COLO 205

cultura de succes a celulelor tale:

*vă rugăm să citiți informațiile tehnice importante care urmează înainte de a manipula liniile celulare furnizate de ECACC*. Aceste informații sunt disponibile și în format PDF din meniul nostru principal, sub ‘Asistență Clienți’ (click aici).

depozitarea celulelor congelate

la primire, fiolele congelate trebuie transferate direct în azot lichid în fază gazoasă fără întârziere, cu excepția cazului în care trebuie utilizate imediat. Nu utilizați ca alternativă un congelator cu 80 de milimetri c; acest lucru va duce la pierderea viabilității.

cum să gestionați celulele congelate la primire

la primirea unei expedieri de linii celulare congelate furnizate de ECACC, este important ca utilizatorul final să acorde atenție expedierii fără întârziere. Recomandările tehnice care însoțesc liniile celulare trebuie consultate înainte de a scoate fiolele din gheața carbonică. Manipularea corectă imediat după primire este esențială pentru stabilirea cu succes a liniei celulare în laboratorul utilizatorului final.

în momentul în care este comandată o linie celulară, utilizatorii finali ar trebui să ia în considerare și condițiile de cultură pentru noua linie celulară și să se asigure că mediul adecvat va fi disponibil la sosirea celulelor.

importanța numărării celulelor

efectuați un număr de celule viabile atunci când resuscitați și recoltați culturi de celule. Unul dintre cele mai frecvente motive pentru eșecul stabilirii celulelor în cultură se datorează utilizării unei densități incorecte de însămânțare a celulelor viabile în momentul resuscitării, adică a celulelor de însămânțare prea mici sau prea mari. Acest lucru poate fi evitat prin efectuarea unui număr de celule viabile și urmând densitatea recomandată de însămânțare.

pentru linia celulară specifică cu care lucrați, citiți informațiile furnizate în fila ‘Descriere’ de pe pagina site-ului nostru web. Aceste informații pot fi găsite și în fișa de date a liniei celulare, care vă va fi furnizată pe suport de hârtie cu expedierea liniei celulare. Densitatea însămânțării este prezentată în informațiile de rutină ale subculturii. Când celulele de însămânțare imediat după resuscitare, utilizați capătul mediu până la cel superior al intervalului de densitate de însămânțare dat.

resuscitarea celulelor înghețate

este important să manipulați fiolele congelate cu grijă; purtați un strat de laborator, o mască de protecție completă și mănuși. În cazuri rare, fiolele pot exploda la încălzire datorită expansiunii azotului lichid rezidual prins.

1. Într-un dulap de siguranță microbiologică, țineți un țesut înmuiat în alcool 70% în jurul capacului fiolei congelate. Rotiți capacul cu un sfert de rotație pentru a elibera orice azot lichid rezidual care poate fi prins. Strângeți din nou capacul. Transferați rapid fiola într-o baie de apă de 37oC până când rămân doar unul sau două cristale mici de gheață, dacă există (1-2 minute). Este important să se dezghețe rapid pentru a minimiza orice deteriorare a membranelor celulare.
Notă: Nu scufundați complet fiola, deoarece acest lucru poate crește riscul de contaminare.

2. Ștergeți fiola cu un țesut înmuiat în alcool 70% înainte de deschidere.

3. Pipetați întregul conținut al fiolei într-un tub steril (de exemplu, capacitate de 15 ml). Apoi adăugați încet 5 ml mediu preîncălzit care a fost deja completat cu constituenții corespunzători. Determinați densitatea celulară viabilă folosind pata albastră de tripan, un hemocitometru și un microscop inversat pentru a număra celulele sau metoda echivalentă de numărare a celulelor. Transferați volumul adecvat de suspensie celulară pentru a obține densitatea de însămânțare a celulelor recomandată la introducerea datelor liniei celulare.

pentru liniile celulare aderente: reglați volumul mediului și, dacă este necesar, dimensiunea balonului, pentru a obține densitatea de însămânțare a celulelor recomandată în fișa tehnică a liniei celulare. O etapă de pre-centrifugare pentru îndepărtarea crioprotectantului nu este în mod normal necesară, deoarece prima schimbare a mediei va elimina crioprotectantul rezidual. Dacă este, atunci acest lucru va fi specificat în fișa tehnică. Dacă celulele trebuie utilizate imediat (de exemplu, pentru un test pe bază de celule), mai degrabă decât subculturate, poate fi recomandabil să se efectueze o etapă de pre-centrifugare pentru a elimina crioprotectorul.

pentru liniile celulare de suspensie*: se recomandă o etapă de pre-centrifugare pentru îndepărtarea crioprotectorului, adică. se peletizează celulele prin centrifugare la 150 x g timp de 5 minute și se omogenizează peleta celulară în mediu proaspăt, utilizând volumul adecvat pentru a obține densitatea corectă de însămânțare.

1. Incubați flacoanele la temperatura și nivelul de CO2 recomandat în fișa tehnică. Dacă se utilizează un incubator alimentat cu CO2, balonul trebuie să aibă un capac ventilat pentru a permite schimbul gazos.

culturi Hybridoma din congelate

la recuperarea culturilor hybridoma din culturi congelate, nu este neobișnuit ca creșterea inițială să fie mai lentă decât se aștepta și se poate observa o scădere a viabilității. Stabilirea unei culturi cu proliferare activă poate dura până la 2 săptămâni.

la resuscitare este esențială o etapă de centrifugare pentru îndepărtarea crioprotectorului. Decongelați rapid fiola congelată într-o baie de apă la 37 centi C timp de 1-2 minute. Transferați conținutul într-un tub de centrifugă și adăugați încet 5-10ml de mediu de creștere preîncălzit+. Scoateți un eșantion pentru numărare. Se centrifughează la 100 x g timp de 2-3 minute la celulele pelete și semințe la o densitate relativ mare de 5-7 x 105 celule/ml. Așezați Balonul de cultură plat și observați în mod regulat până când se văd celule proliferante viabile.

+adesea culturile hybridoma pot beneficia de a fi omogenizate cu medii completate cu 20% FBS în stadiul critic timpuriu al stabilirii culturii imediat după resuscitare.

procedura pentru înghețarea celulelor

ECACC recomandă înghețarea unui stoc de linii celulare la scurt timp după primire (între 2 – 4 x 106 celule/ml) ca măsură de precauție.

următorul ghid este oferit pentru prepararea și crioconservarea liniilor celulare.

1. Recoltați celulele în faza log de creștere în același mod utilizat pentru subcultura de rutină. Pentru liniile celulare aderente, recoltați cât mai aproape de confluența de 80-90%.

2. Procedura standard este de a utiliza 90% ser + 10% crioprotector pentru toate liniile celulare, cu excepția cazului în care se specifică altfel în fișa tehnică. Se lasă 1 ml pentru fiecare fiolă. Majoritatea liniilor celulare pot fi înghețate în mediul de cultură adecvat suplimentat cu 20% ser și 10% crioprotector. Acesta este de obicei DMSO, dar în anumite cazuri se recomandă glicerol. Dacă DMSO nu este adecvat, o alternativă va fi specificată în fișa tehnică a liniei celulare.

3. Celule pelete prin centrifugare, de exemplu 150 x g timp de 5 minute. Omogenizați peletele celulare în mediul de congelare adecvat pentru a obține o concentrație finală de celule între 2 – 4 x 106 celule/ml și pipetați 1 ml în fiecare fiolă.

4. Congelați celulele la o rată de răcire cuprinsă între 1-3OC/min folosind un congelator programabil cu viteză controlată sau o alternativă adecvată1. Când temperatura atinge cel puțin-130oc, transferați fiola într-un vas de stocare a azotului lichid în fază gazoasă.