Cistron

Biogeneza PTX

cele cinci subunități PTX sunt codificate de cistroni contigui într-un singur operon policistronic , a cărui expresie este reglementată de sistemul BvgA/S. Prin intermediul acestui sistem bicomponent, producția de toxine poate fi modulată prin prezența MgSO4 sau a acidului nicotinic sau în timpul creșterii la temperaturi scăzute (pentru revizuire, vezi ). BvgS este o proteină care acoperă membrana interioară care exprimă activități multiple de kinază. În stare activă, activează BvgA prin fosforilare. Bvga fosforilat, un regulator transcripțional citoplasmatic, se leagă apoi de siturile operatorului din regiunea promotorului genei PTX, unde interacționează cu ARN polimeraza și activează transcripția. Deși au fost identificați modulatori care interferează cu semnalizarea BvgS, nu este cunoscut niciun ligand BvgS necesar pentru a declanșa semnalizarea, sugerând că BvgS este activat în mod implicit .

după transcriere, subunitățile individuale sunt produse ca preproteine care conțin peptide semnal clivabile. La translocarea prin membrana interioară (cel mai probabil printr-o cale dependentă de Sec), peptidele semnal sunt îndepărtate. Deși peptidele semnal prezintă caracteristici tipice ale substraturilor pentru peptidaza leader I, scindarea lor de către peptidaza leader Escherichia coli I este foarte ineficientă. Coexpresia genei B. pertussis lep în E. coli crește substanțial maturarea subunităților PTX . În spațiul periplasmic, se formează legături disulfidice intra-subunitate, iar holotoxina este apoi asamblată înainte de secreție prin membrana exterioară. PTX conține un total de 11 legături disulfidice intra-subunitate, una în S1, două în fiecare S4 și S5 și trei în fiecare S2 și S3 . Toate cisteinele prezente în PTX sunt implicate în legături disulfidice intra-lanț . Formarea disulfurii este importantă pentru biogeneza toxinei, deoarece modificarea fie a cisteinei în S1 împiedică asamblarea acestei subunități cu oligomerul B. Formarea corectă a disulfurii se bazează pe sistemul DsbA / DsbC, care s-a dovedit a fi esențial pentru asamblarea și secreția PTX . Cu toate acestea, mutațiile din dsbC, care codifică una dintre cele trei izomeraze disulfidice, nu au aparent niciun efect asupra asamblării toxinei, deși afectează secreția acesteia, sugerând că DsbC acționează asupra unei componente care este necesară în mod specific pentru secreția PTX.

secreția nu este necesară pentru activitățile biologice ale PTX, dar asamblarea completă a holotoxinei este importantă pentru secreția eficientă, deoarece tulpinile proiectate pentru a produce numai S1 sau numai oligomerul B prezintă un defect de secreție . Cu toate acestea , un oligomer B complet funcțional poate fi secretat într-o anumită măsură în absența S1, indicând faptul că prezența S1 nu este o cerință absolută pentru secreția de oligomer B. În schimb, S1 singur nu poate fi secretat în absența oligomerului B, sugerând că determinanții secreției sunt localizați în oligomerul B, deși prezența S1 poate spori cu siguranță eficiența secreției. Anumite mutații ale genei S1 au un puternic efect dăunător asupra secreției, în special în zona din jurul Arg-57 , sugerând că această regiune a S1 joacă un rol în secreția PTX. În absența oligomerului B, S1 se partiționează cel mai probabil la membrana exterioară, probabil prin domeniul său C-terminal, hidrofob. Acesta poate fi locul de asamblare cu oligomerul B înainte de secreție prin membrana exterioară .

etapele moleculare din ansamblul holotoxinei sunt încă puțin înțelese. Subunitățile unice din tulpinile mutante care nu produc celelalte subunități sunt degradate rapid. Anumite combinații de subunități par să se stabilizeze reciproc . De exemplu, stabilitatea subunității S2 este mult îmbunătățită de prezența S4 și invers, care este în concordanță cu formarea dimerului S2–S4 dezvăluită de structura cristalină a holotoxinei. De asemenea, este posibil ca subansamblurile dimerului S2–S4 cu subunitatea S1 să se formeze în absența S3 și S5. Dimerul S2–S4 nu a fost găsit secretat în B. pertussis, în timp ce adăugarea de S1 la acest dimer poate duce la un anumit nivel de secreție.

transportul PTX prin membrana exterioară a B. pertussis se bazează pe un sistem de secreție de tip IV (T4SS) compus din nouă proteine diferite, numite PtlA prin PtlI . Aceste proteine sunt omoloage cu cele ale T4ss de la alte bacterii, inclusiv Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila și rickettsia prowasekii . Genele ptl se află direct în aval de cele cinci gene PTX structurale și sunt sub controlul promotorului ptx . Cu toate acestea, proteinele Ptl par a fi produse la niveluri mai scăzute decât subunitățile PTX, după cum reiese din fuziunile translaționale ale genei phoA cu diferite gene ptx și ptl . Producerea anumitor proteine Ptl pare a fi un pas limitativ în secreția de PTX. În timpul creșterii exponențiale, s-a estimat că bacteriile secretă trei molecule de toxină/min/ celulă bacteriană și s-a constatat că subunitățile se acumulează în spațiul periplasmic , atât ca subunități individuale, cât și asamblate în holotoxine. Acumularea subunităților are loc pe parcursul creșterii exponențiale, chiar dacă nivelurile anumitor proteine Ptl cresc între 30 și 1.000 de molecule pe celulă. Astfel, secreția, mai degrabă decât producerea sau asamblarea toxinelor, poate limita rata. Curios, în absența proteinelor Ptl, pot fi secretate unele combinații de subunități, cum ar fi dimerul S2–S4 în prezența S1 , deși secreția holotoxinei depinde puternic de prezența proteinelor Ptl.

se crede că proteinele Ptl formează un complex care acoperă atât membranele interioare , cât și cele exterioare și toate acestea (cel puțin PtlA-H) par a fi necesare pentru secreția de toxine, așa cum sunt investigate de mutații în fiecare genă ptl individuală . Unele dintre mutațiile introduse în trans în tulpinile ptl + de tip sălbatic au dus la un fenotip dominant de secreție negativă, confirmând că cel puțin PtlC la PtlH fac parte dintr-un complex multimeric. Un pas cheie în secreția PTX este, evident, capacitatea sa de a traversa stratul peptidoglican, iar PtlE s-a dovedit că exprimă activitatea peptidogicanazei . Această proteină lungă de 276 de reziduuri conține asemănări ale situsului activ cu alte glicohidrolaze, iar substituțiile de alanină la acest situs s-au dovedit a diminua foarte mult activitatea peptidoglicanazei PtlE recombinant. Aceleași substituții în PtlE natural elimină, de asemenea, secreția PTX de B. pertussis, sugerând cu tărie că PtlE este peptidoglicanaza necesară pentru ca toxina să traverseze stratul peptidoglican.

secreția PTX necesită, de asemenea, cel mai probabil energie. Două dintre proteinele Ptl, PtlC și PtlH, conțin situsuri putative de legare a adenozin trifosfatului (ATP) și ar putea furniza astfel energia necesară pentru secreția de toxine. Ambele proteine s-au dovedit a fi necesare pentru secreție și , în ambele cazuri, situsurile putative de legare a ATP sunt esențiale pentru funcție. Pentru ambele, se observă un fenotip negativ dominant atunci când alelele mutante sunt coexprimate cu alela de tip sălbatic, sugerând că ambele funcționează ca multimeri sau fac parte din complexul de secreție. S-a demonstrat că PtlH este asociat cu membrana interioară, iar mutațiile din situsul de legare ATP al PtlH afectează locația sa celulară și elimină interacțiunile sale cu alte proteine Ptl . Rolul precis al PtlC nu este încă cunoscut. PtlD este, de asemenea, o proteină cu membrană interioară și conține cinci domenii transmembranare. Este necesar pentru stabilitatea PtlE, PtlF și PtlH prin reziduurile sale C-terminale 72. Cu toate acestea, această regiune C-terminală nu este suficientă pentru secreția de toxine . PtlF prezintă caracteristici ale proteinelor membranei exterioare (OMP), dar poate fi asociat și cu membrana interioară. În condiții care nu reduc, PtlF și PtlI migrează ca un complex în timpul electroforezei în gel dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă, indicând faptul că PtlI se leagă de PtlF prin formarea legăturii disulfidice . Formarea corectă a legăturii disulfidice între PtlI și PtlF ar putea depinde de DsbC, deoarece mutațiile genei dsbC afectează secreția fără a afecta asamblarea toxinei .