ARN Circular: funcții, aplicații și perspective

Introducere

ARN Circular (circRNA) a fost descoperit în virusurile ARN ca viroizi la mijlocul anilor 70, inițial ipotezat a fi o eroare de îmbinare a ARN-ului endogen . Datorită avansării în analiza computațională și tehnicile de secvențiere a ARN în același deceniu, aceste structuri circulare neînțelese au fost în cele din urmă recunoscute corect și profund atât în structură, cât și în funcționalitate . La baza sa, circRNA este un ARN monocatenar, dar diferă de ARN-ul liniar mult mai cunoscut prin faptul că s-a închis continuu prin unirea covalentă a capetelor sale 5′ și 3′, prezentând astfel câteva proprietăți fascinante care nu sunt pe deplin explorate: schele complexe proteice, modularea genei parentale, interacțiunile ARN-proteină și buretele microARN (miARN), pentru a numi doar câteva . Acum se consideră că acestea oferă funcții esențiale de reglementare atât pentru plante, cât și pentru animale . Un număr din ce în ce mai mare de grupuri de studiu au demonstrat și verificat într-o măsură nivelul de eficacitate și eficacitate afișat în ARN-urile circulare, care este de obicei necesar în tratamentele medicale viabile și în alte aplicații biotehnologice. De exemplu, cazurile de biomarkeri tradiționali care sunt mult depășite de substituenții circRNA propuși sunt raportate adesea. Susținută de sprijinul tot mai mare și de dovezi cu privire la capacitățile promosing ale circrna, mai multe investigații și interes ar trebui să fie scoase ca atare, nu doar dintr-o înțelegere biologică cuprinzătoare de bază a structurilor și mecanismelor sale, ci și la un nivel sistematic al interacțiunilor lor cu moleculele și mediile înconjurătoare. Aplicabil vorbind, arnc sunt la egalitate în ceea ce privește potențialul și viabilitatea sa de a viza cancerul și alte boli maligne cu alte tratamente noi, cum ar fi medicina personalizată și terapiile cu celule stem.

CircRNA caracteristici

Circrna constau în general din 1-5 exoni, iar intronii care flancează exonii sunt de până la 3 ori mai lungi decât omologul lor liniar. O analiză mai atentă a relevat prezența multor repetiții Alu invertor complementare în segmentele intron, ceea ce îi determină pe unii să speculeze acest aranjament special facilitează de fapt site-urile de îmbinare să se localizeze cu ușurință și să promoveze circularizarea. Deoarece sunt structuri cu buclă strânsă, nu există efectiv structuri finale de 5′ și 3′, cum ar fi cozile Poli-A și capacele de 5′ în circRNA, făcându-le imune la clivajul exonucleazei . Empiric, acestea durează de 2,5 ori mai mult decât omologii lor liniari din celulele mamare, așa cum este ilustrat într-un studiu realizat de Enuka și colab. . Datorită acestor proprietăți fizice, tehnici comune de screening de laborator, cum ar fi degradarea Rnazei R – o enzimă care degradează exclusiv ARN liniar – precum și testarea cozii Poli-A pot selecta cu precizie structuri strânse în buclă peste forme liniare. Mai multe grupuri de cercetare din ultimii ani și-au schimbat accentul pe identificarea potențialelor izoforme circRNA, structuri care sunt exprimate inițial din același ADN parental, dar sunt ușor diferite unele de altele în forma sa matură finală datorită diferențierii specificității spliceozomilor pentru a recunoaște exonii și intronii pe catena pre-ARNm . Grupurile notabile includ Salzman, Jeck, Memczak, Guo și Zhang . Ca atare, diversitatea incredibilă a circRNAs a explicat: 20.000 de tipuri diferite au fost identificate în eucariote până în prezent, un număr care rămâne până în prezent deschis .

Biogeneza și clasificarea CircRNA

formarea circrn-urilor rezultă din poziționarea și codarea grupurilor exonice și intronice, care sunt segmente care sunt rezervate și eliminate în produsul final modificat post-transcripțional . În mod normal, un ARN mesager matur se formează atunci când un complex proteină-ARN numit spliceozom catalizează scindarea segmentelor intron într-o moleculă precursor-ARNm, de obicei prin recunoașterea secvențelor specifice care flancează segmentul intron la ambele capete. Segmentele exonice fuzionează, în timp ce segmentele intronice sunt în consecință scoase și degradate. Această percepție convențională nu ia în considerare abaterea și diferența de potență în toate locurile de îmbinare , dintre care unele, ca urmare, spliceozomul poate ignora și duce inevitabil la sinteza circRNA. În plus, contribuția aranjamentului spațial al sitului de îmbinare 5′ și 3′ nu trebuie ignorată, deoarece dacă primul este poziționat în aval de acesta din urmă, atunci spliceozomul construiește în mod favorabil o structură circulară închisă covalent peste o moleculă exonică liniară . Acest mecanism, denumit în mod obișnuit “Scrambling Exon” dă naștere la diferite tipuri de circRNAs, inclusiv exonic, intronic, exon-intronic și intergenic . În cazurile specifice cancerului, structura internă este și mai dificil de determinat datorită naturii expansive și astfel invazive a tumorilor maligne . Am descris pe scurt biogeneza și funcționalitatea circRNAs în Fig. 1.

Prezentare generală a biogenezei și funcționalității ARN Circular. Explicație și note de subsol: a un ARN mesager în forma sa matură, în care interacțiunea dintre exoni și introni este absentă. B Circularizare determinată de Lariat. Exonul din amonte (exonul 1) și exonul din aval (exonul 4) sunt legați covalent datorită ARNm îmbinat. Acest lucru facilitează producerea unui ARN lariat alături de exonii împerecheați care rămân, care sunt exonii 2 și 3. Circularizările conduse de proteine care leagă ARN-ul c și de asocierea intronilor. În ambele cazuri, intronii din amonte și din aval (intronii 1 și 3) sunt împerecheați pentru a oferi posibilitatea ca exonii sandwich (exonii 2 și 3) să interacționeze, singura diferență este că, în primul caz, o moleculă externă RBP se alătură ecuației pentru a facilita în mod activ reacția, în timp ce cu circularizarea condusă de asocierea intronilor, gruparea hidroxil și gruparea fosfat a intronilor din amonte și, respectiv, din aval se împerechează independent. d ecircRNA sau ElcircRNA este produsă indiferent de calea de circulație. În unele cazuri, segmentele intronice se află în buclă, dând astfel naștere ElcircRNAs spre deosebire de ecircRNA care conține segmente pur exonice. funcționalitățile e ale circrna mature includ spongarea miARN, acționând ca un inhibitor dublu pentru unele reacții chimice; traducerea proteinelor este posibilă, deși destul de rară și se efectuează cercetări pentru a înțelege cum diferă de traducerile ARN liniare; formațiunile complexe de proteine RBP ajută la reglarea și moderarea căilor și influențează indirect producerea altor circrna; interacțiuni ARNm, fie ele facilitatoare sau inhibitoare

funcția CircRNA: bureții microARN

datorită unicității în structurile circRNA, ei nu codifică proteine precum formele liniare . Studiile au arătat, cu dovezi empirice de susținere, că anumite circrna acționează ca bureți microARN și obstrucționează în mod eficient mecanismul lor. MicroARN-urile sunt secvențe de ARN necodificatoare lungi de 21-nt care ajută la reglarea post-transcripțională a expresiei genelor, de obicei prin fixarea lor pe ARNm și inhibarea traducerii sale în proteine fie prin moda competitivă, fie necompetitivă. Acestea sunt clasificate în familii după regiunile lor de semințe, în funcție de faptul dacă împărtășesc aceeași secvență de nucleotide din pozițiile 2 până la 7 . ARNr-urile posedă complementaritatea pentru a se contracara pe microARN-uri, recunoscând regiunile de semințe ale miARN-urilor și dezactivându-le competitiv. Două circrna în special, respectiv cdr1as și circSRY, sunt în centrul atenției pentru cercetarea științifică în prezent. Se observă că CDR1as conține 70 de situri de legare conservate pentru miARN-7, mult semnificativ decât orice alt burete liniar miARN. Capacitatea sa de sponging este confirmată de Memczak și colab. , care a utilizat sechestrarea moleculelor CDR1as împotriva expresiei crescute a miR-7 în creierul peștilor zebra pentru a obține dovezi justificative ale activităților inhibitoare ale CDR1as împotriva miARN vizate prin monitorizarea dezvoltărilor ulterioare ale creierului mijlociu al peștilor Zebra. CircSRY, pe de altă parte, este testat în testicule murine și se observă atacul său complementar asupra regiunii semințelor miR-138 . Deoarece conține 16 situri de legare specifice, un număr încă impresionant printre toate moleculele de burete, ipoteza lor de funcționalizare a buretelui este confirmată .

funcția CircRNA: interacțiunea cu RBPs și traducerea proteinelor

unii au descoperit că circRNA reglează transcrierea și expresia genelor prin alte căi. Acestea pot interacționa cu proteinele de legare a ARN-ului (RBPs), cum ar fi circ-Foxo3 și formează împreună un complex care influențează supraviețuirea și proliferarea celulelor prin interacțiunea cu p21 și CDK2 ; unele consolidează stabilitatea ARNm prin formarea structurilor duplex, cum ar fi în cazul CDR1as. Pe o notă mai controversată, grupuri precum Legnini I. și colab. și Pamudurti N. R. și colab. a descoperit că anumite circRNAs se pot traduce pentru proteine, una în mioblaste murine și una în capete de muscă . O astfel de știre aduce noi ipoteze cu privire la capacitățile circRNA, considerate în mod convențional a fi necodificate . De la prima descoperire a proteinelor traduse din virusul hepatitei-un circRNA monocatenar, unii au verificat activarea capacității de translație a circRNA prin introducerea unui IRES (situsul intern de intrare a ribozomului) în amonte de codonul de pornire . Este nevoie de mult mai mult pentru a înțelege pe deplin mecanismul exact de translație al acestor circrna și de ce funcționează în timp ce majoritatea altora nu.

potențial de aplicare a Arnc

într-o notă mai practică, arnc sunt biomarkeri viabili pentru diagnosticul și tratamentul bolilor, deoarece nu pot fi ușor degradate de exonucleaze datorită structurii lor circulare închise. În unele cazuri, s-a constatat că circrna-urile depășesc biomarkerii convenționali. De exemplu, reglarea în sus a circ-PVT1 în țesuturile cancerului Gastric (GC) îmbunătățește activitatea spongioasă a miR-125 și încurajează ulterior proliferarea GC ; hsa_circ_0000190 a atras, de asemenea, atenția operând exact invers – reglarea descendentă apare atunci când intră în contact cu GC și este testată pentru a fi mai sensibilă și mai specifică decât biomarkerii ca CEA și CA 19-9 . Un alt exemplu este în carcinomul hepatocelular (HCC), unde biomarkerul prezent în utilizarea predominantă este alfa-fetoproteina (AFP) . AFP prezintă o sensibilitate slabă, prin care 40% din toți pacienții cu HCC au testat niveluri normale de AFP. Modul constructiv de a stimula această sensibilitate este prin combinarea cu alți markeri, ceea ce nu este o soluție eficientă. Alternativ, Xingchen Shang și colab. a sugerat corelația dintre circ_005075 și dimensiunea tumorii , enumerându-l ca un biomarker prognostic viabil care este superior atât în eficacitate, cât și potențial datorită stabilității și specificității lor. Acest lucru sugerează că dezvoltarea și invazia HCC sunt strâns legate de circrna, deși mecanismul său complet este încă neclar. Cu toate acestea, lista biomarkerilor circRNA fezabili aplicabili cercetării cancerului nu se limitează doar la aceste două boli. Am rezumat studiile disponibile privind arnc implicate în diferite boli umane, care pot fi găsite în tabelul 1.

studii recente suplimentare au identificat și încearcă să decodeze îmbogățirea și stabilitatea circRNAs în exozomi, o combinație care ar putea spori și mai mult capacitatea de direcționare a circRNAs. Exozomii sunt vezicule extracelulare a căror funcție principală este de a transporta diverse conținuturi celulare, substanțe chimice, precum și factori, permițând astfel interacțiunea și răspunsul celulă-celulă . Ca atare, un număr considerabil de modificări celulare și răspuns tisular sunt o consecință a faptului dacă vezicula corespunzătoare a aceleiași compatibilități a ajuns cu succes la destinație și răspunsuri ilicite sau factori transportați . Obținerea unei înțelegeri a mecanismului exozomului poate ajuta la obținerea mediilor asupra micromediilor tumorale și a rețelelor intercelulare, ceea ce a dus recent la un mare interes pentru circRNA exosom, având în vedere posibilitatea unei eficiențe consolidate și a capacității de direcționare asupra celulelor maligne sau care funcționează defectuos.

originea circrn-urilor depinde în cele din urmă de nivelurile miARN corespunzătoare din celulele lor donatoare, care pot fi atât imune, cât și neimune în natură. ARN-urile exozomale pot minimiza deteriorarea ADN-ului prin accelerarea ciclului celular, așa cum se arată într-un caz recent de supraexprimare a miR-217, rezultând reducerea expresiilor clclin-D1 și EZH2. Se crede că acest comportament este legat de proliferarea dereglată în formațiunile neoplaziei . Mai mult, multe rezultate experimentale au concluzionat relația directă dintre exozomi și transformarea neoplazică, precum și efectul mecanicist al circRNA asupra micromediului tumoral . Luând adenocarcinomul ductal pancreatic (PDAC), de exemplu, a fost asociat expresia anormală ridicată a exozomului circ-PED8A ; exozomul circNRIP1 promovează metastaza în cancerul Gastric (GC) prin sponging miR-149-5p, într-un alt studiu. Poate cel mai semnificativ este rolul exozomului circPTGR1 asupra dezvoltării carcinomului hepatocelular (HCC) , prin care reglarea ascendentă a exozomului circRNA a încurajat invazia tumorală. Datorită acestor constatări foarte corelaționale, circrn-urile exosomale sunt propuse ca indicatori de diagnostic pentru tumorile lor maligne corespunzătoare, pe baza modului în care respondenții sunt în schimbarea nivelurilor de expresie și a stabilității lor excelente, împreună cu mecanismul său înnăscut de livrare țintită . În prezent, peste 1000 de circRNAs au fost identificate în exosomi în tot corpul uman, fiind efectuate mai multe cercetări privind descoperirea combinațiilor suplimentare de exosom-circRNA-cancer.

CircRNA provocări și perspective

în ciuda creșterii cercetărilor au fost efectuate în paralel cu creșterea popularității circRNA, funcția biologică a majorității circrna rămâne încă un mister. De exemplu, se observă că majoritatea circrna patrulează în citoplasmă, dar provin din nucleul celulei, astfel încât se ridică problema modului în care se potrivesc prin micul por nuclear. Mai mult, rămâne de investigat faptul că mulți dintre exonii circularizați (85%) se suprapun cu secvențele de codificare a proteinelor, dar majoritatea circrna nu codifică proteinele. Pe o notă mai clinică, acestea necesită teste suplimentare pentru a putea înlocui complet procedurile tradiționale de diagnostic. Preocupările, cum ar fi extracția țesuturilor pacientului care provoacă traume și detectarea costisitoare a arnc în țesut, rămân să fie abordate, alături de obținerea unei înțelegeri complete complete cu privire la structurile lor secundare și rolurile diferite între ele. Eșecul administrării corespunzătoare a biomarkerilor adecvați ai arncr la pacienți poate umbri rezultatele clinice care trebuie depășite prin obținerea unei imagini mai bune a generării, localizării și degradării arnc propuse.

cu toate acestea, arnc sunt încă opțiuni atractive pentru dezvoltarea unei game de instrumente terapeutice biologice. Există deja rapoarte atât despre construcția ARN in vitro, cât și in vivo, utilizând secvențele intron-exon permutate de grup i (PIE) pentru direcționarea complementară a secvențelor de flancare spliceosomal-backsplice-site, iar acest mecanism poate fi extrapolat pentru a include orice secvență sau proteină de structură cunoscută, dacă dorim acest lucru. Ca o notă laterală, există mult loc de îmbunătățire în lărgirea diversității posibilităților de diagnostic ale circRNA. Într-un exemplu, analiza moleculară prezentă a sângelui este reținută la analizarea fragmentelor fără celule ale ADN-ului genomic; O mare perspectivă viitoare ar fi luarea în considerare a eșantionării veziculelor extra-celulare specifice bolii pentru a monitoriza debutul și progresia bolii cu mai multe detalii. Aceste idei pun bazele pentru sugestii suplimentare de reglare selectivă a proteinelor și semnalizare celulară programată. Așa cum s-a demonstrat de nenumărate ori în experimentele în curs, circrna-urile și-au afișat cu încredere potențialul de sponging și biomarking, ceea ce ar trebui să ne îndemne să deblocăm secretele circrna-urilor neînțelese de mult.