Biblioteca de cunoștințe Alpha CETSA

• CETSA CTF
• țintă/tipuri de probe
• CETSA CTF condiții de testare
• Alfa CETSA CTF Immunoassays
• CETSA CTF analiza și interpretarea datelor

Disclaimer: numai pentru uz de cercetare. CETSA este o marca inregistrata a Pelago Bioscience AB. Vă rugăm să rețineți că pentru utilizarea kit-ului este necesar un abonament CETSA XV valabil.

metoda CETSA în sine

Î : Ce este CETSA în sine?

A : Testul de deplasare termică celulară este o metodă care permite cuantificarea angajării țintă a unui compus (TE) în celulele vii sau în celulele perturbate. Principiul de testare CETSA XV se bazează pe modificarea profilului de denaturare termică a proteinei țintă care are loc în urma legării unui compus. Testul CETSA se realizează prin incubarea celulelor cu compusul testat, urmată de încălzirea celulelor tratate cu compuși și apoi prin măsurarea proteinei țintă solubile rămase.

Î: Ce este schimbarea termică

A: La încălzire, o proteină va întâlni o temperatură la care se denaturează (uneori denumită punctul de topire). Această temperatură de topire este o proprietate fizică și o constantă pentru orice set dat de condiții (pH, presiune, săruri). Compușii care interacționează cu o proteină vor schimba temperatura de topire (schimbare termică). Pentru un anumit situs de legare dintr-o proteină, mărimea deplasării termice poate fi măsurată la diferite concentrații de compus (doză-răspuns), iar valorile CE50 derivate din astfel de curbe pot fi utilizate pentru a stabili un ordin de rang al potenței unei serii de compuși, care se corelează direct cu ordinea de rang a afinității compușilor . Există mai multe variații ale testului de schimbare termică in vitro, dar tehnica cheie a fost descrisă pentru prima dată de Semisotnov și colab. (1991). În această metodă, proteina de topire și desfășurare expune suprafețe hidrofobe care permit sypro orange să se lege. Fluorescența acestui colorant este stinsă în apă, astfel încât legarea la aceste suprafețe hidrofobe inversează acest lucru și determină creșterea fluorescenței atunci când proteina este complet desfăcută. Acest tip de test de schimbare termică poate fi aplicat numai proteinelor foarte purificate, iar pentru speciile cu abundență redusă, acest lucru poate însemna că este necesar un sistem de supraexprimare pentru a genera cantități suficiente.

Termofluor-sistem de colorare sensibil la temperatură (folosind portocaliu Sypro)

fluorimetrie de scanare diferențială (DSF – – metode alternative pe bază de coloranți

sisteme PCR cantitative (de exemplu, Roche light cycler) : acestea sunt utilizate pentru a furniza evenimentul de încălzire și pot măsura modificările fluorescenței

Nanotemper – este o companie care produce un instrument dedicat care încălzește proba și măsoară fluorescența. Oferă performanțe mai bune decât sistemele PCR adaptate.

Î : De ce este importantă măsurarea implicării țintei?

A : în absența confirmării că un compus interacționează într-adevăr cu ținta dorită, dezvoltatorii de medicamente pot pierde timp prețios și resurse care se deplasează în direcția greșită. Din acest motiv, confirmarea implicării țintă a unui compus a fost mult timp considerată esențială în descoperirea medicamentelor. Astfel de teste permit comparații directe ale afinității unui compus pentru obiectivul său, ca atare este o măsură esențială pentru a selecta ce compuși să avanseze în toate etapele generării și optimizării plumbului. Deoarece implicarea țintă poate fi corelată cu afinitatea, aceasta permite cercetătorilor să selecteze compuși care au cele mai mari valori de afinitate. Ca atare, este o măsură extrem de utilă pentru a asigura prioritizarea corectă a compusului în fiecare etapă a procesului de descoperire a medicamentului.

Î: În ce mod diferă CETSA XV de alte tehnologii de testare a deplasării termice?

A: în afară de CETSA XV, există numeroase metode de evaluare a angajării țintei (de exemplu, rezonanța Plasmonului de suprafață, Polarizarea fluorescenței și deplasarea termică). Cu toate acestea, toate aceste metode se bazează pe disponibilitatea proteinelor purificate și pot fi aplicate numai in vitro, ceea ce înseamnă că valorile afinității derivate pot să nu fie predictive ale afinității reale sau ale potențialului de legare în celulele vii. Fiind capabil să ruleze teste de schimbare termică într-un context celular relevant, în care proteina se află în mediul său nativ, în prezența proteinelor sale partenere naturale, cu concentrații fiziologice ale cofactorilor și substraturilor sale, produce date mult mai relevante, care se vor traduce mai bine în modele animale și studii clinice.

în timp ce testul de deplasare termică celulară este o metodă bazată pe același principiu biofizic ca și testele standard de deplasare termică (adică proteinele specifice se vor denatura la o temperatură setată), nu măsoară direct temperatura specifică de desfășurare, ci se bazează în schimb pe faptul că prezența unui compus pe proteină va afecta cantitatea de proteină solubilă prezentă după încălzire la o temperatură setată. Ca atare, CETSA XV este, în esență, un test total de proteine efectuat după un eveniment specific de încălzire. Compușii cu potențe diferite de implicare țintă vor schimba cantitățile relative de proteine care supraviețuiesc evenimentului de încălzire. Deoarece testul măsoară această proteină reziduală, mai degrabă decât evenimentul real de topire, acesta poate fi aplicat la sisteme in vivo mai complexe, cum ar fi celulele și lizații (și în unele formate CETSA, chiar țesut solid). În plus, CETSA XV poate identifica compuși care destabilizează o proteină (adică reduc temperatura de topire), acest lucru este mai puțin drept înainte cu celelalte metode de schimbare termică.

Î: În ce fel diferă Alpha CETSA XV de alte tehnologii de testare a deplasării termice celulare sau de alte teste de implicare a țintei celulare?

A: după cum s-a menționat mai sus, CETSA XV este practic un test total de proteine efectuat după șocul termic. Alpha CETSA xixt utilizează un sistem dual de detectare a proximității anticorpilor. Alte metode evită utilizarea unui sistem bazat pe anticorpi prin modificarea proteinei țintă:

• testul de deplasare termică a Nanoluciferazei Promega (NaLTSA): Nanoluc Luciferaza fuzionată cu proteina țintă (proteină exprimată recombinant); Când ținta proteinei cu eticheta enzimei Nanoluc se agregă, semnalul luciferazei va scădea.
• Promega NanoBRET target Engagement test : etichetă de fuziune a Luciferazei combinată cu compuși marcatori etichetați care, atunci când se află în imediata apropiere a luciferazei, vor duce la transferul de energie prin rezonanță Bioluminescentă (BRET). Legarea compusului în același buzunar va deplasa trasorul și semnalul BRET va scădea. Aceasta nu este o metodă de șoc termic.
• DiscoverX Incell Pulse: bazat pe tehnologia de completare a fragmentelor enzimatice (EFC) : proteina țintă este fuzionată cu un mic fragment de enzimă donor de-galactozidază (- – GAL). O proteină reporter adăugată se va lega de acest fragment pentru a reconstitui o enzimă activă, care va hidroliza un substrat și va genera un semnal chemiluminescent care permite cuantificarea abundenței proteinelor. După denaturarea căldurii, proteina se va agrega și va limita accesul componentei luciferase mai mari la partenerul său pe ținta proteică.

diferența esențială dintre aceste sisteme “CETSA recombinantă” sau “angajament țintă recombinant” și Cetsa alfa”, este că acestea nu pot fi aplicate celulelor native și nemodificate. Aceasta are o serie de consecințe negative:

1. în timp ce costul dezvoltării unei perechi de anticorpi noi și costurile ulterioare pe godeu pot fi mai mari decât simpla transfecție a unei singure linii celulare, este probabil ca orice program de descoperire să dorească să fie testat cu o varietate de linii celulare model, fiecare transfecție vine cu propriile costuri și clonarea liniilor celulare ulterioare va dura săptămâni suplimentare.
2. generarea unei proteine etichetate va avea întotdeauna consecințe fiziologice asupra celulei, iar proteina etichetată poate fi (i) supraexprimată (stoichiometrie greșită vs. parteneri), (ii) nu sunt localizați în compartimentul celular corect sau (iii) nu sunt asociați cu proteinele cheie partenere și (iv) pot avea un comportament de topire diferit de proteina nativă. Ceea ce înseamnă că efectul aparent al unui compus poate să nu reflecte comportamentul său real în țesutul pacientului. Aceste probleme pot fi amplificate în orice sistem de transfecție temporară.
3. inhibitorii Luciferazei pot determina rezultate fals pozitive.
4. în etapele ulterioare ale optimizării plumbului, când sunt necesare modele celulare mai complexe și fiziologic mai relevante (linii celulare primare, native și țesuturi), abordările proteice etichetate pur și simplu nu sunt aplicabile.

Î

a: CETSA centi oferă o măsură unică a unui compus ‘asupra prezenței țintă’ și poate fi considerat ca fiind gradul de ocupare a țintei. Această Ocupare va fi afectată atât de capacitatea compușilor de a angaja ținta, cât și de capacitatea compusului de a fi prezent la locul potrivit (adică. are solubilitatea corectă, permeabilitatea, stabilitatea metabolică și disponibilitatea la compartimentul celular drept). Testele de implicare țintă non-celulare oferă măsuri de afinitate care se corelează numai cu comportamentul proteinei în medii foarte artificiale folosind adesea proteine țintă purificate exprimate recombinant.

Î: se poate utiliza CETSA XV pentru studii de analiză SAR?

A: nu există încă Exemple publicate în care CETSA a fost utilizată pentru optimizarea compușilor. Cu toate acestea, potențialul și aplicabilitatea CETSA XV pentru a fi utilizate pentru analiza SAR și confirmarea hit au fost demonstrate în mod clar de Shaw și colab. prin compararea datelor obținute din testul CETSA-centaux cu datele utilizate în mod obișnuit în analiza biochimică și pe bază de celule (Shaw și colab. 2018 SLA descoperire 1-12 DOI: 10.1177 / 2472555218813332). Publicatia demonstreaza Valoarea Adaugata a CETSA XV pentru screening, confirmarea hit-ului si generarea SAR pentru doua tinte proteice: B-Raf si PARP1.

tipuri țintă/eșantion

Î: câte ținte au fost validate până în prezent în CETSA inkt?

A: În CETSA HT (cea mai mare parte fiind Alpha CETSA XV , unele folosind HTRF) au fost validate cu succes peste 30 de ținte, inclusiv ținte cu localizare nucleară, mitocondrială, citoplasmatică și membrană plasmatică.

mai mult de 100 de obiective au fost validate până în prezent în CETSA xixt Classic (Western Blot based detection).

CETSA XQC m/S generează informații pentru 6000 până la 7000 de ținte simultan.

Î:toate proteinele țintă pot fi testate în CETSA xixt?

R: unele ținte sunt “oarbe” în CETSA , adică. legarea compusului nu le va schimba stabilitatea termică. Acest lucru se poate întâmpla atunci când proteina are mai multe domenii, iar compusul se leagă de un singur domeniu și dacă stabilizarea acestui singur domeniu nu afectează global stabilitatea termică a întregii proteine. Există câteva proteine care nu se topesc în intervalul tipic de temperatură aplicat în experimentele CETSA inkt.

Pelago are acces la o bază de date amplă cu date de stabilitate termică din proiecte cu citire spectrometrică de masă (CETSA XQX MS), iar aceste informații sunt luate în considerare atunci când Pelago evaluează “CETSA xqxbility” a unei ținte proteice înainte de a dezvolta un test alfa CETSA XQX. Vă rugăm să contactați Pelago pentru a solicita astfel de informații.

Î: GPCR-urile pot fi receptate la CETSA XV ?

A: câteva exemple de GPCR-uri au fost testate la CETSA inox . Într-o publicație recentă de la Astra Zeneca (Kawatkar și colab.Chem Biology 2019) s-au stabilit teste CETSA pentru un set de proteine legate de membrană, inclusiv o țintă de proteine GPCR. O posibilă provocare în cazul CETSA XV pe GPCR-uri poate fi disponibilitatea limitată a anticorpilor pentru detecție. În plus, localizarea integrală a membranei GPRCs poate duce la un comportament de topire imprevizibil.

Î:Ce tip de probe pot fi testate în CETSA inox?

A : Există exemple de teste CETSA, folosind mai multe tipuri diferite de matrice, inclusiv linii celulare imortalizate, celule primare, celule iPS, pbmc derivate din pacienți, sferoizi, fracțiuni nucleare din celule cultivate, țesut tratat ex-vivo, țesuturi din studii in vivo pe animale, bacterii, drojdie, pește zebră și insecte.

Î : probele pot fi înghețate după etapa de încălzire?

A : Acest lucru este posibil, însă acest lucru necesită o validare de la caz la caz, deoarece procesul de înghețare poate denatura unele proteine.

Î: celulele mele au nevoie de acoperirea plăcii de cultură cu unele proteine (de ex. colagen sau Matrigel); este necesară o atenție specială pentru a evita prepararea probei?

A: nu am întâmpinat probleme cu celulele cultivate pe plăci acoperite.

CETSA condiții de testare CTXC

Î: Care sunt punctele tipice de optimizare a testului Cetsa Ctxc?

A: dacă începeți de la zero, testul imunologic trebuie dezvoltat și optimizat mai întâi. Este important și util să se investească în dezvoltarea unui test alfa foarte sensibil, deoarece va permite reducerea numărului de celule pe godeu necesar în testul CETSA centi. Deoarece testul CETSA XV distruge o parte a proteinei care trebuie detectată, de obicei sunt necesare mai multe celule/puț într-un test CETSA XV comparativ cu alte teste pe bază de celule. Vă rugăm să consultați ghidurile PerkinElmer pentru dezvoltarea testului alpha pentru cum să procedați și pentru sugestii utile, precum și manualele CETSA pentru setul de instrumente pentru a utiliza abordarea toolbox (Anti mouse Ig X Anti rabbit IG beads).

apoi, punctele de optimizare a testului CETSA cents:

• titrarea densității celulare
• selectarea tamponului de liză celulară
• timpul de incubație al celulelor cu compusul testat
• temperatura pentru incubarea celulelor cu compusul testat
• stabilirea curbelor de topire și deplasare
• Selectarea temperaturii pentru experimentele izoterme doză-răspuns
• flux de lucru și setări de automatizare

î: de ce sunt furnizate diferite tampoane de liză celulară Cetsa CT5 și care este impactul utilizării diferitelor tampoane de liză celulară?

A: Tamponul de liză este important în ceea ce privește mai multe aspecte ale testului. Rolul său este multiplu: lizarea celulelor și eliberarea potențială a proteinei țintă de proteinele partenere care pot interfera cu recunoașterea anticorpilor, pentru a face ținta disponibilă pentru detectarea de către anticorpi; stabilizarea proteinei țintă pentru a face testul stabil; evitarea sau minimizarea efectului potențial de epiturbanță; oferind condițiile fizico-chimice potrivite (pH, rezistența Ionică și natura sărurilor, tipul și concentrația detergenților, … ) pentru testul imunologic, … deoarece diferite teste imunologice pot avea condiții optime diferite și, deoarece ținte diferite de proteine, iar diferite tipuri de celule pot avea cerințe diferite pentru performanța optimă a testului, punem la dispoziție 5 tampoane de liză celulară diferite. Acestea oferă o varietate de condiții de liză celulară. Cu toate acestea, acest lucru nu implică faptul că pot fi adăugate componente suplimentare în cazuri specifice, cum ar fi tipuri suplimentare de detergenți, pentru a îmbunătăți performanța suplimentară a testului.

Î: există inhibitori de protează în tampoanele de liză a celulelor CETSA?

a: tampoanele de liză celulară CETSA 1, 4 și 5 conțin câțiva chelatori de cationi bivalenți, care se așteaptă să inhibe proteazele care necesită astfel de cationi bivalenți pentru activitatea lor (Metaloproteinazele Matriciale, de exemplu). În afară de aceasta, nu sunt incluși alți inhibitori de protează în tampoanele de liză celulară CETSA XV, deoarece acestea nu sunt, în general, necesare pentru efectuarea testelor Alfa cetsa XV. Cu toate acestea, pentru anumite tipuri de celule sau probe de țesut, poate doriți să adăugați inhibitori tipici de proteinază, cum ar fi leupeptina.

Î: Care sunt temperaturile tipice de topire?

A: temperatura de topire (Tm) este definită ca temperatura la care jumătate din populația țintă de proteine a fost denaturată (adică în cetsa alfa la care jumătate din semnalul alfa a fost pierdut). În funcție de țintă, temperaturile de topire sunt cel mai adesea între 40 și 60 de centimetrii C, cu o temperatură medie de topire de 52 de centimetrii C. unele proteine, cum ar fi proteinele asociate membranei, sunt de obicei mai stabile și pot avea o temperatură de topire mai ridicată. Datele de testare CETSA centsct pentru proteinele cu o temperatură de topire mai mare de 65 centsc pot fi afectate de faptul că permeabilitatea membranei și integritatea celulară sunt perturbate atunci când celulele sunt încălzite, afectând astfel semnificația fiziologică a testului.

din experiența noastră, temperatura de topire este specifică țintei și depinde de matricea de testare și de tamponul de liză utilizat.

Î: se așteaptă ca Tm să fie aceeași atunci când se lucrează cu celule intacte și celule perturbate?

A: nu neapărat, ca atunci când perturbă celulele, interacțiunile proteine-proteine care stabilizează proteinele pot fi pierdute, ceea ce poate duce la o temperatură de topire modificată în comparație cu celulele intacte. Pentru un exemplu, vă rugăm să consultați datele testului Alpha CETSA XCT MEK1.

Î: Ce temperatură de încălzire ar trebui să selectez pentru testarea compusului?

A: Pentru stabilizarea compușilor se recomandă selectarea celei mai scăzute temperaturi cu cea mai mare fereastră de testare, deoarece este de așteptat să dea cea mai sensibilă analiză (valori mai mici CE50). Pentru compușii destabilizatori se recomandă selectarea celei mai înalte temperaturi cu cea mai mare fereastră de testare. Temperaturile de peste 65 de grade C pot avea un impact asupra permeabilității celulare și pot reduce semnificația datelor.

Î: ar trebui să mă aștept la aceeași temperatură de topire în CETSA classic (Western Blot) și Alpha cetsa XV?

A: nu neapărat: temperatura aparentă de topire poate varia între ambele metode, deoarece metodele de detectare sunt diferite.

Î: Este important să aveți un control strict al timpilor de încălzire a eșantionului?

A: da, acest lucru este extrem de important pentru control, deoarece timpii de încălzire mai lungi pot duce la o schimbare corectă a curbei doză-răspuns (a se vedea mai jos comentariile despre timpul de rezidență). Timpul standard de încălzire este de 3 minute.

compuși cu un timp de rezidență scurt (adică rată ridicată de disociere constantă koff; timpul de rezidență T fiind egal cu 1/koff) se va disocia mai repede de țintă atunci când este încălzit, în comparație cu compușii care au un timp de rezidență lung. Din acest motiv, valoarea EC50 sau ITDRF50 este de așteptat să crească odată cu creșterea timpilor de încălzire. Pentru mai multe explicații cu privire la teoria CETSA, a se vedea Seashore-Ludlow B, Axelsson H, Almqvist H, Dahlgren B, Jonsson M, Lundb, Lundck T. (2018) interpretarea cantitativă a legării și cineticii intracelulare a medicamentului folosind testul de deplasare termică celulară. Biochimie 57: 6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. În teorie, detectarea timpilor de rezidență a diferiților compuși la țintă, prin variația timpului de încălzire, ar putea fi posibilă, dar nu există încă rapoarte publicate despre acest lucru.

Î: manualul instruiește fie să se răcească pe gheață, fie timp de 3 minute la 25 centimetric C după șocul termic. Este important acest pas de răcire și este important să aveți un control strict al timpului de răcire?

A: răcirea rapidă a eșantionului asigură că faza de șoc termic este bine controlată. Simpla permitere a temperaturilor să se răcească fără ajutor ar produce cu siguranță rate de răcire diferite în diferite puțuri și ar afecta cantitatea de șoc termic livrată sistemului. Faza de răcire nu este la fel de critică ca faza de încălzire, dar trebuie efectuată rapid și consecvent.

Î: Pot să folosesc kituri PerkinElmer “Biomarker” și “SureFire” (non-CETSA inktiv ) pentru a efectua un test CETSA inktiv?

A: în teorie, orice test total de proteine poate fi adecvat pentru utilizarea într-un protocol CETSA, deși fiecare sistem trebuie optimizat și validat. Cu toate acestea, metoda CETSA XV este brevetată și va fi necesară permisiunea de la Pelago Bioscience. În plus, numai utilizarea kiturilor țintă desemnate este susținută de PerkinElmer. Utilizarea kitului tool box este susținută de Pelago Bioscience și este disponibilă numai deținătorilor de licențe.

Î: Este posibil să se citească semnalul Alfa direct de pe placa PCR utilizată pentru încălzirea probelor?

R: Acest lucru ar oferi avantaje în ceea ce privește numărul de etape de pipetare, consumul eșantionului și ușurința automatizării, dar posibilitatea utilizării plăcilor PCR pentru întregul proces – de la tratarea eșantionului până la detectare – nu este încă demonstrată. Plăcile PCR sunt adesea foarte flexibile, ducând la semnal neuniform peste placă sau nu au dimensiunile potrivite pentru a le permite să fie manipulate de cititoarele de plăci. Discuțiile încrucișate bine-la-bine pot fi, de asemenea, o problemă în astfel de plăci PCR.

Î : poate fi utilizată denaturarea chimică (de exemplu, folosind uree sau guanidină) în loc de căldură?

A: Avantajul utilizării temperaturii pentru a furniza șocul termic este că se face într-un mod foarte controlat, care este probabil să fie constant între probe și limitat într-un interval de timp bine controlat. Un proces de denaturare chimică ar putea funcționa într-un extract de proteine purificat; dar în mediul celular complex, variația volumului celular, capacitatea de tamponare, conținutul de lipide etc. sunt susceptibile să însemne că diferite linii de celule prezintă caracteristici diferite de denaturare pentru orice proteină dată.

deoarece denaturarea (timpul de încălzire) este critică, acest lucru poate fi destul de dificil de controlat dacă se utilizează denaturarea chimică. În plus, căldura poate fi aplicată fără a perturba celulele, permițând testarea în context celular real. Acesta nu ar fi cazul denaturării chimice, deoarece celulele ar trebui perturbate pentru a permite accesul țintă la agentul de denaturare, pierzând astfel concentrațiile intracelulare, asociațiile de proteine etc.. Prin urmare, nu recomandăm înlocuirea șocului termic prin denaturare chimică.

Alfa cetsa immunoassay

Q: Atunci când dezvolt un test CETSA XV, am nevoie de anticorpi monoclonali sau pot fi utilizați și anticorpi policlonali?

A: pot fi utilizați atât anticorpi monoclonali, cât și policlonali, în funcție de calitatea anticorpilor. Anticorpii monoclonali prezintă un avantaj în ceea ce privește alimentarea stabilă a reactivului, ca în cazul oricărei alte metode de detectare care utilizează anticorpi.

Î: când se utilizează anticorpi policlonali, următorul lot va funcționa în același mod într-un test CETSA centi?

A: Din experiența noastră, nu ne-am confruntat niciodată cu o situație în care următorul lot al unui anticorp policlonal s-a comportat diferit în testul CETSA cu numărul unu în comparație cu loturile anterioare. Cu toate acestea, testul CETSA cu un nivel ridicat de anticorpi policlonali trebuie validat din nou cu următorul lot de anticorpi policlonali.

Î: există alte recomandări pentru selectarea anticorpilor?

A: Dacă sunt disponibili, anticorpii trebuie selectați astfel încât să acopere diferiți epitopi ai proteinei țintă, pentru a maximiza șansele de a găsi o pereche adecvată de anticorpi care să funcționeze în testul alfa cetsa-ULC.

perechile de anticorpi care produc curbe mai abrupte (panta mai mare a colinei) și mai puțin fundal sunt preferate, deoarece oferă de obicei un semnal mai specific. Panta joasă a colinei poate fi semnul capacității unei perechi de anticorpi de a recunoaște proteina re-pliată.

Î: sunt anticorpii alfa cetsa olfactiv numai împotriva proteinei țintă endogene sau a proteinei țintă endogene plus molecula mică legată?

A: pe baza kiturilor dezvoltate până acum, anticorpii sunt doar împotriva țintei proteice.

Î: Mă pot aștepta ca afinitățile anticorpilor de detectare să fie diferite între molecula mică legată și nelegată pentru a viza proteina?

A: moleculele mici care influențează plierea proteinelor la locurile epitopilor sunt într-adevăr expuse riscului de a modifica legarea anticorpilor. Acest fenomen se numește ” epiturbance “și poate fi o limitare a anticorpilor pe bază de-CETSA inkt. Epiturbanța nu este, în general, observată în formatul de testare clasic CETSA (western Blotting), deoarece în acest caz proteina este complet denaturată înainte de etapa de detectare a anticorpilor.

Î: se poate utiliza numai IgG cu seturile de scule CETSA cents?

A: Într-adevăr, anticorpii de pe bilele anti-iepure și anti-șoarece sunt specifici IgG și nu ar recunoaște alte clase de anticorpi (adică IgA, IgM etc. nu ar trebui selectate).

Î: există un avantaj în utilizarea Alpha CETSA xixt față de CETSA xxxt Classic (Western Blotting)?

A: pe lângă o sensibilitate mai mare a testului alfa cetsa și considerente de transfer și automatizare, datorită posibilei dificultăți de analiză a proteinelor membranare în metoda clasică CETSA IX, Alpha CETSA xixx poate avea performanțe mai bune pentru astfel de ținte, deoarece nu necesită nicio etapă de separare.

CETSA CTF analiza și interpretarea datelor

Î: Ce rezultate fals pozitive pot fi obținute în CETSA CTF?

A: stabilitatea termică a unor proteine poate fi afectată în urma tratamentului compus, chiar dacă acestea nu sunt legate direct de compusul testat. Aceste efecte indirecte pot fi rezultatul, de exemplu, al fosforilării proteinelor, al recrutării proteinelor de către o proteină parteneră sau al schimbării generale a stării Redox a celulei. Efectuarea în paralel a testului CETSA XV pe celule intacte și pe celule perturbate poate discrimina efectele directe și indirecte, deoarece astfel de efecte indirecte nu sunt așteptate atunci când celulele sunt perturbate și procesele metabolice sunt oprite.

intereferența de analiză a compușilor poate fi întâlnită în alfa cetsa, deoarece compușii sunt prezenți în etapa de detecție la o concentrație relativ ridicată. Acest lucru poate da rezultate înșelătoare și este important să efectuați un contor ecran pentru a identifica acești compuși.

Î: Cum poate fi interpretată destabilizarea țintei?

A: Destabilizarea poate rezulta din întreruperea legării compuse a unui complex proteic care stabiliza proteina țintă. În experiența noastră, proteinele membranare au de obicei o temperatură de topire mai mare și sunt mai degrabă destabilizate decât stabilizate prin legarea compusului. Pentru kinaze, ar putea rezulta și din deplasarea ATP. În acest caz, poate fi utilă compararea rezultatului analizelor CETSA XV atunci când se efectuează pe celule intacte (concentrații fiziologice de ATP) și celule perturbate (pierderea ATP). Pentru unele ținte (a se vedea manualul ErbB2 Alpha CETSA inkt) am observat că inhibitorii ireversibili au destabilizat ținta în timp ce un inhibitor reversibil a stabilizat ținta.

Î: există o modalitate de a evita efectul epiturbance?

A: Adăugarea unei cantități mici de detergent, cum ar fi 0,01% SDS, poate preveni fenomenul epiturbance. O explicație ar putea fi că SDS oferă acces la anticorp chiar și în prezența compusului. O parte din tamponul de liză celulară CETSA XV conține o cantitate mică de SDS și, prin urmare, poate evita epiturbanța față de alte tampoane de liză. Nu putem exclude că, în unele cazuri, ar putea fi necesar să se adauge mai multe FDS.

trebuie remarcat faptul că un astfel de efect de epiturbanță nu se limitează la testele CETSA XV, ci poate fi întâlnit și în orice test imunologic.

Î: contra-ecran / cum să verificați dacă hit-ul meu CETSA OZT este fals pozitiv?

A: în CETSA XV, există o metodă simplă care permite să se determine dacă compusul acționează asupra stabilizării proteinei țintă (de)în sine sau interferează cu metoda de detectare: se poate face o comparație între (1) adăugarea compușilor la celule, apoi incubarea și efectuarea tratamentului termic și (2) încălzirea celulelor mai întâi și adăugarea compusului numai după. Dacă activitatea compusului se găsește numai în testul 1, atunci este cu adevărat activă la țintă. Dacă activitatea compusului se găsește în 1 și 2, atunci arată că interferează cumva cu tehnologia de detectare (consultați Ghidul de interacțiune proteină-proteină PerkinElmer pentru o listă a interferențelor alfa potențiale).

Î: Ce rezultate fals negative pot fi obținute în CETSA inox?

A: Dacă un compus nu atinge ținta într-un context celular, acesta poate apărea ca pozitiv în testele biochimice și poate fi în continuare negativ în CETSA XV . Acesta nu este un fals negativ, ci doar reflectă faptul că compusul nu este capabil să acceseze ținta în condiții celulare reale, ceea ce face parte din puterea metodei.

Î : Cum se compară valorile CETSA cu testele funcționale / există o semnificație a amplitudinii termoshift?

A: Atunci când se analizează datele CETSA, trebuie să se țină cont de faptul că principiul testului este destul de diferit de testele funcționale tipice, cum ar fi examinarea fosforilării proteinelor, a concentrațiilor de ioni, a cAMP și a altor markeri de transducție a semnalului sau a analizei fenotipice în screeningul cu conținut ridicat și, prin urmare, datele trebuie interpretate în consecință.

amplitudinea schimbării termice nu este o măsură a afinității compusului.

valorile EC50 sau ITDRF50 sunt specifice anumitor condiții de testare (temperatură, timp de încălzire,…). Acest lucru nu este diferit de testele funcționale, unde valorile EC50 sunt, de exemplu, specifice timpilor de stimulare.

Î : Este posibil să se discrimineze antagoniștii față de agoniști în testele CETSA-inkt?

A: în mod normal, aceasta nu este o informație care este extrasă din testele CETSA, ci publicația de la Shaw și colab. (2018) Rapoarte științifice / (2018) 8: 163 / DOI: 10.1038 / s41598-017-18650-x. rapoartele arată că numai agoniștii au fost capabili să stabilizeze receptorul androgen în testul CETSA ctxt, în timp ce antagonistul nu a avut efect direct în testul CETSA ctxt, dar a putut fi detectat ca concurenți ai efectului agoniștilor în testul CETSA ctxt. Prin urmare, în acest caz particular, testul CETSA-inqc a fost capabil să discrimineze între agoniștii receptorilor androgeni și antagoniști. Acest lucru nu implică faptul că acest lucru este posibil pentru orice țintă, deoarece există numeroase exemple în care testul CETSA XV detectează direct atât agoniști, cât și antagoniști.

Î: Se poate utiliza CETSA XV pentru a detecta toxicitatea unui compus?

a: se așteaptă ca compușii care exercită un anumit efect toxic asupra unei celule să conducă la modificarea nivelului unor proteine (prin degradare și/sau efecte transcripționale) și la modificări ale termostabilității unor proteine (prin modificări post-translaționale sau modificări generale ale stării Redox a celulelor). Pelago explorează posibilitatea de a genera “amprente digitale CETSA inkt” care ar putea fi legate de diferite tipuri de toxicitate, din datele CETSA int ms. Acest lucru ar putea genera, de asemenea, cunoașterea țintelor pe care medicamentele nu ar trebui să le atingă pentru a evita o astfel de toxicitate. În cazul în care o țintă specifică pare să fie legată de toxicitate, atunci utilizarea de Alpha CETSA XV poate deveni o metodă de alegere pentru industria farmaceutică.

Î: poate fi utilizată o proteină de menaj pentru normalizarea testelor CETSA cents?

A: normalizarea nu este, de obicei, necesară în testele CETSA, deoarece rezultatul important al testului este valoarea EC50. Cu toate acestea, în unele cazuri, de exemplu atunci când se lucrează cu probe de țesut, cantitatea de material angajată pe punctul de date poate varia destul de semnificativ și poate fi dorită normalizarea. În CETSA (Western blotting), SOD1 este utilizat în mod obișnuit, deoarece punctul său de topire de 80 centi C îl face o referință invariabilă bună pentru orice țintă, iar greutatea sa moleculară de 18 kDa îl face ușor de detectat pe Western blots. GAPDH nu ar fi recomandat din cauza temperaturii sale de topire mai scăzute (55 C), ceea ce face ca acesta să nu fie un control posibil pentru țintele cu o temperatură de topire mai ridicată.

dacă doriți să normalizați testul alfa cetsa, s-ar putea încerca cofilin (există un kit AlphaLISA SureFire ultra pentru cofilin total, cu date preliminare CETSA, dar nu există încă un kit complet validat)