Ce este colony PCR?

Colony PCR este o metodă PCR rapidă, cu randament ridicat, pentru a determina prezența sau absența ADN-ului inserat în plasmidă direct din coloniile bacteriene.

clonarea moleculară este una dintre cele mai populare metode de transformare a ADN-ului de mult timp. Cu toate acestea, pentru a determina prezența sau absența inserției ADN trebuie să efectuăm experimente de transformare.

Colony PCR este o metodă nouă în care prin proiectarea primerilor specifici ADN-ului inserat, putem identifica dacă ADN-ul nostru de interes este inserat în plasmidă sau nu.

cu toate acestea, nu este atât de simplu pe cât discutăm.

în acest articol, ne vom concentra pe PCR colonie în special, principiul PCR colonie, avantajele și limitările sale.

pentru aceasta, trebuie să înțelegem mai mulți termeni și subiecte. Vom începe subiectul nostru de la elementele de bază. Conținutul articolului este,

“o plasmidă este ADN-ul circular bacterian care se reproduce independent de cromozomul bacterian și utilizat în manipularea genelor și transferul de gene.”

clonarea genetică este un instrument genetic molecular tradițional folosit de mult timp în laboratoare. Pe scurt, în clonarea genei, gena interesului nostru este inserată în plasmidă prin mijloace artificiale. Acest ADN este reprodus independent de cromozomul bacterian.

plasmidele sunt de fapt folosite pentru a genera multe copii ale unor segmente scurte de ADN. Deoarece bacteriile se reproduc mai repede decât orice alte organisme, putem genera multe copii ale genei de interes prin introducerea acesteia în plasmida bacteriană.

plasmida F, Col-plasmida, plasmida degradativă și plasmida de rezistență sunt mai multe tipuri comune de plasmide găsite în bacterii.

mai mult, plasmida poate funcționa ca un purtător molecular care transferă segmente scurte de ADN de la o celulă la alta.

am acoperit un articol uimitor în profunzime despre ADN-ul plasmidic. Citiți-l aici: ADN plasmidic-structură, funcție, izolare și aplicații.

în afară de bacterii, mai multe alte procariote conțin, de asemenea, ADN plasmidic. Funcția principală a plasmidei în bacterii este pentru supraviețuirea lor în condiții dure.

pe măsură ce plasmida transferă gena interesului nostru, este foarte important să determinăm dacă gena noastră de interes este inserată sau nu în plasmidă.

pentru aceasta, putem folosi mai multe metode, cum ar fi PCR și cultivarea microbiană.

așezarea coloniilor necesită mai mult timp, iar sensibilitatea metodei nu este, de asemenea, bună. Șansa contaminării este întotdeauna ridicată în metodele de cultură bacteriană.

deci rezultatele nu sunt corecte.

PCR-ul nostru ajută și aici. Folosind metoda PCR a coloniei, se poate determina sau identifica o inserție ADN.

1. cum se înființează un laborator de extracție a ADN-ului: un ghid cuprinzător (substanțe chimice, instrumente și alte utilități).
2. deleția cromozomului 6p: un motiv pentru nici o durere, nici foame și nici somn

ce este PCR colonie?

Colony PCR este modificarea PCR convențională în care coloniile bacteriene sunt utilizate direct ca șablon PCR.

ADN-ul plasmidic care conține ADN-ul interesului nostru este amplificat în condițiile dependente de temperatură ciclică.

reprezentarea grafică a coloniei PCR este prezentată în figura de mai jos,

principiul coloniei PCR:

Colonia bacteriană care conține plasmida poate fi amplificată direct folosind două seturi de primeri. Primerii specifici inserției care amplifică secvența de inserție și primerii de flancare specifici vectorului, care amplifică ADN-ul plasmidic, altul decât ADN-ul inserat (regiuni flancante pe ambele părți ale inserției).

prin utilizarea primerilor de flancare a inserției (care amplifică restul ADN-ului) se poate determina dimensiunea inserției noastre de ADN.

o colonie bacteriană este culeasă și adăugată direct în mastermix care conține toți reactivii PCR. În plus, prin adăugarea unei etape inițiale de încălzire la PCR, ADN-ul plasmidic iese din celula bacteriilor și se amplifică în reacție.

acesta este principiul de bază al coloniei PCR, cu toate acestea, poate fi modificat în funcție de cerințe.

protocolul PCR colony:

PCR colony este una dintre modificările excelente ale PCR convenționale. În loc de ADN șablon, coloniile bacteriene sunt adăugate direct la reacție. În afară de aceasta, ADN polimeraza Taq, primerii, tamponul de reacție PCR și DD/W se adaugă și în reacția PCR.

aici, în PCR-ul coloniei, selecția primerilor este foarte importantă. De asemenea, selecția primerilor depinde de obiectivul experimentului nostru.

ce tip de informații dorim de la experimentul PCR al coloniei noastre?

1. 1. 1. informații despre prezența sau absența inserției numai.
      2. informații despre dimensiunea inserției.
      3. informații despre orientarea inserției.

în funcție de faptul că diferite primeri PCR sunt proiectate pentru PCR colonie.

primerii specifici de inserție se leagă de locația specifică de pe ambele părți ale ADN-ului inserat de interesul nostru. Dacă este transferat corect în plasmidă, acești primeri se pot lega de el altfel nu poate fi capabil să se lege.

acest set de grunduri oferă informații privind prezența sau absența inserției.

primerii specifici orientării sunt primeri unici în care un primer se leagă în interiorul inserției și un alt primer se leagă de secvența ADN plasmidă (secvență diferită de ADN-ul inserției).

acest tip de set de grunduri oferă informații despre orientarea ADN-ului inserat de interesul nostru. Dacă ADN-ul nostru de inserție nu este legat corespunzător în vector, primerul specific acelei părți a secvenței nu se poate lega și nu vom obține amplificarea.

primerii specifici plasmidelor sunt, de asemenea, la fel de importanți ca primerii specifici orientării. Acest set de grunduri sunt proiectate din regiunea flancantă a inserției care se leagă de exteriorul ADN-ului de interesul nostru.

acest set de grund ajută la determinarea dimensiunii inserției. Extinde alte regiuni decât ADN-ul inserat.

reacția PCR pentru efectuarea PCR-ului coloniei este după cum urmează,

componentă	concentrație	cantitate
Master mix (Special pentru colonia PCR)	1X	12 unqutl
tampon de reacție PCR cu 2mm MgCl2*	1X	5 unqutl
primer Forward	10pM	1 unqutl
primer invers	10pM	1 unqutl
Supernatant		3 unqutl
apă		3 oktill
Total	———	25 unqql

procedura de PCR colonie:

Ei bine, PCR colonie nu are nevoie de ADN extras.

nu extragem ADN aici. În schimb, sunt utilizate mai multe alte metode pentru creșterea sensibilității reacției.

Ok, De ce nu extragem ADN pentru ADN-ul plasmidic?

deoarece motivul este simplu, membrana celulară a celulei bacteriene este foarte netedă.

am discutat deja despre membrana celulară a celulei bacteriene. Citiți aici: diferite tipuri de metode de extracție a ADN-ului

o bacterie conține membrană celulară moale care poate fi ușor lizată prin încălzire sau centrifugare la viteză mare.

de asemenea, nu avem nevoie de ADN-ul bacterian propriu. Plasmida circulară circulantă este prezentă în citoplasma bacteriilor, prin urmare nu sunt necesare și etape suplimentare de purificare. Prin ruperea membranei celulare, ADN-ul nostru șablon este gata pentru amplificare.

ok, să trecem rapid prin metoda de obținere a ADN-ului plasmidic bun.

cu ajutorul selectorului steril, alegeți mai multe colonii bacteriene și transferați-l în tubul Eppendorf.

Acum adăugați tampon TE în el și amestecați-l bine. Puteți utiliza și D/W.

se încălzește proba în baia de apă clocotită timp de 20 de minute.

ușor vertex-l.

centrifugați proba la viteză mare timp de 2 minute.

transferați supernatantul într-un alt tub și utilizați-l ca ADN șablon.

în reacție se adaugă o probă de 20 de unkticli.

informații suplimentare:

de ce supernatant și nu peleți?

ADN-ul este o biomoleculă a vieții. ADN-ul plasmidic este chiar mai mic decât ADN-ul nuclear bacterian. Conține doar câteva gene de până la 1000bp până la 20.000 bp.

prin urmare, doar prin centrifugare, ADN-ul plasmidic mai ușor iese din celulă și se stabilește în supernatant, în timp ce peleta conține proteine și ADN nuclear, deci nu o folosim.

trecem acum la subiect.

plasmida noastră este pregătită pentru amplificare.

într-o altă metodă,

utilizați Colonia bacteriană direct.

această metodă este o combinație de PCR Hotstart și PCR colony.

coloniile bacteriene sunt culese și adăugate în tubul de reacție PCR.

tuburile sunt introduse în mașina PCR. Se adaugă o etapă suplimentară de încălzire.

încălzindu-l între 5 și 7 minute, ADN-ul plasmidic iese din celulă.

acum primerii specifici inserției amplifică ADN-ul pe care l-am introdus. Iar primerii flancanți amplifică restul ADN-ului.

amplificarea se face pentru 20 până la 25 de cicluri. Condițiile de ciclism pentru colonia PCR sunt enumerate mai jos,

pași PCR	denaturare inițială	denaturare	recoacere	extensie	extensie finală
temperatura	95 C	95 C	55-65 C	72 C	72 C
timp	3min	10 sec	45 sec	50 sec	5 min
	——-	——-	25 cicluri	—–	——-

citiți articolul interesant despre PCR convențional: un ghid complet al reacției în lanț a polimerazei

Sfaturi pentru îmbunătățire:

utilizați doar câteva colonii, deoarece multe colonii cresc șansa legăturilor nespecifice.

utilizați control pozitiv și contol negativ.

ca un control pozitiv a folosit grundul de flancare chiar dacă inserția nu este prezentă, reacția PCR dă banda ADN a ADN-ului plasmidic ceea ce indică faptul că reacția pe care am pregătit-o este corectă.

ca martor negativ, utilizați plasmida netransformată (plasmidă fără ADN inserat), acest ADN plasmidic este amplificat numai dacă inserția este prezentă.

pe măsură ce o inserție utilizează secvențe ADN scurte, secvențele ADN mai lungi cresc șansele de legături nespecifice și eșecul reacției PCR.

în plus, utilizați programe PCR mai scurte.

principala aplicație a coloniei PCR este în identificarea ligării corecte și inserției ADN-ului inserat în bacterii, precum și plasmida de drojdie.

după finalizarea reacției PCR a coloniei, produsele PCR sunt rulate pe gelul de agaroză 2%. Rezultatele experimentului sunt prezentate în figura de mai jos,

acum observați cu atenție rezultatele, M este markerul ADN molecular 3000bp. Să presupunem că ADN-ul interesului nostru, “insert” este un fragment de 400bp care este introdus în plasmidă.

vezi banda 2: fragmentul de 400 bp al inserției noastre.

am proiectat grunduri de flancare 100bp departe de ambele părți ale inserției. Dacă grundul de flancare amplifică ADN-ul împreună cu inserția, produsul este de 600 bp, consultați banda 3 (400 bp de inserție ADN + 200 BP regiune de flancare).

acum, vezi banda 1, este un control pozitiv fără inserție sau o plasmidă normală fără ADN transformat. Prin urmare, primerii flancanți amplifică doar 200 bp de ADN.

a se vedea banda 1, 200bp fragment de ADN fără inserție (control pozitiv).

acum, observați banda 4. Banda 4 este rezultatul primerilor specifici orientării. Grundul specific orientării este o combinație de grund specific inserției și grund specific regiunii flancante.

un primer din ADN inserat și un primer din primerul specific regiunii de flancare sunt selectate pentru amplificarea primerului specific orientării.

prin urmare, fragmentul de 100 bp din primerul regiunii de flancare și 400 BP din ADN-ul inserat este amplificat și fragmentul de ADN de 500 BP este observat în banda 4.

banda 5 este controlul specific al inserției care dă un fragment de ADN de 400 bp.

banda 6 este controlul negativ fără șablon. Prin utilizarea controlului negativ se poate identifica orice contaminare. Tubul de reacție conține toate ingredientele, cu excepția șablonului. Deci, în mod ideal, nu există benzi ADN pe această bandă.

dacă se observă o bandă ADN, proba este contaminată.

avantajele coloniei PCR:

• tehnica este rapidă și rentabilă.
• mai mult, precizia și specificitatea tehnicii sunt mai mari.
• configurarea este simplă la fel ca PCR convențional, extracția ADN-ului și purificarea plasmidelor ca pași laborioși nu sunt necesare.
• nu este nevoie de digestie restrictivă pentru identificarea ADN-ului inserat.
• întregul experiment poate fi finalizat în 90 de minute.

dezavantaje ale coloniei PCR:

• metoda este rentabilă, rapidă și fiabilă, cu toate acestea, orice mutație din inserție nu poate fi detectată.
• mai mult decât atât, informațiile de secvență nu pot fi obținute prin PCR colonie. trebuie să facem secvențierea pentru confirmarea transformării ADN-ului.
• șansele de rezultate fals pozitive sunt mari.

Citește mai mult;

1. ce este un PCR multiplex?

după finalizarea experimentului, eșantionul este trimis pentru secvențiere unde poate fi determinată secvența ADN de interesul nostru.

putem face chiar și multiplex PCR prin combinarea atât a primerilor specifici de inserție, cât și a primerilor specifici plasmidei.

concluzie:

deși PCR-ul coloniei este cea mai bună alegere pentru identificarea transferului de gene, singura tehnică PCR a coloniei nu este suficientă pentru a interpreta rezultatele. S-ar putea posibil ca unele dintre mutațiile prezente în inserție, care nu pot fi detectate prin PCR.

pentru confirmarea rezultatelor este necesară secvențierea ADN-ului. După determinarea ordinii secvenței putem spune dacă gena noastră de interes este inserată corect sau nu.