depleția macrofagelor prin lipozomi care conțin clodronat reduce formarea Neointimală după lezarea balonului la șobolani și iepuri

celulele inflamatorii joacă un rol major în repararea vasculară, recrutate imediat după leziune.1,2 infiltrarea macrofagelor în țesutul aterectomiei și starea de activare a monocitelor sanguine se corelează cu o rată crescută de restenoză.3,4 efectele macrofagelor în restenoză sunt probabil cauzate de capacitatea lor de a exprima numeroși factori de creștere, citokine și enzime care contribuie la dezvoltarea restenozei.5 astfel, am emis ipoteza că inactivarea sistemică a monocitelor și macrofagelor poate duce la atenuarea formării neointimale și că macrofagele joacă un rol esențial în patogeneza restenozei.

depleția macrofagelor poate fi obținută prin injectarea sistemică de lipozomi care conțin clodronat.6 Clodronatul aparține familiei bifosfonaților (BPs), agenți de căutare a oaselor care sunt inhibitori puternici ai osteoclastelor. Ca și alte BPs, clodronatul are o permeabilitate slabă a membranei celulare.7 lipozomii sunt preluați cu ușurință de celulele sistemului reticuloendotelial, în special de macrofage. Administrarea clodronatului mediată de lipozomi inactivează și ucide macrofagele după fagocitoză eficientă8, dar nu este toxică pentru celulele nefagocitare.6

metode

lipozomi

clodronat (Sifavitor) și rodamină RE (lipide polare Avanti) au fost încapsulate în lipozomi compuși din 50 mmol/l distearoil-fosfatidilglicerol (Dspg) (Avanti), 100 mmol/l colesterol (Sigma Chemicals) și 150 mmol/L de 1,2-glicerol (Dspg) (Avanti), 100 mmol / l colesterol (Sigma Chemicals) și 150 mmol / l distearoil-SN-glicero-3-Fosfocolină (Dspc) (Avanti) prin tehnica de evaporare în fază inversă, așa cum este descris în altă parte.9 dimensiunea medie a lipozomilor a fost de 190 de 18 nm, 24,5 mmol/L și, respectiv, 20 mmol/l, clodronat și lipide.

validarea activității biologice LC a fost determinată pe 264 de celule brute macrofage. LC, dar nu și clodronatul liber, au redus semnificativ numărul și proliferarea celulelor viabile într-o manieră dependentă de doză și nu au afectat viabilitatea și proliferarea celulelor musculare netede (SMC) sau a celulelor endoteliale (ce) la concentrații de până la 500 MMC/L (datele nu sunt prezentate), în conformitate cu datele publicate.8,10

model de iepure

iepuri albi din Noua Zeelandă (Harlan Laboratories, Ierusalim, Israel) cu o greutate de 2,5 până la 3.5 kg au fost utilizate în conformitate cu liniile directoare pentru îngrijirea animalelor de la Universitatea Ebraică din Ierusalim și Institutele Naționale de sănătate (SUA). Animalele au fost hrănite cu o dietă aterogenă de 2% colesterol și 6% ulei de arahide, începând cu 30 de zile înainte de angioplastie. S-a constatat hipercolesterolemia (colesterolul plasmatic >1200 mg/dL). Animalele au fost anesteziate cu xilazină (7 mg/kg) și ketamină (40 mg/kg). S-au administrat heparină (200 U/kg), atropină (0,05 mg) și nicotinat de norfloxacină (70 mg). Leziunea cu balon a fost efectuată pe artera carotidă comună stângă cu un cateter cu balon de angioplastie de 3 mm (Cordis, 2 inflație de 1 minut la 8 atm). Animalele au fost repartizate aleatoriu la administrarea intravenoasă de clodronat lipozomal sau liber (15 mg/kg), lipozomi goi sau tampon. Un investigator orbit de tipul de grup experimental a efectuat experimentele. După eutanasia cu pentotal, arterele au fost fixate prin perfuzie in situ cu 150 mL soluție de formaldehidă 4% (pH 7.4), prelucrat pentru analiză morfometrică și colorat cu colorare cu elastină Verhoeff, hematoxilină Mayer și eozină și Pentacrom movat modificat.

model de șobolan

s-au utilizat șobolani Sabra masculi (laboratoarele Harlan), cu o greutate de 350 până la 420 g. Modelul de leziune a carotidei de șobolan a fost efectuat așa cum a fost descris anterior.11,12 clodronat lipozomal (15 mg/kg) a fost injectat în zilele -1 și +6. Organele au fost recoltate în ziua 14 și prelucrate conform descrierii de mai sus.

analiza morfometrică

opt până la 10 secțiuni din fiecare diapozitiv au fost analizate prin intermediul analizei morfometrice computerizate (imagine NIH) de către un investigator orbit de tipul grupului experimental. Secțiunea cu cea mai mare îngustare luminală de către neointima a fost analizată așa cum s-a descris anterior.11 lumenul rezidual, aria delimitată de lamina elastică internă (lumenul original) și aria circumscrisă de lamina elastică externă (aria arterială totală) au fost măsurate direct. Gradul de îngroșare neointimală a fost exprimat ca raportul dintre aria neointimei și lumenul inițial (% stenoză) și ca raportul dintre aria neointimală și aria mediei (N/m). Gradul de remodelare, constrictiv (negativ) și expansiv (pozitiv) și raportul de remodelare (RR) A fost estimat prin compararea raportului dintre suprafața arterială totală a segmentului rănit de balon cu cel al unui segment de referință adiacent, neinjurat.

citometria în flux

sângele anticoagulant (200 ilft) a fost incubat timp de 30 minute (4 ilft C, în întuneric) cu anti-CD14 conjugat cu RPE de șoarece (DAKO). Soluția de lizare FACS (diluție 1:20) a fost adăugată timp de 15 minute. Celulele reziduale au fost spălate (1500 RPM, 5 minute, 4 C) în mediu FACS (PBS, 1% BSA, 0,02% azidă de sodiu) și suspendate în mediu FACS de 1 mL pentru citometrie în flux. Monocitele au fost identificate în funcție de dimensiunea lor relativă, împrăștierea laterală și fluorescența.

distribuția lipozomilor

iepurii au fost injectați cu lipozomi marcați cu rodamină (0,4 mg/kg) și LC sau tampon în ziua -1 și eutanasiați în zilele +1 și +6. Monocitele din sânge au fost separate prin utilizarea unui gradient Ficoll (Sigma) și centrifugare (1500 RPM, 5 minute). Țesuturile recoltate au fost clătite în soluție salină; secțiunile au fost montate pe diapozitive și observate prin microscopie confocală (Zeiss lsm 410).

imunohistochimie

probele Explantate au fost excizate după perfuzie salină scurtă și imediat înghețate în compusul OCT pentru criosecționare (Ted Pella, Inc). Diapozitivele au fost deparafinizate, incubate cu 1% H2O2 în metanol (10 minute) pentru a bloca peroxidaza endogenă și apoi cu 10% ser de cal PBS timp de (20 minute). Anticorpii primari pentru rabbit RAM-11 (DAKO) sau PCNA (PC10, DAKO) au fost aplicați timp de 1 oră la 37 C. Secțiunile au fost apoi spălate cu PBS urmate de anticorpi secundari biotinilați (IgG anti-șoarece de cal, laborator Vector) și un complex avidin-biotină-peroxidază (kit ABC Elite, laborator Vector) timp de 30 de minute fiecare. Dezvoltarea culorii a fost realizată prin expunerea de 5 minute la tetrahidroclorură de 3,3 ‘ – diaminobenzidină (substrat de peroxidază DAB, Sigma Chemical Co) în prezența substratului de peroxidază (Sigma). Diapozitivele au fost ușor contracarate cu Gill No. 3 hematoxilină (Sigma). Colorația pozitivă a fost evaluată la microscop (Olympus, BX40) la 2 0,25 10 0,0.25 de mărire și cadre video digitalizate. Prevalența macrofagelor a fost evaluată ca aria procentuală medie ocupată de celulele colorate pozitiv în 5 până la 6 câmpuri de mare putere.

producția și transcripția IL-1 inkst

grupuri Separate de animale au fost utilizate pentru aceste studii. Arterele și ficatul au fost omogenizate în tampon de colagenază, iar IL-1-ul extras a fost măsurat folosind kituri comerciale ELISA (sisteme R&D).

pentru analiza reacției în lanț a transcripției–polimerazei inverse (RT-PCR), ARN-ul din arterele carotide a fost extras cu ajutorul unui kit de izolare a ARN (tehnologii de viață). Au fost examinate calitatea, dimensiunea și cantitatea de ARN, iar valorile benzilor au fost normalizate la expresia ARNm de actină-actină.13

activitatea Metaloproteinazei-2 a matricei

supernatantul omogenatului arterelor în tamponul colagenazei a fost analizat pentru activitatea colagenazei. Probele au fost separate pe gelatină impregnată (1 mg / mL: Difco) SPS 8% geluri de poliacrilamidă în condiții de nereducere, agitate 30 minute în 2,5% Triton X-100 (BDH), incubate în tampon de colagenază (16 ore, 37 C) și colorate cu 0,5% Coomassie G 250 (BioRad) în metanol/acid acetic/H2O (30:10:60). Intensitatea benzii a fost determinată prin densitometrie computerizată (dinamică moleculară tip 300A).

statistici

datele sunt exprimate ca valori medii ale SD-ului de la sută la sută. Comparațiile rezultatelor histologice între grupul de control și grupul de tratament au fost făcute prin testul T al elevului nepereche. Comparațiile monocitelor din sânge și citokinelor în timp au fost făcute cu analiza ANOVA cu 2 căi. Diferențele au fost considerate semnificative statistic la P < 0,05.

rezultate

prevenirea hiperplaziei Postangioplastice

proliferarea masivă a SMC și formarea matricei extracelulare a fost observată la animalele de control după lezarea balonului (Figura 1, a și b). Nu s-au constatat diferențe semnificative între tratamentul cu lipozomi goi, soluție salină sau clodronat liber în soluție (rezultatele cumulate ca martor). Raportul N / M a fost de 1,4 0,44 int. (figura 1e), iar stenoza luminala a fost de 75 int. 8%. LC (15 mg/kg, zile -1 și +6) a redus raportul N/m la 0,66 0,2 int (Figura 1,c, d și e) și stenoza luminală la 41 int 8%. Remodelarea expansivă ușoară a avut loc în ambele grupuri de control (RR=1. 22, 0,24) și animale tratate cu LC(RR=1,29, 0,25). Zona mediană, morfologia osoasă și compoziția minerală nu au fost afectate de tratamentul cu LC (datele nu au fost prezentate). Nu s-au observat infecții evidente și efecte secundare sistemice detectabile.

pentru a stabili efectul depleției macrofagelor într-un model animal nonhipercolesterolemic (fără celule de spumă), a fost utilizat modelul de leziune carotidiană la șobolan.11 neointima marcată a fost suprimată prin tratamentul cu LC, fără modificări semnificative ale ariei arteriale medii și totale (tabel).

mecanism de acțiune

reducerea monocitelor din sânge și a macrofagelor tisulare

valoarea inițială a monocitelor a fost de 2, 8 0, 5% din globulele albe din sânge (WBC). Înainte de operație, la 24 de ore după injectarea LC,monocitele au fost reduse brusc la <0,2% din totalul WBC (Figura 2, a și b), în timp ce numărul WBC a rămas neschimbat. La trei zile după intervenția chirurgicală, monocitele sanguine au fost ușor crescute la 3,5 0,4% la animalele de control și 0,7 0,7% la animalele tratate cu LC, revenind la valorile inițiale după 6 zile (figura 2c).

macrofagele ficatului și splinei au fost reduse cu LC (colorarea RAM 11) la 6 zile după leziune (Figura 3). Zona pătată pozitiv în ficat a fost semnificativ redusă de la 21,5 XT 4% la 14,7 XT 2,9% și în splină de la 33,3 XT 1,5% la 11,4 XT 3% la iepurii de control și, respectiv, tratați cu LC. În mod similar, a fost observată o scădere a colorației arteriale RAM-11 pentru macrofage la iepurii tratați cu LC la 3 și 6 zile după leziune (Figura 4).

reducerea monocitelor și macrofagelor a fost, de asemenea, detectată prin injectarea de lipozomi fluorescenți (FL). Reducerea semnificativă a semnalului fluorescent a fost observată în monocitele din sânge (precum și în numărul redus) și în ficatul și splina animalelor tratate cu LC (Figura 5). FL au fost detectate în arterele rănite, dar nu în arterele intacte. FL administrat concomitent cu LC a redus semnificativ semnalul fluorescent în peretele arterial rănit (Figura 5).

PCNA, IL-1 inkt și Metaloproteinaza matricială-2

suprafața colorată pozitiv pentru PCNA la 6 zile după leziune a fost semnificativ redusă de la 5,6 int 2,6% la animalele de control la 1,7 int 1,3% la iepurii tratați cu LC (Figura 6, a și b). Neointima a fost abia observată în acest moment timpuriu în care proliferarea CMM este maximă.

analiza concentrațiilor de IL-1 în țesutul arterial după leziune a evidențiat un model în formă de clopot care a atins punctul culminant la 6 zile după leziune și a revenit la valorile bazale după 30 de zile (figura 7a), iar o scădere semnificativă a concentrațiilor de IL-1 în țesutul arterial după 3 și 6 zile la animalele tratate cu LC a fost observată. La animalele de control, transcripția ARNm IL-1 la sută a fost mai puternică în ziua 3 decât expresia mai slabă la 1 zi după leziune, dar ambele au fost reduse semnificativ prin tratamentul cu LC (figura 7b). Nivelurile de IL-1 în ficat au fost, de asemenea, reduse după o singură injecție de LC în ziua -1, înclinându-se la nivelurile bazale la 30 de zile (datele nu sunt prezentate).

activitatea metaloproteinazei matricei arteriale (MMP-2) a crescut după leziune, prezentând un model în formă de clopot care a atins punctul culminant la 6 zile (292 ct 46) și revenind la nivelurile bazale la 14 zile (figura 7c). LC a atenuat semnificativ activitatea MMP-2, iar în ziua 6 a fost doar 52 17.

discuție

acest studiu arată pentru prima dată că inactivarea macrofagelor prin administrarea sistemică a clodronatului încapsulat cu lipozomi inhibă pierderea luminală după lezarea balonului atât la șobolani, cât și la iepurii hipercolesterolemici. Aceste rezultate validează ipoteza noastră că macrofagele joacă un rol esențial în patogeneza arteriopatiilor accelerate. Creșterea observată a zonei luminale a fost obținută în principal prin reducerea hiperplaziei neointimale. A fost demonstrată și o creștere ușoară a remodelării expansive, dar contribuția sa la diferența de zonă luminală a fost minimă.

Clodronatul aparține familiei BPs, medicamente utilizate clinic în afecțiuni osoase, inclusiv osteoporoză. Fiind foarte hidrofil și încărcat negativ, BP-urile libere sunt aproape incapabile să traverseze membranele celulare.7 absorbția BP prin osteoclaste resorbante osoase (originare ca macrofage din monocitele sanguine) apare atunci când celulele înghit osul acoperit cu medicament.7 nici clodronatul liber, nici LC nu au inhibat proliferarea SMC sau ce sau formarea neointimală. Endocitoza eficientă și selectivă a clodronatului în macrofage se realizează prin încapsularea clodronatului în lipozomi.9,10,14 după fagocitoză, acțiunea lizozomală perturbă bistraturile grase ale lipozomului și clodronatul liber este eliberat în celulă, provocând leziuni funcționale ireversibile și apoptoză.8,15

administrarea LC a întrerupt probabil răspunsul în fază incipientă la leziune, care este mediat de migrarea macrofagelor ca răspuns la expresia MCP-1.16 injectarea LC înainte de leziune monocite din sânge epuizate brusc (Figura 2) și numărul și activitatea macrofagelor în ficat, splină și peretele arterial rănit (figurile 3, 4 și 5). Reducerea monocitelor disponibile în momentul leziunii a redus hiperplazia intimă, probabil similară cu efectele observate la dezactivarea monocitelor din sânge prin IL-10.17 blocând migrarea monocitelor/macrofagelor către vasul rănit din lumen și/sau adventitia (Figura 5) a împiedicat efectele acestor celule asupra migrării și proliferării SMC.

valorile IL-1 și MMP-2 au fost reduse în segmentele arteriale lezate după tratamentul cu LC. Aceste produse majore ale macrofagelor activate, secretate după leziuni arteriale, contribuie la procesul de proliferare neointimală.18-20 proliferarea redusă a CMM poate contribui, de asemenea, la reducerea IL-1 și MMP-2.21 cu toate acestea,deoarece CMM nu afectează CMM și SCM și nu au niciun efect asupra fibroblastelor9, macrofagul este probabil ținta principală pentru CMM. Inhibarea hiperplaziei intimale în modelul de șobolan, fără celule de spumă în arteră, susține în continuare epuizarea sistemică a macrofagelor, deoarece mecanismul care determină proliferarea SMC redusă și formarea neointimală. Luate împreună, acest efect imunomodulator sistemic tranzitoriu și antiinflamator a redus migrația și proliferarea SMC și restenoza arterială.

constatările noastre sunt concurente cu efectele benefice observate după modularea funcției macrofage prin diferite modalități. Reducerea formării neointimei după leziune a fost obținută la iepuri prin blocarea Mac-122 și la șoarecii cu deficit de Mac-1.23 Astfel, în conformitate cu rapoartele recente, 9,17,22,23 procesul inflamator joacă un rol esențial în cascada formării neointimei. Epuizarea macrofagelor reduce, de asemenea, hiperplazia grefelor venoase.24 În pofida diferitelor patologii în ceea ce privește declanșatorul, vasul afectat, placa subiacentă din artera angioplasticată, compoziția țesutului stenotic și durata procesului, efectul pozitiv în modelul grefei venoase sugerează un rol comun al macrofagelor în stimularea hiperplaziei vasculare intimale.

implicații și limitări

clodronatul liber nu pătrunde în celule și are un timp de înjumătățire scurt în circulația sistemică.6 Clodronatul care se scurge din macrofage și lipozomi morți nu se acumulează într-o măsură semnificativă în alte țesuturi decât cele osoase. Nu s-a observat niciun efect asupra creșterii somatice sau asupra conținutului de minerale serice după tratamentul cu LC, deoarece rezultatul formulării lipozomale, ca și în cazul majorității altor lipozomi și sisteme de administrare a particulelor, a fost în sistemul reticuloendotelial. În plus, două injecții de clodronat liber de 15 mg/kg nu trebuie să aibă niciun efect asupra osului normal.25

inactivarea macrofagelor prezintă pericolul de imunosupresie și infecție. Cu toate acestea,ca și în studiile privind mice26 cu deficit de Mac-1 și șobolani, 24 nu a fost observată nicio infecție evidentă în studiul nostru cu depleție tranzitorie a macrofagelor. Monocitele din sânge s-au recuperat complet în acest studiu la 6 zile după injectare, iar concentrațiile de IL-1 la sută au revenit la valorile bazale. Alții au arătat că recuperarea funcției macrofage la 4 până la 6 zile după epuizarea indusă de LC nu induce efecte toxice pe termen lung.6,14 implicațiile clinice ale depleției parțiale tranzitorii a macrofagelor hepatice și splenice cu LC sistemic trebuie examinate în continuare în studiile la om.

un număr mare de rapoarte de încercări farmacologice de inhibare a hiperplaziei intime la animale nu au fost traduse în inhibarea ulterioară a restenozei la om. Studiul actual utilizează LC ca instrument de investigație pentru a elucida rolul inflamației în repararea vasculară și valoarea posibilă a modulării imunității înnăscute în reducerea hiperplaziei intime postinjurice. Că beneficiul a fost observat la două modele animale, șobolanul și iepurele hipercolesterolemic, cu leziuni disparate și grade diferite de inflamație, susține rolul major al monocitelor și macrofagelor în repararea vasculară și crește valoarea predictivă pentru inhibarea restenozei la om.

zonele bogate în macrofage sunt predominante în leziunile aterosclerotice ale pacienților cu angină instabilă și infarct miocardic acut,3 și macrofagele mediază probabil ruptura plăcii aterosclerotice și debutul brusc al sindroamelor coronariene acute.27 Sunt necesare studii suplimentare pentru a examina dacă depleția macrofagelor de către bifosfonații lipozomali poate conferi o strategie de stabilizare a altor vasculopatii și cardiomiopatii mediate inflamator, inclusiv sindroame coronariene acute.

în concluzie, administrarea LC a inhibat proliferarea neointimală după lezarea balonului la șobolan și la modelele hipercolesterolemice de iepure. Mecanismul sugerat este modularea sistemică selectivă, tranzitorie a activității monocitelor/macrofagelor. Macrofagele, deși relativ slabe în țesutul neointimal, joacă un rol major în procesul de proliferare neointimală. Prin urmare, modularea precoce și inactivarea macrofagelor timp de 1 săptămână după leziune scad semnificativ îngustarea arterială postangioplastică ulterior.

note de subsol