Citotoxicitate dependentă de Complement

anticorpi terapeutici

dezvoltarea anticorpilor terapeutici antitumorali implică analiza in vitro a funcțiilor lor efectoare, inclusiv capacitatea de a declanșa CDC pentru a ucide celulele țintă. Abordarea clasică este de a incuba anticorpi cu celule țintă și sursă de complement (ser). Apoi moartea celulară este determinată prin mai multe abordări:

• metoda radioactivă: celulele țintă sunt etichetate cu 51cr înainte de testul CDC, cromul este eliberat în timpul lizei celulare și se măsoară cantitatea de radioactivitate.
• măsurarea activității metabolice a celulelor vii (colorarea celulelor vii): după incubarea celulelor țintă cu anticorpi și complement, se adaugă colorant permeabil la membrana plasmatică (de exemplu calcein-AM sau resazurin). Celulele vii îl metabolizează în produs fluorescent impermeabil care poate fi detectat prin citometrie în flux. Acest produs nu poate fi format în celulele moarte inactive metabolic.
• măsurarea activității enzimelor intracelulare eliberate: enzima de eliberare a celulelor moarte (de ex. LDH sau GAPDH) și adăugarea substratului său duce la schimbarea culorii, care este de obicei cuantificată ca schimbare de absorbanță sau luminiscență.
• colorarea celulelor moarte: un colorant (fluorescent) intră în celulele moarte prin membrana plasmatică deteriorată. De exemplu, iodura de propidiu se leagă de ADN-ul celulelor moarte și semnalul fluorescent este măsurat prin citometrie în flux.

HLA typing și crossmatch testEdit

testele CDC sunt utilizate pentru a găsi un donator adecvat pentru transplantul de organe sau măduvă osoasă, și anume donator cu fenotip de potrivire a sistemului de histocompatibilitate HLA. La început, tastarea HLA se face pentru pacient și donator pentru a determina fenotipurile lor HLA. Când se găsește un cuplu potențial adecvat, se face testul crossmatch pentru a exclude faptul că pacientul produce anticorpi anti-HLA specifici donatorului, care ar putea provoca respingerea grefei.

forma CDC de dactilografiere HLA (cu alte cuvinte dactilografiere serologică) utilizează un lot de anticorpi anti-HLA din antiseruri alogene caracterizate sau anticorpi monoclonali. Acești anticorpi sunt incubați unul câte unul cu limfocitele pacientului sau donatorului și sursa de complement. Cantitatea de celule moarte (și, prin urmare, rezultat pozitiv) se măsoară prin colorarea celulelor moarte sau vii. În zilele noastre, tastarea CDC este înlocuită cu tastarea moleculară, care poate identifica secvențele nucleotidice ale moleculelor HLA prin PCR.

testul CDC este de obicei utilizat pentru efectuarea testului crossmatch. Versiunea de bază implică incubarea serului pacientului cu limfocitele donatorului și a doua incubare după adăugarea complementului de iepure. Prezența celulelor moarte (test pozitiv) înseamnă că donatorul nu este potrivit pentru acest pacient. Există modificări disponibile pentru a crește sensibilitatea testului, inclusiv extinderea timpului minim de incubație, adăugarea globulinei antihumane (AHG), îndepărtarea anticorpilor nelegați înainte de adăugarea complementului, separarea celulelor T și a subsetului celulelor B. În afară de CDC crossmatch există crossmatch flux-citometric disponibil, care este mai sensibil și poate detecta chiar complement non-activare anticorpi.