(a) ciclul de viață sexuală al Chlamydomonas reinhardtii constă… / Descărcați Diagrama Științifică

… natura substanțelor genetice care au sfidat legea lui Mendel. Studii ample din ultimul secol, folosind numeroase tehnici, inclusiv microscopie electronică, genetică, biologie moleculară și biochimie, au arătat că substanțele genetice sunt de fapt genomi în cloroplaste și mitocondrii (Kuroiwa 1991; Birky 1995). Se crede că cloroplastele (cp) și mitocondriile (mt) au apărut din relațiile endosimbiotice ancestrale dintre celulele nucleate și bacteriile cu viață liberă-cianobacterii și, respectiv, bacterii alfa – violete. Acestea conțin propriile lor genomi, care sunt probabil vestigii de la progenitorii lor (Gray 1992). Astăzi, știm că genele cp și mt sunt transmise descendenților exclusiv de la părintele matern în diversele taxoni de plante superioare, ferigi, mușchi, alge (Kuroiwa 1991), ciuperci (Mitchell și Mitchell 1952; Kawano și colab. 1987) și animale (Hutchison și colab. 1974), inclusiv oamenii. Moștenirea uniparentală a genomurilor cp/mt a fost mult timp considerată a fi un rezultat pasiv bazat pe faptul că ouăle conțin mai multe numere de organite, în timp ce gameții masculi, în cel mai bun caz, contribuie doar cu câteva (Gyllensten și colab. 1991). Cu toate acestea, procesul de moștenire uniparentală este probabil să fie mai dinamic. Un exemplu clasic și izbitor ar fi apariția moștenirii non-mendeliene în algele verzi unicelulare, Chlamydomonas reinhardtii , care produce gameți de dimensiuni identice (izogame) (Sager 1954). Ciclul de viață al lui C.reinhardtii este extrem de simplu. Există două tipuri de împerechere de C. reinhardtii, tipul de împerechere plus (mt+) și tipul de împerechere minus (mt), controlate de un singur tip de împerechere complex loci pe grupul de legătură VI (Ferris și colab. 2002). C. reinhardtii suferă un ciclu de viață sexuală, care include etape definite de diferențiere (Figura 1). Celulele Vegetative se diferențiază în gameți în condiții de înfometare cu azot și iradiere ușoară (Pan și colab. 1996). În câteva minute de la amestecare, gameții de tipuri de împerechere opuse aderă unul la celălalt prin flageli și fuzionează pentru a forma zigoți. După o perioadă obligatorie de repaus, zigotul suferă meioză și germinare pentru a produce patru descendenți haploizi. Mai mult de 90% din descendenții care se formează moștenesc trăsături de cloroplast (cp), preferențial de la părintele mt+, fenomen descris pentru prima dată în urmă cu mai bine de 50 de ani (Sager 1954). Sager a descris modelele de moștenire a două mutații induse de UV, sr1 și sr2 . Mutația sr1 conferă rezistență la niveluri scăzute ale antibioticului streptomicină, iar mutația sr2 conferă rezistență la niveluri ridicate de streptomicină. Când sr1 a fost trecut la o tulpină sensibilă la streptomicină, nivelurile scăzute de rezistență la streptomicină au fost moștenite, urmând legea lui Mendel. În schimb, când un părinte mt+ care transporta mutația sr2 a fost trecut la un părinte MT sensibil, toți descendenții meiotici au fost rezistenți la niveluri ridicate de streptomicină. În crucea reciprocă, descendenții meiotici erau toți sensibili la streptomicină (Sager 1954). În 1962, dovezile existenței cpDNA au venit din lucrările microscopice ușoare și electronice ale Ris și Plaut (Ris și Plaut 1962). Doar un an mai târziu, Sager și Ishida au descris izolarea cpDNA prin centrifugarea gradientului de densitate a clorurii de cesiu (CsCl) (Sager și Ishida 1963). În 1989, s-a demonstrat că mutația sr2 se localizează în cadrul genei rps12 a genomului cp (Liu și colab. 1989). În 1972, un studiu biochimic a arătat că cantitatea de MT – cpDNA a scăzut în raport cu mt + cpDNA, la 6-24 ore după împerechere (Sager și Lane 1972). ADN – ul din Mt+ și Mt – gameți a fost etichetat fie cu 14 N – sau 15 NH 4 Cl, iar centrifugarea gradientului de densitate CsCl a fost utilizată pentru a monitoriza soarta ADN-ului nuclear și a cpDNA în zigoții 6-și 24-H. La șase ore de la dezvoltarea zigotului, semnalul reprezentând mt – cpDNA a fost clar mai mic decât Mt+ cpDNA, indicând o reducere preferențială a Mt-cpDNA în raport cu mt+ cpDNA. În 1980, primele dovezi moleculare pentru reducerea preferențială a Mt – cpDNA au fost furnizate de Grant și colab. (Grant și colab. 1980). Autorii au monitorizat comportamentul MT + și Mt – cpDNA, profitând de polimorfismele de lungime a fragmentului de restricție (RFLP), într-o tulpină mutantă C. reinhardtii ac-u-g-23 care poartă două ștergeri mici în ADN-ul său cloroplast. Autorii au descoperit că atât ștergerile din cpDNA, cât și fenotipul non-fotosintetic au fost moștenite uniparental. Genomul de cloroplast de 203 kb al lui C. reinhardtii (Maul și colab. 2002) este prezent la ~80-100 de exemplare pe celulă și este organizat în 5-10 complexe ADN–proteine, care se numesc nucleoizi cloroplastici (Kuroiwa și colab. 1981). În 1982, Kuroiwa și colab. s-a constatat că nucleoizii MT-cp colorați cu dapi (fluorocrom specific dsDNA, 4′,6-diamidino-2 – fenilindol) au dispărut preferențial la zigoții tineri în 50 de minute de împerechere (Kuroiwa și colab. 1982). În 1999, dispariția preferențială a nucleoizilor mt – cp a fost observată într-un zigot viu, folosind SYBR Green I (fluorocrom specific dsDNA care poate pătrunde în celulele vii) (Figura 1) (Nishimura și colab. 1999). Interpretarea acestui fenomen dramatic a fost însă controversată, deoarece dispariția preferențială a nucleoizilor fluorescenți MT – cp a avut loc cu mult înainte ca reducerea ADN-ului să fie detectată prin metode biologice biochimice sau moleculare (6-24 ore după împerechere) (Sager și Lane 1972). Au fost propuse două posibilități principale pentru a explica acest lucru. O posibilitate a fost că dezintegrarea nucleoizilor cp ar putea duce la dispersia moleculelor cpDNA, iar a doua posibilitate a fost că digestia rapidă a moleculelor cpDNA ar putea duce la dispariția nucleoizilor cpDNA. O problemă în abordarea acestei întrebări este că reacția de împerechere se realizează folosind milioane de MT + și Mt – gameți (Figura 2). Populația celulară este inevitabil un amestec eterogen de celule, cum ar fi nematați MT+ și Mt – gameți, zigoți cu sau fără nucleoizi MT – cp și zigoți meitotici excepționali (1~5%) care nu formează zigoți meitotici (Ebersold 1967). În general, metodele moleculare și biochimice necesită cantități mari de probe omogene pentru analize precise, iar orice eterogenitate a probelor ar confunda rezultatele. Cu alte cuvinte, “personalitățile” celulelor sau organitelor individuale din cadrul unei populații ar fi diluate și cel mai probabil pierdute în procesul de analiză. Pe de altă parte, microscopia poate dezvălui “personalitățile” la nivel morfologic, dar nu la nivel molecular. Pentru a studia starea moleculelor cpDNA în timpul dispariției nucleoizilor MT – cp, a fost necesar să se colecteze zigoți pe baza prezenței sau absenței nucleoizilor mt – cp și să se analizeze zigoții individuali folosind tehnici biologice moleculare. Pentru a realiza acest lucru, s-au folosit pensete optice (Figura 3). Utilizarea pensetei optice este o tehnică nouă pentru manipularea celulelor vii sau a organelor sub observație microscopică directă (Ashkin și colab. 1987). În acest studiu, un singur zigot cu sau fără nucleoizi cp a fost colectat folosind pensete optice, iar prezența sau absența moleculelor mt – cpDNA a fost determinată prin analiza PCR imbricată. Destinele individuale ale Mt + și Mt – zygotic cpDNA au fost urmate separat folosind un transformant cloroplast LO3c, care adăpostește gena bacteriană Aada (aminoglicozid adenil transferază). Zigoții unici care au fost obținuți cu penseta optică au fost supuși unei analize imbricate-PCR extrem de sensibile pentru aadA (Figura 4)(Nishimura și colab. 1999). Când gameții l03c mt + au fost încrucișați cu gameți mt de tip sălbatic, au fost detectate secvențe de gene aadA în toți zigoții care au fost examinați. Dimpotrivă, când Mt – gameții L03c au fost încrucișați cu gameți de tip sălbatic, secvențele aadA au fost amplificate doar la zigoți mai tineri (10 și 30 de minute după formarea zigotului). După ce nucleoizii fluorescenți MT – cp au dispărut, secvențele Aada nu au mai fost detectate în zigoți (90 și 120 de minute după formarea zigotului). Aceste rezultate indică faptul că moleculele mt – cpDNA sunt digerate complet în 10 minute, timp în care nucleoizii mt – cp dispar și, de asemenea, că cel puțin o nuclează foarte eficientă este activată în Mt-cloroplast imediat după formarea zigotului. Această digestie activă a Mt-cpDNA este probabil baza moștenirii materne a cpDNA. Cel mai simplu model pentru moștenirea uniparentală a cpDNA este că procesul constă din două evenimente distincte care sunt susceptibile să apară în diferite etape ale ciclului de viață: o “protecție” a mt+ cpDNA, probabil în timpul gametogenezei și un “distrugător” al Mt – cpDNA neprotejat în timpul dezvoltării timpurii a zigotului. A) ipoteza restricție –metilare în 1972, Sager și colegii săi au propus că Mt – cpDNA a fost digerat prin acțiunea enzimelor de restricție, în timp ce Mt+ cpDNA a fost protejat prin metilare – un model analog cu sistemul de restricție-metilare bacteriană (Sager și Lane 1972). Sager și colegii au acumulat rapid dovezi convingătoare care arată o creștere a nivelului de metilare a Mt+ cpDNA, care a fost detectat la 7 ore după împerechere (Burton și colab. 1979; Royer și Sager 1979; Sano și colab. 1980). Mai mult, a fost raportată purificarea ADN metiltransferazelor specifice gametului MT+, cu greutăți moleculare de 60 kDa și 20 kDa (Sano și colab. 1981). Acest eveniment specific de metilare MT+ GAMET a fost aparent reversibil, așa cum ar fi de așteptat pentru protecție (Sano și colab. 1984). Gena pentru ADN metiltransferaza rezidentă în cloroplast a fost identificată în cele din urmă în 2002, iar expresia sa specifică gametului mt+ și localizarea cloroplastului au fost confirmate (Nishiyama și colab. 2002). Pe de altă parte, o serie de lucrări din grupuri independente au susținut ulterior că metilarea mt+ cpDNA nu ar putea explica în mod adecvat protecția. Bolen și colab. a izolat un mutant nuclear me1 care metilează constitutiv cpDNA la un nivel superior atât în celulele mt+, cât și în celulele mt (Bolen și colab. 1982). Când gameții me1 au fost folosiți pentru cruci, s-au observat modele normale de moștenire uniparentală, incompatibile cu …