cum se proiectează gRNA pentru editarea genomului CRISPR?

gRNA ghidează sistemul CRIPR Cas9 la locația genomică potrivită pentru efectuarea unei pauze duble.Specificitatea targerting a sistemului CRISPR Cas9 este determinată de nucleotidele 20 la capătul 5′ al gRNA. Baza gRNA se împerechează cu catena complementară a secvenței țintă și nucleaza Cas9 efectuează o pauză dublă.

în timp ce proiectarea unui gRNA următoarele lucruri trebuie să fie luate în considerare.

1) Conținutul GC: Intervalul tipic este cuprins între 40% – 80%. Un conținut mai mare de GC stabilizează duplexul ARN-ADN în timp ce destabilizează hibridizările în afara țintei

2) Lungime: Lungimea ar putea fi ajustată și variază între 17-24 perechi de baze. O secvență mai scurtă duce la minimizarea efectelor țintă. (17 bp este cea mai mică limită a lungimii secvenței de ghidare, orice lungime a secvenței de ghidare orice lungime mai mică de 17 are o șansă Statistică de a viza mai mulți loci genomici.)

3)Efecte potențiale în afara țintei: toleranța la nepotrivire și site-ul țintă este ceea ce duce la efecte în afara țintei. Acest lucru poate fi redus prin căutările cu efect țintă la scară largă a genomului.

există multe site-uri care ajuta la proiectarea gRNAs. Unele dintre ele sunt Chop Chop (Harvard), Broad Institute sgrna designer și Biotools.

vă explic cum să utilizați site-ul Chop Chop aici,

1) Du-te la https://chopchop.cbu.uib.no/

2) Selectați specia

3) Selectați ID-ul genei specifice speciei sau tăiați și lipiți nucleotida de interes și începeți analiza.

odată ce analiza se face reprezentarea grafică a site-ului gRNA specifice vor fi afișate. Fiecare potențial gRNA va arăta, de asemenea, posibilele efecte țintă off. Selectați cele cu efecte țintă mai puțin off.