Colagenul de tip III este crucial pentru fibrilogeneza colagenului I și pentru dezvoltarea cardiovasculară normală

rezultate și discuții

celulele ES (J-1) (22) au fost transfectate cu un vector de direcționare care conține un fragment de ADN genomic al genei Col3a1 în care regiunea promotor a genei și primul exon care codifică peptida semnal au fost șterse (Fig. 1A). Clonele de celule es vizate au fost identificate prin analiza Southern blot și utilizate pentru injectarea de blastocist (Fig. 1b superioară). Șoarecii mutanți au fost derivați din două clone de celule ES orientate independent și identificați prin analiza Southern blot (Fig. 1b inferior). Analiza proteică a colagenului din coadă și piele a arătat că șoarecii mutanți heterozigoți au o reducere de aproximativ 50% a colagenului de tip III, în timp ce nu a fost detectat colagen de tip III la animalele mutante homozigote (Fig. 1C).

animalele mutante au fost fertile, dar numai șoarecii heterozigoți au fost normali fenotipic. Șoarecii mutanți homozigoți au prezentat o rată medie de supraviețuire de 5% la vârsta de înțărcare, majoritatea deceselor survenind în primele 48 de ore după naștere (Tabelul 1). Cauza exactă a letalității neonatale nu este clară, deoarece puii morți au fost canibalizați înainte de a putea fi examinați, iar analiza histologică microscopică ușoară a mutanților homozigoți nou-născuți vii nu a detectat nicio anomalie brută. Șoarecii mutanți homozigoți adulți au apărut normali, cu excepția faptului că erau cu aproximativ 15% mai mici decât colegii lor de gunoi de același sex (datele nu sunt prezentate). Durata medie de viață a șoarecilor mutanți homozigoți a fost, totuși, de aproximativ 6 luni sau o cincime din durata normală de viață. Autopsia a arătat că ruptura vaselor de sânge a fost cauza majoră a scurtării vieții acestor șoareci (Tabelul 2). Locurile de Ruptură au fost sporadice și în cea mai mare parte asociate cu vasele de sânge mari. Analiza histochimică a fost efectuată pentru a găsi defectul care a cauzat fragilitatea peretelui vasului de sânge. Fig. 2 A și B prezintă o secțiune transversală a aortei abdominale normale. Peretele aortei este format din intima și media (Fig. 2A, săgeată) și adventitia (Fig. 2 A și B, vârfuri de săgeată). Mediul este format din fibre elastice (Fig. 2B, săgeți mari) și celule musculare netede (Fig. 2B, săgeți mici) și asigură elasticitatea aortei, în timp ce adventitia cuprinde în cea mai mare parte fibrile de colagen de tip I și limitează dilatarea aortei. Fig. 2C prezintă o secțiune transversală a unui anevrism disecant al aortei abdominale de la un șoarece mutant homozigot. Ruptura a traversat media (săgeata), ceea ce a dus la un canal plin de sânge (stea) între media și adventitia (vârfuri de săgeată) și a prăbușit parțial lumenul aortei. Adventitia s-a rupt în cele din urmă în altă parte, iar sângele s-a scurs în cavitatea peritoneală, așa cum este cazul oamenilor cu anevrism aortic letal (20). Dispunerea generală a fibrelor elastice și a celulelor musculare netede (Fig. 2D) a fost similară cu cea a comenzilor (Fig. 2B). Intensitatea și distribuția materialului matricei extracelulare și colorarea mai închisă în adventiția și între fibrele elastice și celulele musculare netede din intima șoarecilor mutanți (Fig. 2D) au fost comparabile cu cele ale controalelor de tip sălbatic (Fig. 2B). Nu au fost observate defecte evidente ale inimii și arterelor medii și mici la animalele mutante la microscopul luminos (datele nu sunt prezentate).

în plus față de anevrism, șoarecii mutanți au prezentat o mărire intestinală frecventă și o ruptură intestinală ocazională care a dus la moarte (Tabelul 2). Aproximativ 60% dintre șoarecii mutanți homozigoți au prezentat leziuni cutanate, dintre care cele mai severe s-au prezentat ca o rană deschisă de 1 cm lungime în zona umărului, care a pătruns complet în piele și a expus țesutul subdermic (Fig. 3). Rănile nu s-au datorat luptelor dintre animale, deoarece au fost observate la animalele închise separat. Analiza microscopică ușoară a pielii, intestinului și a altor organe interne, inclusiv ficatul și plămânii, nu a detectat nicio anomalie evidentă la animalele mutante (datele nu sunt prezentate).

pentru a defini defectele structurale la animalele mutante, s-au efectuat analize microscopice electronice ale aortei și inimii. Fig. 4 arată că fibrilele de colagen situate între celulele musculare netede sau între celulele musculare netede și fibrele elastice (Fig. 4A, săgeți) au fost absente sau reduse sever în mediul aortei mutante (Fig. 4B, săgeți). Cel mai izbitor, în adventitia unde majoritatea colagenului este de tip I, diametrul fibrilelor de colagen ale aortei mutante a fost foarte variabil (comparați Fig. 4 D la C). Când fibrilele au fost numărate și diametrul acestor fibrile măsurat într-o anumită zonă a adventiției, am constatat că numărul fibrilelor din mutanți a fost redus la aproximativ o treime din cel al tipului sălbatic, în timp ce diametrul mediu al fibrilelor din mutanți a fost de aproximativ două ori mai mare decât cel al șoarecilor de tip sălbatic (Fig. 5). Similar cu aorta, fibrilele de colagen dintre epicard și miocard au fost reduse sau lipsesc, iar microvilii epicardului au fost subdezvoltați în inima șoarecilor mutanți (datele nu sunt prezentate).

în plus față de sistemul cardiovascular, pielea, intestinul, ficatul și plămânul șoarecilor mutanți au fost examinați prin microscopie electronică. Ca și în cazul adventiției aortei, colagenul i fibrile în pielea mutantă (Fig. 4F, săgeți și vârfuri de săgeată) au fost dezorganizate și au un diametru foarte variabil în comparație cu cele ale șoarecilor de tip sălbatic (Fig. 4E, săgeți). Această modificare a fost observată și la nivelul ficatului și plămânilor șoarecilor mutanți (datele nu sunt prezentate). Mai mult, fibrilele de colagen lipseau sau erau foarte reduse în submucoasa și seroza intestinelor mutante (datele nu sunt prezentate) sugerând că fibrilele de colagen din aceste zone sunt în mare parte fibrile de colagen de tip III.

studiile anterioare care au introdus mutații vizate în genele Col1a1, Col2a1, Col5a2 și Col9a1 au adus informații importante despre funcția acestor colageni (24-27). Aici arătăm că colagenul de tip III are un rol critic în fibrilogeneză, care este o parte importantă a dezvoltării unor organe precum sistemul cardiovascular, intestinul și pielea. Lipsa colagenului de tip III a perturbat fibrilogeneza și a dus la dezvoltarea defectuoasă și eșecul funcțional al acestor organe. În condiții fiziologice, colagenul de tip III nu este doar o componentă esențială a fibrilelor din țesuturi, cum ar fi mediul aortei, ci și un element important de reglementare în fibrilogeneza colagenului de tip I. Rezultatele noastre sugerează că colagenul de tip III reglează diametrul fibrilelor de colagen de tip I, care servește ca mecanism pentru a satisface cerințele fiziologice ale diferitelor țesuturi sau ale unui țesut în diferite stadii de dezvoltare. Fenotipul șoarecilor cu deficit de colagen de tip III seamănă foarte mult cu manifestările clinice ale pacienților cu sindrom Ehlers–Danlos de tip IV la care moartea rezultă din vasele de sânge sau ruptura intestinală (20). Prin urmare, acești șoareci mutanți ar trebui să se dovedească a fi modele animale bune pentru înțelegerea acestei boli și, eventual, testarea abordărilor terapeutice.