analiza la nivel de genom a legării condensinei în Caenorhabditis elegans

Condensinele I și II împărtășesc cele două subunități SMC MIX-1 și SMC-4 și se disting prin trei subunități non-SMC (figura 1a). Condensin IDC diferă de condensin I cu o singură subunitate, varianta SMC-4 DPY-27. Am folosit unul sau doi anticorpi diferiți împotriva fiecărei subunități de condensină pentru ChIP-seq și am identificat acele situsuri de legare comune în anticorpi multipli și replicate biologice (fișier suplimentar 1: Tabelul S1). Validarea anticorpilor și interacțiunile de coimunoprecipitare așteptate din holocomplexul condensinei sunt prezentate în dosarul suplimentar 2. Corelarea în perechi a scorurilor mediane de îmbogățire a cipurilor subunitățile condensinei i-IDC și II grupate separat, confirmând distribuția subunităților individuale între cele trei tipuri de condensine (figura 1b).

modelele de legare de înaltă rezoluție ale celor trei complexe de condensină sunt similare

C. elegans condensina I și II au localizări cromozomiale parțial suprapuse, dar diferite în mitoză și meioză , iar condensina IDC este orientată în mod specific către X . Prin urmare, ne-am așteptat să găsim diferite modele ChIP-seq pentru condensina I, IDC și II. în schimb, modelele de legare ale subunităților condensinei I, IDC și II au fost în general similare (figura 1C). Această similitudine nu s-a datorat reactivității încrucișate a anticorpilor, deoarece anticorpul HCP-6, care nu prezintă nicio reactivitate încrucișată și nu imunoprecipitează nicio subunitate condensin I-IDC , a prezentat o co-localizare extinsă cu subunitățile condensin I-IDC (vezi HCP-6 în figura 1C). În plus, dacă suprapunerea condensinei II s-a datorat reactivității încrucișate cu condensina IDC, ne-am fi așteptat la o îmbogățire a situsurilor de legare a condensinei II pe X, ceea ce nu a fost cazul (figura 1D). Comparativ cu condensina II, subunitățile IDC ale condensinei au avut în mod constant scoruri mai mari ale cipului pe X, sugerând o diferență în asocierea cromozomială a celor două complexe de condensină capturate de cip (notați scale diferite pe X și cromozomul I în figura 1C). Deoarece am efectuat ChIP-seq în embrioni în stadiu mixt,majoritatea celulelor (mai mult de 95% estimate prin colorarea 4′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)) au fost în interfază. Lipsa subunităților condensin I pe autozomi (figura 1C și fișierul suplimentar 3: Figura S1A) și observația anterioară că condensina i se localizează la cromozomi mitotici după defalcarea anvelopei nucleare sugerează că cea mai mare parte a semnalului ChIP-seq provine din interfază. În sprijinul acestui fapt, condensina II s-a dovedit a fi nucleară în timpul interfazei și a arătat o distribuție mai egală a siturilor de legare între toți cromozomii (figura 1D).

KLE-2, HCP-6 și CAPG-2 sunt specifice condensinei II, reprezentând astfel legarea condensinei II. Condensin I și IDC împărtășesc toate cele trei subunități non-SMC, așa că în continuare ne referim la semnalul ChIP-seq de la DPY-26, DPY-28 și CAPG-1 ca de la condensin I-IDC. Pentru a ne concentra pe site-urile care sunt legate ca un complex, am mediat semnalul cipului de la subunitățile CAP specifice de tip condensin. În plus față de utilizarea datelor medii, am verificat că fiecare analiză a fost adevărată cu subunități unice și prezentăm HCP-6 și DPY-28 în cifre suplimentare. Am identificat un set de site-uri de legare condensin i-IDC și II de înaltă încredere selectând doar acele vârfuri ChIP-seq care au fost consistente în două sau mai multe subunități non-SMC (figura 1D). După cum sa menționat anterior, 97% din legarea condensinei i-IDC a avut loc pe cromozomul X. Condensina II a fost distribuită în mod similar între autozomi și X. Condensina II legată de situsurile condensinei i-IDC mai puternice de pe cromozomul X (figura 1e și fișierul suplimentar 3: figura S1B).

siturile de legare a Condensinei sunt îmbogățite la promotorii activi

pentru a identifica regiunile în care condensinele se leagă preferențial, am analizat siturile de legare a condensinei în ceea ce privește mai multe adnotări genomice. Siturile de legare a condensinei au fost îmbogățite semnificativ la promotori, în apropierea genelor Arnt și ARN necodificatoare (figura 2a, fișier suplimentar 4: Figura s2). Pentru a elimina posibilitatea ca genele Arnt legate de condensină să apară doar la promotori, am eliminat genele Arnt care se aflau la 1 kb de un situs de pornire a transcripției (TSS) și am stabilit că suprapunerea siturilor de legare a Arnt și a condensinei a rămas semnificativă (23% și 6% din Arnt s-au suprapus cu siturile condensinei I-IDC și, respectiv, II, P = 0,0002). Legarea condensinei la genele Arnt sugerează că recrutarea condensinei mediată de TFIIIC poate fi conservată între C. elegans și drojdie .

siturile de Condensină sunt îmbogățite la promotori și Arnt, iar legarea se corelează pozitiv cu transcrierea. (A) îmbogățirea sau epuizarea siturilor de legare a condensinei la diferite adnotări genomice sunt date. Îmbogățirea aleatorie și valorile p au fost calculate printr-un test de permutare distribuind aleatoriu vârfurile condensinei de 10.000 de ori. Atât pentru condensina i-IDC, cât și pentru ii, există o îmbogățire semnificativă a siturilor de legare la promotori de 1 kb și ARN-uri aproape necodificate (P = 0.0002), depleția în corpurile genice [locul de început al transcripției (TSS) la locul de sfârșit al transcripției (TES)] (P = 0,0002) și nicio îmbogățire sau epuizare semnificativă la 3′ de gene (P > 0,05). (B) semnalul cipului de Condensină este aliniat la TSSs al genelor exprimate (top 25% după nivelul ARN, linii solide) și al genelor neexprimate (bottom 25% după nivelul ARN, linii punctate). Punctele înconjurătoare reprezintă nivelul de încredere de 95%. Ca martor, semnalul cipului imunoglobulinei G (IgG) la TSSs este reprezentat în gri. (C) coeficientul de corelație Spearman rank între scorul median al cipului la promotorii 500 bp și nivelul ARN la genele respective sunt date pentru întregul genom și cromozomul X. Există o ușoară corelație pozitivă între legarea condensinei și transcripție. (D) scorul Median al cipului la 500 bp în amonte de TSS este reprezentat grafic față de nivelul ARN al fiecărei gene. Genele legate de promotorul condensinei (definite prin suprapunere cu un situs de condensină la 1 kb de TSS) sunt evidențiate în portocaliu (condensina I-IDC) și albastru (condensina II). (E) conținutul GC al ferestrelor de 50 bp este reprezentat grafic pe vârfurile de legare condensin I-IDC și II. Ca control, conținutul GC peste 1500 de coordonate aleatorii a fost determinat și reprezentat grafic în același mod ca și vârfurile condensin reale. Conținutul mediu de GC este ridicat în jurul vârfului de legare a condensinei.

legarea a fost cea mai mare la 500 bp de TSS (fișier suplimentar 5: Figura S3A) și 45% din condensina i-IDC și 62% din vârfurile condensinei II au fost localizate la promotori. Legarea condensinei la promotori s-a corelat pozitiv cu activitatea transcripțională a genei din aval (figura 2b,C), dar nu toți promotorii activi au fost legați (figura 2D). Analiza pe termen lung a ontologiei genetice a promotorilor legați a arătat o îmbogățire ușoară (de 1,3 ori), dar semnificativă (P = 3,5 e-17) pentru genele cu funcție de dezvoltare embrionară (fișier suplimentar 6: tabelul s2). Aproximativ 20% din genele foarte exprimate (quartila superioară după nivelul ARN) au avut un situs de legare a condensinei II în limita a 1 kb și aproximativ 70% din genele cromozomului X au avut un situs de legare a condensinei I-IDC în limita a 1 kb. Prin urmare, deși activitatea transcripțională este importantă, nu este suficient să se explice specificitatea legării condensinei la anumiți promotori.

am observat că toate locurile de legare a condensinei au prezentat o îmbogățire proeminentă a conținutului GC în comparație cu regiunile înconjurătoare și coordonatele aleatorii (figura 2e). În C. elegans, conținutul de GC al promotorilor cromozomului X este mai mare decât cel al promotorilor autozomali . Este posibil ca un conținut mai mare de GC să fie o caracteristică a secvenței ADN pentru legarea condensinei, iar promotorii X au evoluat pentru a conține un conținut mai mare de GC pentru a susține legarea IDC a condensinei.

siturile de legare a Condensinei coincid semnificativ cu un subset de factori de transcripție

pentru a determina factori suplimentari care disting promotorii legați de condensină, am comparat siturile de legare a condensinei și TF și am găsit un subset de TFs care se leagă de aceiași promotori ca și condensinele (figura 3a). Studiile anterioare au arătat că mai multe TF se leagă de un set de site-uri de legare cu ocupare ridicată (HOT) . A existat o suprapunere de 5% și, respectiv, 22% a situsurilor condensinei i-IDC și condensinei II cu situsuri fierbinți (P = 0,0002). Semnificația suprapunerii cu TFs a rămas aceeași atunci când siturile fierbinți au fost eliminate din analiză (fișier suplimentar 5: Figura S3B). Procentele de suprapunere pentru fiecare TF depindeau de numărul de situri de legare și sunt prezentate în fișierul suplimentar 5: Figura S3C. printre TF-urile individuale, Am constatat că 69% din siturile condensinei II și 53% din siturile LIN-13 s-au suprapus între ele, făcând LIN-13 TF-ul superior care s-a suprapus semnificativ cu condensina II.

legarea Condensinei II se suprapune cu factorii de transcripție non-aleatoriu, iar analiza expresiei sugerează o funcție represivă pentru condensina II. (a) siturile factorului de transcripție din modENCODE sunt clasificate după îmbogățirea pliată a suprapunerii cu siturile de legare a condensinei. Îmbogățirea Fold este determinată ca raportul dintre suprapunerea procentuală observată față de media distribuțiilor aleatorii ale siturilor de condensină de 10.000 de ori pe genom. Rezultatele indică faptul că legarea condensinei nu este aleatorie în ceea ce privește locurile de legare a TF. (B) diagramele Venn arată suprapunerea situsurilor de legare a condensinei II cu LIN-13 (modencode_3342, embrioni) și LIN-35 (modencode_3925, embrioni tardivi) (sus), numai cu LIN-13 (stânga jos) și numai cu LIN-35 (dreapta jos). Proporția de suprapunere între condensina II și LIN-13 și LIN-35 este mai mare la locurile ocupate de ambele proteine. Suprapunerea dată reprezintă numărul de vârfuri de condensină II care se suprapun cu siturile LIN-13 și LIN-35 respective. (C) îmbogățirea medie ChIP-seq din condensina II, LIN-13 și LIN-35 sunt reprezentate grafic pe vârful fiecărui vârf al condensinei II. Locurile de legare a condensinei II sunt împărțite în patru grupe. Grupul superior este format din situsuri de legare a condensinei II care se suprapun cu LIN-13 și LIN-35, al doilea se suprapune doar cu LIN-13, al treilea doar cu LIN-35 și ultimul grup nu se suprapune nici cu LIN-13, nici cu LIN-35. Vârfurile sunt în scădere ordonate pe baza îmbogățirii cipurilor. Un număr mare de site-uri cu condensină II prezintă legături LIN-13 ridicate, dar nu LIN-35. Legarea condensinei II este mai puternică în locurile legate atât de LIN-13, cât și de LIN-35. (D) analiza expresiei diferențiale (ARN-seq) în KLE-2 heterozigot nul versus stadiul larvar homozigot 2/3 (L2/L3) larve. Sunt prezentate proporțiile genelor legate sau nelegate de KLE-2 cu creșterea sau scăderea nivelului de transcriere la mutantul homozigot. Nivelurile de transcriere a creșterii proporționale a mai multor gene în mutantul kle-2. TF, factorul de transcripție.

Lin-13 are un motiv de interacțiune cu proteina retinoblastomului (pRb) și funcționează în dezvoltarea vulvară cu un singur omolog PRB LIN-35 în C. elegans . În D. melanogaster, subunitatea condensinei II dcapd3 care se leagă de cromatină este redusă la mutația pRb . Dacă, în C. elegans, LIN-13 recrutează condensina II prin LIN-35, atunci acele site-uri LIN-13 care sunt, de asemenea, legate de LIN-35 (576) ar trebui să se suprapună cu condensina II mai mult decât acele site-uri LIN-13 care nu sunt legate de LIN-35 (1.033). Suprapunerea siturilor coocupate LIN-13 și LIN-35 cu siturile condensinei II a fost doar puțin mai mare decât cea a siturilor LIN-13 fără LIN-35, 60% și, respectiv, 50% (figura 3b). În schimb, suprapunerea LIN – 35 cu condensina II a fost mai mare la acele situri care au fost, de asemenea, legate de LIN-13 (45%) comparativ cu siturile nelegate (9%). Acest lucru sugerează că interacțiunea potențială dintre LIN-13 și condensina II este în mare parte independentă de LIN-35. LIN-35 funcționează într-un complex multi-proteic conservat numit DRM în C. elegans (hDREAM la om) care conține și EFL-1 și DPL-1 . Cele 555 de situsuri de legare DRM care au fost legate de LIN-13 au prezentat o suprapunere mai mare cu condensina II (63%) comparativ cu 787 de situsuri DRM care nu au fost legate de LIN-13 (13%). Am împărțit siturile condensinei II în patru grupe în funcție de suprapunerea sitului de legare cu LIN-13 și LIN-35 (figura 3c). Această grupare a indicat faptul că un număr mare de site-uri cu condensină II prezintă o legare ridicată a LIN-13, dar nu LIN-35, sugerând că, dacă recrutarea condensinei ii mediată de pRb este conservată în C. elegans, LIN-35 poate depinde de prezența LIN-13 pentru recrutarea condensinei II.

mutația Condensinei ii provoacă defecte transcripționale care sugerează o funcție represivă

în drojdie și D. melanogaster, condensina a fost implicată în represiunea transcripțională . Un studiu recent efectuat în D. melanogaster a indicat faptul că subunitatea condensinei II CAPD3 este necesară pentru activarea transcripțională a unui grup de gene peptidice antimicrobiene . Pentru a înțelege rolul condensinei II în reglarea transcripției, am efectuat ARN-seq în larvele kle-2 mutante nule L2/L3. KLE-2 încărcat matern permite mutantului nul kle-2 (alela ok1151) să crească pentru a fi adulți sterili. Am comparat expresia genelor în mutanții KLE-2 heterozigoți și homozigoți în larvele L2/L3 înainte ca linia germinală să fie proliferată, conținând astfel aproape în întregime nuclee interfazice. Analiza expresiei diferențiale folosind DESeq2 a identificat 356 de gene a căror expresie a fost semnificativ diferită la homozigot comparativ cu larvele heterozigote (rata de descoperire falsă < 5%; Rezultatele DESeq2 sunt prezentate în fișierul suplimentar 7: tabelul S3). Majoritatea genelor exprimate diferențiat au crescut (70%) mai degrabă decât au scăzut (30%) în Expresie. Analiza pe termen lung a ontologiei genetice nu a evidențiat un anumit grup de gene care au fost afectate de mutația KLE-2. Similar datelor publicate pentru condensin IDC, nu a existat o corelație directă între legarea KLE-2 și modificările expresiei genelor. Important, printre cele 46 de gene diferențiate exprimate și legate de KLE-2, 83% au crescut în Expresie comparativ cu 67% din 310 gene care nu au fost legate de KLE-2 (Figura 3d), sugerând că efectul direct al legării condensinei II este în mare parte represiv.

modificările histonei asociate cu cromatina deschisă se corelează pozitiv cu legarea condensinei

pentru a înțelege contextul cromatinei legării condensinei, am analizat relația dintre situsurile de legare a condensinei și caracteristicile cromatinei mapate de modENCODE . Am observat o corelație generală pozitivă între legarea condensinei și semnele cromatinei active. În drojdie, numărul de situsuri de legare a condensinei pe tot parcursul ciclului celular se corelează direct cu lungimea cromozomului. Numărul de C. siturile de legare a condensinei elegans II nu au fost proporționale cu lungimea cromozomului (figura 4a), ci au fost corelate pozitiv cu lungimea cromozomilor asociați cu semnele histonice active (figura 4b). Cromozomul X a fost o excepție, probabil datorită mecanismelor de compensare a dozei care îi modifică cromatina . Legarea condensinei I-IDC și II de-a lungul genomului s-a corelat pozitiv cu semne de cromatină deschise, cum ar fi H3K27ac și negativ cu semne de heterocromatină, cum ar fi H3K27me3 și H3K9me3 (figura 4C și fișier suplimentar 8: figura S4). Această corelație a fost la nivel de domeniu (așa cum a fost analizată în windows 1 kb), deoarece nu am văzut o anumită modificare a histonei care a atins punctul culminant la site-urile de condensină într-un tip de analiză ‘metagene’ (datele nu sunt prezentate). În studiile de imunofluorescență, proteinele centromere s-au suprapus cu legarea condensinei II în celulele mitotice . Nu s-a observat o corelație pozitivă între semnalele CENP-a și condensin II ChIP-seq în embrionii în stadiu mixt, sugerând că, în nucleele interfazice (majoritatea nucleelor din celulele embrionare în stadiu mixt), nu există nicio suprapunere. Alternativ, având în vedere că CENP-a se leagă doar de un mic subset al regiunilor pozitive CENP-a din genom pe celulă , suprapunerea CENP-a cu condensina II ar putea fi evidentă doar în celule unice. Pentru a înțelege care factori de cromatină prezic cel mai bine legarea condensinei, am folosit o abordare de învățare automată. În C. elegans, H4K20me1 este foarte îmbogățit pe cromozomul X de către DCC și, prin urmare, H4K20me1 a fost cel mai discriminativ factor pentru legarea IDC a condensinei (figura 4D). Pentru condensina II, caracteristicile cromatinei extrem de predictive sunt H3K27ac și CBP, ambii markeri ai potențiatorilor activi, sugerând că legarea condensinei este îmbogățită la amelioratori activi . Dintre 201 de site-uri de legare a condensinei II care au fost la 2 kb distanță de un TSS adnotat, 58 s-au suprapus cu un site de legare CBP (P = 0,0002).

factorii de cromatină asociați cu cromatina deschisă și amplificatorii se corelează pozitiv cu legarea condensinei. (A) Numărul de vârfuri de condensină II este reprezentat grafic în raport cu lungimea liniară a fiecărui cromozom. (B) Numărul de vârfuri de condensină II este reprezentat grafic în funcție de lungimea cromozomului acoperit de vârfurile H4K8Ac și H4K16Ac. O linie de tendință adaptată datelor autozomale indică o corelație pozitivă (R2 = 0,9). (C) legarea Condensinei în cadrul ferestrelor contigue de 1 kb pe cromozomul X (stânga) și autozomii (dreapta) se corelează pozitiv cu semnele active (de exemplu, H3K27ac, H2A.Z) și se corelează negativ cu semnele represive (de exemplu, H3K27me3, H3K9me3). (D) un clasificator de ansamblu (păduri aleatorii) a fost învățat să prezică legarea condensinei de-a lungul genomului. Primele 20 de caracteristici (dintre 92 de caracteristici totale, fișier suplimentar 1: Tabelul S1) cu cea mai mare putere predictivă sunt reprezentate grafic pentru condensin I-IDC (stânga) și condensin II (dreapta) cu cea mai importantă caracteristică deasupra. Caracteristicile sunt clasificate pe baza scăderii medii a preciziei, care descrie diferența dintre rata de eroare a clasificării reale și rata de eroare după permutarea caracteristicii, în medie pentru toți clasificatorii (arborii).

motivele secvenței ADN îmbogățite la situsurile de legare a condensinei prezintă caracteristici specifice

deși condensina II legată de situsurile condensinei I-IDC de pe x, condensina I-IDC nu s-a legat de majoritatea situsurilor de legare a condensinei ii autozomale (figura 1D). Pentru a înțelege specificitatea recrutării condensinei IDC și II, am căutat caracteristici ale secvenței ADN care disting legarea CONDENSINEI II și a CONDENSINEI IDC. Studiile anterioare au arătat că IDC-ul condensinei este recrutat mai întâi la aproximativ 100 de site-uri și apoi se răspândește la alte site-uri cromozomiale . Un motiv de secvență ADN de 10 bp a fost îmbogățit la site-urile de recrutare IDC cu condensină (figura 5A) și mutația motivului a abolit recrutarea IDC cu condensină pe matrice extrachromozomale , indicând faptul că motivul secvenței ADN IDC cu condensină joacă un rol important în recrutarea IDC cu condensină.

am găsit un motiv de secvență ADN conținând GCGC care a fost îmbogățit sub situsurile de legare a condensinei II (figura 5A). Este interesant de observat că atât motivul condensinei II, cât și motivul condensinei IDC au inclus nucleul GCGC, dar motivul CONDENSINEI IDC a fost extins pe o parte de AGGG, sugerând că X-specificitatea recrutării condensinei IDC este realizată de cofactori care recunosc AGGG. La nivelul genomului, 11% din motivele condensinei II au fost legate de condensina II. astfel, similar cu alte TFs (de exemplu, ), doar o parte din motivele potențiale ale secvenței ADN au fost legate de condensina II. alți factori, cum ar fi accesibilitatea cromatinei și co-factorii necunoscuți, pot fi implicați în specificitatea legării. Într-adevăr, dacă am luat acele motive care se aflau într-o fereastră de 2 kb îmbogățită semnificativ pentru o marcă histonică activă, cum ar fi H4K16ac, procentul de motive care au fost legate a crescut de la 11% la 29%. În plus, similar cu motivul condensin IDC , care este mai grupat la site-urile legate, am constatat că ferestrele genomice de 1 kb care conțineau mai mult de un motiv condensin II erau de aproximativ 2,5 ori mai susceptibile de a fi legate de condensin II, comparativ cu cele cu un singur motiv. Prin urmare, gruparea motifurilor și contextul deschis al cromatinei ajută la specificarea selecției motivelor care sunt legate.

recrutarea cromozomială a condensinei Idcși condensina II implică atât regulatori împărțiți, cât și distincți. (A) sunt prezentate logo-urile Motif ale motivelor secvenței ADN de 10 bp îmbogățite în locurile de condensare superioare. (B) este prezentată suprapunerea dintre locurile de legare ale condensinei i-IDC, condensinei II și SCC-2. Numerele de sub fiecare factor indică numărul total de site-uri de legare. Numerele suprapuse se bazează pe numărul de vârfuri SCC-2. (C) Universitatea din California Santa Cruz (UCSC) vizualizare browser exemplificând semnalul SCC-2 ChIP-seq, care este în mare parte limitat la promotori. (D) legarea SCC-2 și a condensinei II la un loc de recrutare bine definit al condensinei IDC pe x (rex-1). (E) în mutantul nul sdc-2 (TY1072), condensina I-IDC (DPY-26), condensina II (HCP-6, KLE-2) și legarea SCC-2 este diminuată la rex-2 (panoul din stânga), dar rămâne în mare măsură similară pe autozomi (panoul din dreapta). (F) graficul în cutie al raportului de îmbogățire a cipurilor în mutantul SDC-2 față de tipul sălbatic în vârfurile de legare ale SCC-2. Siturile de legare sunt clasificate ca fiind pe autozomi, pe X cu legare SDC-2 scăzută și legare SDC-2 ridicată. (G) analiza qPCR a îmbogățirii cipurilor DPY-27 în embrioni izolați de la adulți care au fost hrăniți vector (control) și PQN-85 RNAi. Îmbogățirea cipurilor este exprimată în raport cu locusul de control negativ. Barele de eroare sunt abaterile standard de la trei la cinci replici biologice. ChIP, cromatină imunoprecipitare; DCC, complex de compensare a dozei.

nu toate locurile de legare a condensinei II au motivul. La acele site-uri de condensină II fără motiv, alți factori pot fi responsabili pentru legare. Alternativ, proporția scăzută de situri cu condensină II (27%) care conțin un motiv poate fi explicată prin răspândirea potențială a condensinei II după recrutare. Nu se așteaptă ca locurile de răspândire să conțină motivul. De exemplu, pentru condensin IDC, un procent ridicat de site-uri potențiale de recrutare (56%) conțin motivul, dar nu site-uri de răspândire (8%) . Este necesară o analiză sistematică a capacității de recrutare a siturilor condensin II identificate pentru a aborda dacă există o răspândire.

SDC-2 este necesar pentru legarea condensinei I-IDC, a condensinei II și a încărcătorului de coezină la locurile de recrutare a DCC cromozomiale X

în metazoane, proteinele care sunt implicate în recrutarea condensinei la cromozomi nu sunt bine înțelese. În drojdie, legarea condensinei se suprapune cu cea a complexului de încărcare a coezinei Scc2 / 4, ceea ce crește asocierea condensinei cu cromozomii . Pentru a testa dacă suprapunerea cu Scc2 / 4 este conservată între drojdie și C. elegans, am efectuat analiza ChIP-seq a SCC-2 (cunoscută și sub numele de PQN-85) și am constatat că un remarcabil 95% din siturile SCC-2 s-au suprapus cu condensina I-IDC pe X și 60% cu condensina II la nivel de genom (figura 5b). Suprapunerea a rămas similară atunci când regiunile fierbinți au fost excluse (fișier suplimentar 9: figura S5A). Nu toate locurile de condensină s-au suprapus cu SCC-2, sugerând că, spre deosebire de drojdie, condensina nu depinde de SCC-2 pentru legare . Legarea SCC-2 a fost mai mare la promotori și corelată pozitiv cu transcrierea (fișier suplimentar 9: figura S5B). Un motiv de secvență ADN care conține GAGA a fost prezent în 58% din Site-urile de legare SCC-2 (fișier suplimentar 9: figura S5C). Spre deosebire de Drosophila Nipped-B și similar cu S. cerevisiae Scc2 , legarea SCC-2 nu a fost ridicată în regiunile transcrise , dar a rămas intergenică (figura 5C).

suprapunerea aproape completă (96%) a situsurilor de legare a condensinei II cu condensina I-IDC pe cromozomul X susține existența unor mecanisme comune pentru legarea cromozomială a diferitelor condensine. Deoarece condensin II și SCC – 2 legat de site-uri de recrutare condensin IDC pe X (figura 5D și fișier suplimentar 9: Figura S5D), am emis ipoteza că recrutorii condensin IDC recrutează și condensin II și SCC-2. Hermafrodit-recrutarea specifică a condensinei IDC la cromozomul X este realizată de SDC-2, SDC-3 și DPY-30 . Am efectuat HCP – 6 și KLE-2 (condensin II), DPY-26 (condensin I-IDC) și SCC-2 ChIP-seq în embrioni mutanți nuli sdc-2. În mutantul sdc-2, legarea DPY-26, HCP-6, KLE-2 și SCC-2 au fost eliminate la un loc de recrutare IDC cu condensină specifică x (rex-2) (Figura 5e). Nu este clar de ce legarea HCP-6 și KLE-2 la rex-2 a fost diminuată în loc să semene cu un situs de condensină autozomală. Legarea SCC-2 pe autozomi și siturile cromozomului X care sunt independente de SDC-2 a rămas similară în mutantul sdc-2 în comparație cu siturile care au fost legate de SDC-2 (Figura 5f). Rezultatele noastre sugerează că SDC-2, TF-ul specific hermafroditului care recrutează condensina IDC la cromozomul X, recrutează, de asemenea, condensina II și subunitatea complexă de încărcare a coezinei SCC-2 în aceleași site-uri (fișier suplimentar 10: figura S6). Studiile genetice anterioare au stabilit că o mutație nulă sdc-2 nu provoacă letalitate embrionară la bărbați, astfel funcția de recrutare a condensinei II și SCC-2 de către SDC-2 nu este esențială pentru condensarea și segregarea generală a cromozomilor . Este posibil ca recrutarea SCC-2 și condensin II de către SDC-2 să aibă o funcție de reglare a genei specifice hermafroditului.

pentru a testa dacă SCC-2 are un efect asupra asocierii cromozomiale a condensinei IDC la locul de recrutare, am efectuat analiza cantitativă PCR a cipului DPY-27 în control față de embrionii de knockdown SCC-2. Prin hrănirea RNAi, am reușit să eliminăm nivelurile SCC-2 cu aproximativ 80% (fișier suplimentar 9: figura S5E). La knockdown SCC-2, nu am văzut o schimbare semnificativă în legarea DPY-27 la rex-1 sau rex-2 (Figura 5g). În mod consecvent, analiza imunofluorescenței legării condensinei I și II pe cromozomii meiotici nu a arătat o diferență semnificativă între mutanții de tip sălbatic și SCC-2 .