detectarea și identificarea prin PCR a Clostridium chauvoei în izolate clinice, fecale și substraturi de bovine din instalații de biogaz

probe din cazuri suspectate de gambă neagră

pentru probe de mușchi din cazuri suspectate de gambă neagră, rezultatele din cultură pe plăci FAA urmate de PCR din material de colonie au în acord cu sau chiar mai bine decât metoda de identificare biochimică (tabelul 2). Aceste rezultate sunt în concordanță cu Uzal și colab. . Acest studiu a demonstrat că prepararea ADN-ului din cultură înainte de PCR a dat rezultate mai bune decât PCR aplicat direct pe biomasă.

cultura urmată de metode biochimice de identificare este complicată în probele cu un conținut ridicat de floră contaminantă din cauza nevoii de cultură pură și sensibilitatea a fost substanțial mai mică decât pentru Cultură și PCR. În opt cazuri a fost imposibil de detectat C. chauvoei prin cultură și identificare biochimică, dar organismul a fost detectat prin PCR (Tabelul 2). Pentru a face un diagnostic de picior negru, țesutul muscular este luat la autopsie, deoarece cantitatea de C. chauvoei este probabil mai mare în țesutul muscular decât în sânge. Proba unică de sânge a fost luată incorect, dar întrebarea a fost blackleg.

de asemenea, într-un studiu anterior al unui focar de picior negru, cultura și detectarea prin PCR au dat rezultate mai bune decât analiza biochimică . Într-unul din cazuri, cultura primară a unui mușchi pe o placă de agar de sânge a fost depășită de C. septicum, dar a dat rezultate pozitive clare pentru C. chauvoei în PCR.

în cele mai multe cazuri clinice de blackleg cantitatea de C. chauvoei în țesutul infectat este ridicat și poate fi ușor detectat prin metoda PCR independent de flora contaminată. Mai mult, metoda PCR este mult mai rapidă decât metoda tradițională de detectare biochimică, care durează cel puțin cinci zile și este important să existe o cultură pură a tulpinii, care ar putea necesita timp suplimentar pentru Cultură. Pentru a evita contaminarea florei, țesutul muscular nu trebuie să fie prea mic; aproximativ 100-200 g ar fi adecvat. Fără cultură pură nu pot fi tulpini pentru studii ulterioare în viitor, ceea ce reprezintă un dezavantaj al utilizării detectării PCR ca singură metodă.

la bovinele infectate experimental cu C. chauvoei s-au efectuat analize PCR pe mușchi tocați și alte organe, iar C. chauvoei a fost detectat în toate organele testate . Bucățile musculare tocate din cazurile suspectate de picior negru au fost testate direct prin PCR și comparate cu cultura. Detectarea prin PCR a dat rezultate mai bune decât cultura și identificarea biochimică , ceea ce este în dezacord cu rezultatele din studiul de față în care doar 12% (3 din 24) din bucățile de sânge sau mușchi au fost peste pragul de detectare al PCR, în timp ce 9% din probele de suc de carne au fost peste pragul de detectare (Tabelul 2). Substanțele inhibitoare sunt probabil prezente în țesuturile musculare. Inhibitorii pentru reacția enzimatică a amplificării PCR au fost identificați în ficat, splină și rinichi și pot exista inhibitori similari prezenți în țesutul muscular. Rezultatele bucăților musculare macerate în probe sterile de ser fiziologic (26%) nu au corespuns bine cu cele ale testului biochimic. PCR Direct pe țesutul muscular sau alte probe similare nu este probabil potrivit pentru înlocuirea etapelor de cultură urmate de teste biochimice sau de PCR.

probe musculare colectate de tampoane

pentru a investiga dacă este necesar să se trimită țesut muscular pentru analiza C. chauvoei sau dacă este suficient să se utilizeze tampoane pentru colectarea probelor, a fost simulat un serviciu poștal. Din cele 22 de țesuturi musculare investigate, 64% au fost peste pragul de detecție al PCR. Pentru tampoanele din aceleași probe după simularea serviciului poștal, 36% până la 47% din tampoane au fost peste pragul de detecție (Tabelul 3). Ar fi mai practic să se preleveze probe cu tampoane în loc de țesuturi musculare dacă tampoanele sunt suficiente pentru analiza lui C. chauvoei. Cu toate acestea, țesuturile musculare au dat mai multe probe pozitive decât tampoanele atunci când ambele au fost analizate prin cultură și PCR (Tabelul 3). Incidența C. chauvoei asupra tampoanelor din cazurile de țesut muscular pozitiv părea a fi aleatorie. Cu toate acestea, se pare că nu are nicio diferență dacă tampoanele au fost păstrate timp de 1, 3 sau 6 zile.

probe din instalații de biogaz

Clostridium chauvoei a fost detectat în 3 probe din 11 în substratul de biogaz înainte de pasteurizare, dar nu a putut fi detectat după pasteurizare sau după digestie (Tabelul 4). Bacteriile din aceste tipuri de probe ar putea proveni din gunoi de grajd sau din subproduse de origine animală din abator, deoarece ambele surse sunt utilizate pentru producerea biogazului. Niciuna dintre fermele eșantionate în acest studiu nu își trimite gunoiul de grajd la instalațiile de biogaz din cauza distanței geografice, dar animalele sunt trimise la abatorul local. De asemenea, au fost raportate cazuri de picior negru în bazinul hidrografic al instalației de biogaz.

după prelucrarea biogazului, reziduurile digerate sunt utilizate ca îngrășământ. Bacteriile care formează spori pot supraviețui pasteurizării și digestiei în instalațiile de biogaz, iar reziduurile digerate din instalațiile de biogaz pot fi, prin urmare, capabile să răspândească piciorul negru în zone noi. Cu toate acestea, nu C. chauvoei a fost detectat în produsul procesat, astfel încât, probabil, mediul din digestor nu este potrivit pentru C. chauvoei, sau flora din digestor depășește C. chauvoei. Sporii clostridiali pot supraviețui perioade lungi de timp în sol , ceea ce trebuie luat în considerare în studiile ulterioare asupra C. chauvoei în digestor.

probe din ferme

în ciuda faptului că toate fermele investigate au raportat cazuri suspecte de blackleg în ultimii ani, toate probele din fecale, sol și siloz au dat rezultate negative pentru C. chauvoei. Ar putea exista mai multe explicații pentru acest lucru. Sporii ar putea fi încă prezenți în material, dar sub nivelul de detectare. Mai mult, inhibitorii PCR pot fi prezenți în probe și PCR poate fi împiedicat . Fecalele bovinelor conțin acizi grași volatili (VFA), iar probele de sol pot conține urme de metal, ambele fiind cunoscute ca interferând cu reacția PCR. Cu toate acestea, etapa de cultură înainte de PCR reduce influența substanțelor inhibitoare.

Din Moment Ce C. chauvoei este o bacterie din sol pot apărea unele variații sezoniere, de exemplu precipitațiile abundente pot contribui la răspândirea sporilor și cantitatea de spori din sol poate fi mai accesibilă bovinelor. Cea mai mare parte a eșantionării a fost efectuată la începutul toamnei, când vremea era însorită și, prin urmare, concentrația de spori din probe ar fi de așteptat să fie scăzută. Este posibil ca numărul de eșantioane să fi fost insuficient pentru detectarea contaminării mediului. Cu toate acestea, din motive practice, un număr foarte mare de eșantioane de mediu sunt rareori disponibile pe teren.

cazurile suspecte de picior negru în ferme au avut loc în principal la viței și juninci, dar o fermă a raportat un caz la o vacă adultă. Șapte din cele unsprezece ferme A-K aveau rutine de vaccinare în momentul prelevării de probe (Tabelul 1).

două dintre ferme au depozitat gunoi de grajd înainte de a se răspândi, iar celelalte nu, dar niciuna dintre ferme nu a răspândit gunoi de grajd pe pășuni. Medicii veterinari locali ar fi văzut mai multe cazuri de picior negru după defrișarea arbuștilor pe insula Centictland, în special pe Alvaret (o câmpie de calcar stearpă, lungă de aproape 40 km și lată de 10 km, cu floră specială în funcție de solul subțire și pH ridicat). Alvaret este de obicei folosit ca pășune de fermele vecine. Nu s-a făcut prea multă curățare a arbuștilor în anul prelevării de probe.

PCR

procedurile culturale sunt costisitoare și consumatoare de timp, iar contaminarea cu alte bacterii anaerobe care depășesc C. chauvoei cauzează frecvent probleme . Când se utilizează PCR, ADN-ul celulelor viabile și neviabile este amplificat. Dacă se detectează numai celule viabile, se poate aplica o etapă de îmbogățire . În acest studiu, cultura pe plăcile FAA înainte de PCR a fost utilizată pentru a evita detectarea bacteriilor neviabile și a reacțiilor PCR fals pozitive. ADN-ul este ușor de amplificat din culturi pure, dar apar probleme cu probele contaminate, cum ar fi probele din deșeuri biologice. Detectarea ADN-ului prin PCR poate fi împiedicată de numeroase substanțe, inclusiv acizi humici, VFA, grăsimi și proteine . Cu toate acestea, etapa de cultură înainte de PCR a fost utilizată ca etapă de îmbogățire și, prin urmare, reduce influența substanțelor inhibitoare. Datorită florei pline, nu s-a putut face nicio purificare de pe plăcile FAA.

pragul de detecție al metodei PCR

nivelul de detecție a fost de 200 cfu/g. Acest lucru poate părea a fi un nivel de detecție slab, dar poate fi explicat prin faptul că probele precum gunoiul de grajd, solul și substratul de biogaz sunt puternic contaminate de flora din jur. Sasaki a raportat un nivel de detecție de 10 cfu / g, aparent în probe mai curate. Cu toate acestea, deoarece nivelul de detecție în studiul nostru a fost de 200 cfu/g și deoarece se aștepta ca astfel de probe să conțină un număr redus de C. chauvoei. Astfel, metoda utilizată în studiul de față nu este practic aplicabilă.

aspecte de mediu

pragul de detecție al metodei PCR după precultură nu este adecvat în stadiul actual pentru a garanta că animalele nu sunt infectate sau pentru a determina starea pășunilor. În schimb, trebuie utilizate recomandările aplicate în prezent, deoarece metoda nu poate fi utilizată ca bază pentru rutinele de vaccinare. În zonele în care piciorul negru este endemic, se recomandă vaccinarea anuală înainte de pășunat, în ciuda costurilor și a timpului necesar.

acest studiu a dat unele indicii că C. chauvoei nu trece prin procesul de biogaz. Numărul de C. chauvoei în deșeurile biologice a scăzut probabil în digestor până sub pragul de detecție al metodei și riscul de răspândire a reziduurilor digerate este astfel neglijabil. Sunt necesare mai multe studii despre supraviețuirea clostridială prin procesul de biogaz înainte de a putea trage concluzii clare. Cu toate acestea, avantajele reziduurilor digerate ca îngrășământ depășesc probabil riscul de răspândire a piciorului negru.