o fígado, consistentemente localizado no leftlobe. Isto contrasta com INH de ovelhas em que são mais comuns focos pequenos e distribuídos aleatoriamente.6.15 desconhece-se a razão desta variação na distribuição. É possível que a predominância de lóbulos no lóbulo esquerdo esteja relacionada com o chamado streaming de portal, que é responsável pelo fluxo diferencial de sangue portal para determinados lóbulos do líper. Como C. novyi é presumivelmente absorvido do intestino delgado, e o sangue deste órgão segue o portal fluindo para o leftlobe, isso pode resultar em que este lóbulo seja predominantemente afetado.A ausência de alterações associadas à encefalopatia hepática (p. ex., Astrocitose de Alzheimer tipo II associada a hiperammonemia) 6 pode sugerir que os sinais neurológicos neste e em casos anteriores foram consequência de hemorragias, congestão, e edema perivascular observado no cérebro,relacionados com a toxemia e a ação do TcnA no endotélio capilar.

INH deve estar na lista de diagnósticos diferenciais de cavalos com sinais neurológicosclínicos, toxemia, insuficiência hepática aguda e peritonite. Mesmo os tratamentos pensativos com doses elevadas de penicilina e tetraciclinas podem ser eficazes contra o cancro. novyi, a produção avançada de toxinas geralmente resulta num mau prognóstico.19 em zonas em que a doença está claramente associada a gripe hepática e/ou a outros parasitas, a redução da carga parasitária e a limitação do acesso dos animais a pastagens mal drenadas podem ser tentadas como medidas preventivas.15

Dado que vários clostridial doenças são considerados associados com acceleratedpostmortem decomposição, uma consideração importante para o diagnóstico correto ofINH é a necessidade de uma rápida avaliação e preservação dos tecidos após a deathof o animal.6. 23 a história clínica, a autópsia de rotina,a histopatologia e a imunossupressão de C. novyi em lesões hepáticas são essenciais para permitir um diagnóstico presumível de INH. Porque o isolamento não é alwayssuccessful, dada a anaeróbias estritas exigências dos microorganismos,identificação molecular por PCR é uma ferramenta valiosa para fornecer uma etiologicdiagnosis, e para diferenciar C. novyi tipo B de otherclostridial patógenos.