cloramfenicol acetiltransferaza ca marker de selecție pentru transformarea chlamydială

PGFP::SW2, vectorul navetă construit de Wang și colab., conținea o genă de lactamază-lactamază ca marker de selecție. De asemenea, poartă o genă de pisică care este fuzionată cu gena GFP . Am constatat că E. coli transformat cu plasmida PGFP:: SW2 a fost capabil să crească în mediu care conține cloramfenicol (concentrație finală: 170 / ml), sugerând că gena CAT poate fi utilizată și ca marker de selecție pentru experimentele de transformare chlamydială. După cum a avertizat Wang și colab., un efect advers al cloramfenicolului asupra mitocondriilor gazdă, așa cum a demonstrat Li și colab. poate afecta utilitatea acestui antibiotic pentru transformarea chlamydială . În Li și colab.conform raportului, concentrația toxică minimă de cloramfenicol a fost de 10 hectogg / ml, ceea ce a determinat o ușoară reducere cu 20% a producției de ATP. Am stabilit că cea mai mică concentrație aparentă de cloramfenicol care a inhibat complet formarea incluziunii în C fără plasmide. tulpina trachomatis L2 desemnată L2R a fost de numai 0,05%/ml (datele nu au fost prezentate), care a fost mult sub concentrațiile toxice pentru celulele gazdă. Prin urmare, am motivat că acest antibiotic ar putea fi utilizat pentru a selecta transformanții care exprimă pisica fără a sublinia semnificativ celulele gazdă.

am transformat L2R cu PGFP::SW2 și am selectat o jumătate din celulele transformate cu ampicilină, iar cealaltă jumătate cu cloramfenicol. Antibioticele (2% / ml ampicilină sau 0,1%/ml cloramfenicol) au fost adăugate în culturi la 10 ore după transformare. Începând cu trecerea 2, concentrațiile lor au fost crescute la 5 și, respectiv, 0,2 hectog / ml și au fost adăugate la momentul inoculării. Raportul de divizare între pasaje a rămas 1: 1 de la pasajul 1, deși pasajul 4. Chiar dacă CMI al cloramfenicolului, care a fost determinat la o multiplicitate scăzută a infecției (~0,1 unități formatoare de Incluziune pe celulă), a fost de 0,05 ectg/ml, unele dintre chlamydiae netransformate au fost de așteptat să formeze incluziuni în prezența a 0,1-0.2%/ml antibioticul, deoarece am utilizat un raport EB / celulă ridicat pentru transformare, iar eficacitatea inhibării creșterii chlamydiale de către antibiotice este influențată de multiplicitatea infecției . Cu protocolul de selecție descris mai sus, în culturile selectate cu ampicilină, sub un microscop cu contrast de fază, s-a constatat că aproape 100% celule conțin o includere cu RBs aberant la trecerea inițială. Incluziunile aberante care conțin RB erau încă prezente într-o proporție mică de celule la pasajul 2, dar au fost în mare parte înlocuite cu incluziuni aparent normale la pasajul 3. Incluziunile normale au fost găsite în aproximativ 20% celule, iar incluziunile anormale au fost rareori observate la pasajul 4. La pasajul 5, care a rezultat din inocularea cu 10% recoltă din Pasajul 4, incluziunile au fost găsite în 80% celule; aparent, niciuna dintre aceste incluziuni nu conținea RBs aberante.

deoarece cloramfenicolul nu determină chlamydiae să formeze RBs aberante, am evaluat rezistența la antibiotic prin dimensiunea incluziunii. Incluziuni de dimensiuni mai mici decât cele normale au fost detectate în aproape toate celulele la pasajul 1. Unele incluziuni, dar de dimensiuni foarte mici, au fost găsite la pasajul 2, iar majoritatea acestor incluziuni au fost înlocuite cu incluziuni de dimensiuni normale prin pasajul 3. Incluziunile de dimensiuni normale au fost găsite în mai mult de 20% celule la pasajul 4. La pasajul 5, derivat după inoculare cu recoltare de 10% la pasajul 4 și o creștere a concentrației de cloramfenicol (de la 0,2 la 0,5 la 0,5 la suta/ml), incluziuni de dimensiuni normale au fost găsite în aproape 100% celule 0000000.

în plus față de rezistența aparentă la agenții de selecție, am folosit expresia GFP și restaurarea sintezei glicogenului ca markeri suplimentari pentru transformarea cu succes . EBs recoltate din Pasajul 5 au fost utilizate pentru a infecta celulele McCoy la o rată de diluare 1:100 (echivalența numărului de celule) pentru experimente care determină expresia GFP și sinteza glicogenului (Figura 2). Așa cum era de așteptat, nici C. trachomatis L2 plin de plasmidă de tip sălbatic (434/bu) (figura 2a), nici L2R fără plasmide netransformate (figura 2b) nu au exprimat GFP. În concordanță cu constatările stabilite că sinteza glicogenului în C. trachomatis necesită plasmida sa, pata de iod a arătat că glicogenul a fost acumulat în incluziunile L2 de tip sălbatic (figura 2A), dar nu și în cele ale L2R (figura 2b). În prezența ampicilinei de 5 ectg/ml, care inhibă diviziunea RB, incluziunile L2R netransformate (figura 2c) au format incluziuni care conțin RBS gigant fără a produce glicogen; în timp ce cloramfenicolul (concentrație finală: 0,5 ectgg/ml) a inhibat complet formarea incluziunilor vizibile în celulele infectate cu L2R (figura 2D). În concordanță cu datele publicate de Wang și colab. , pGFP::SW2-transformat L2R selectat cu ampicilină format incluziuni GFP pozitive cu glicogen (figura 2e). PGFP:: SW2-transformat L2R selectat cu cloramfenicol au format, de asemenea, incluziuni GFP pozitive care conțin glicogen (figura 2f). Așa cum era de așteptat, transformanții selectați cu ampicilină au fost capabili să formeze incluziuni care conțin glicogen de dimensiuni normale, GFP-pozitive, în prezența cloramfenicolului (figura 2G); de asemenea, transformanții selectați cu cloramfenicol au fost complet rezistenți la ampicilină, au exprimat GFP și au produs glicogen (figura 2h). Aceste rezultate sugerează că gena pisicii din pGFP::Plasmida SW2 este funcțională în chlamydiae, iar rezistența la cloramfenicol poate fi utilizată ca marker de selecție pentru transformarea chlamydială.

includerea, expresia GFP și sinteza glicogenului pgfp:: SW2 transformanți ai C . trachomatis L2. Tulpina netransformată plină de plasmide 434 / bu (a), tulpina netranformată fără plasmide L2R (B-D) și L2R transformată selectată fie cu ampicilină (E, G), fie cu cloramfenicol (F, H) au fost cultivate fie cu mediu care conține un antibiotic indicat, fie cu mediu fără antibiotice. Imaginile incluziunilor în culturi nepătate și colorate cu iod au fost obținute cu microscopie de contrast de fază sau microscopie de fluorescență 48 h post-inoculare. În toate panourile, contrastul de fază și imaginile GFP sunt suprapuse.

apoi am eliminat gena de lactamază-lactamază din pgfp::Plasmida SW2 așa cum este descrisă în secțiunea “Metode” și a folosit plasmida pgfp-CAT::SW2 rezultată pentru a transforma L2R. chlamydiae transformate au fost supuse selecției cu cloramfenicol folosind același regim descris mai sus. Incluziunile rezistente la cloramfenicol au apărut în aproximativ 20% din celulele infectate din cultura pasajului 4. Microscopia fluorescentă și pata de iod au evidențiat incluziuni GFP și glicogen pozitive în celulele infectate cu EBs recoltate din Pasajul 5 și cultivate în prezența cloramfenicolului (Figura 3, panoul superior). Cu toate acestea, ca urmare a lipsei de lactamază-lactamază în plasmida PGFP-cat::SW2, transformanții nu au putut forma incluziuni normale în prezența ampicilinei; în schimb, incluziunile lor au fost umplute cu RBs aberante. În timp ce incluziunile neregulate erau încă pozitive pentru GFP, acestea erau în mare parte lipsite de glicogen (Figura 3, panoul inferior). După trecerea 5, transformanții PGFP-cat::SW2 au fost cultivați cu 0,5 hectolitri/ml cloramfenicol pentru patru pasaje suplimentare la un raport de divizare de 1: 100 pentru fiecare pasaj. Toate incluziunile de la pasajul 9 au avut același aspect ca incluziunile chlamydiae pline de plasmide și nu cea a L2R fără plasmide și s-a constatat că toate exprimă GFP (datele nu sunt prezentate). Aceste rezultate demonstrează că gena CAT din plasmida PGFP-CAT:: SW2, similară cu plasmida pGFP:: SW2, funcționează ca un marker de selecție pentru transformarea C. trachomatis.

includerea, expresia GFP și sinteza glicogenului în L2R transformat cu PGFP-CAT:: SW2. Celulele infectate cu transformanți selectați de cloramfenicol au fost expuse fie la cloramfenicol, fie la ampicilină. Imaginile incluziunilor în culturi nepătate și colorate cu iod au fost obținute cu microscopie de contrast de fază sau microscopie de fluorescență 48 h post-inoculare. Contrastul de fază și imaginile GFP sunt suprapuse.

trebuie remarcat faptul că Tam și colab. a încercat anterior să dezvolte un sistem de transformare cu gena CAT ca marker selectiv . În acest studiu, un vector de transfer care conține o genă de pisică a fost electroporat în EBs de C. trachomatis E (tulpina UW-5/CX) și L2 (tulpina 434/Bu). Deși atât ARNm CAT și activitatea enzimatică au fost detectabile în culturile inițiale de chlamydiae transformate, autorii nu au reușit să obțină transformanți stabili după selecție cu cloramfenicol pentru 4 pasaje. Este important de reținut că ambele tulpini electroporate conțin o plasmidă nativă care împărtășește aceeași origine de replicare cu plasmida recombinantă utilizată pentru transformare . Deoarece Wang și colab. au reușit să obțină transformanți rezistenți la penicilină stabili numai din L2R, un C fără plasmide. varianta trachomatis L2, dar nu tipul sălbatic, plin de plasmidă 434 / Bu, în condiții experimentale altfel identice , nu este surprinzător retrospectiv faptul că Tam și colab. nu a reușit să obțină clamidii rezistente la cloramfenicol.