Colony PCR

Colony PCR este o metodă convenabilă de mare viteză pentru determinarea prezenței sau absenței ADN-ului inserat în construcțiile plasmidice. Transformanții individuali pot fi fie lizați în apă cu o etapă scurtă de încălzire, fie adăugați direct la reacția PCR și lizați în timpul etapei inițiale de încălzire. Această etapă inițială de încălzire determină eliberarea ADN-ului plasmidic din celulă, astfel încât poate servi drept șablon pentru reacția de amplificare. Grundurile concepute pentru a viza în mod specific ADN-ul inserat pot fi utilizate pentru a determina dacă constructul conține fragmentul de ADN de interes. Alternativ, primerii care vizează ADN-ul vector care flancează inserția pot fi utilizați pentru a determina dacă inserția are sau nu dimensiunea moleculară corectă. Inserția primerilor specifici poate furniza informații atât despre specificitatea, cât și despre dimensiunea ADN-ului inserat, în timp ce utilizarea primerilor specifici vectoriali permite screeningul mai multor construcții simultan. Colony PCR poate fi, de asemenea, utilizat pentru a determina orientarea inserției. Amplificarea PCR a plasmidei folosind un primer specific inserției asociat cu un primer specific vectorului poate fi proiectată pentru a produce un amplicon de o dimensiune specifică numai dacă inserția este în orientarea corectă. În toate proiectele experimentale, prezența sau absența unui amplicon PCR și dimensiunea produsului sunt determinate prin electroforeză alături de un marker de dimensiune ADN pe un gel de agaroză.