diagnosticarea inflamației și infecției în sistemul urinar prin proteomică

surse de probă pentru evaluarea datelor proteomice urinare în scopuri de diagnosticare a urinei

colectarea a 120 de probe de urină profilate în acest studiu nu s-a limitat la diagnosticul, evaluarea progresiei sau tratamentul unei boli specifice. Analiza urinei (UA) a probelor a fost comandată de medicii participanți din diverse motive, inclusiv leziuni acute, sângerări vaginale, amețeli/greață, hiperlipidemie, diabet de tip II și complicații asociate, dureri abdominale/greață, hipertensiune nespecificată, hipertensiune vezicală, poliurie idiopatică și UTI suspectate. Deoarece UTI este o boală infecțioasă foarte răspândită legată de unele dintre simptomele clinice menționate mai sus (de exemplu, dureri abdominale/greață) și factori de risc (de exemplu, diabet), ne-am așteptat la diagnosticarea frecventă a bacteriuriei sau UTI de la aceste specimene. Analizele proteomice s-au limitat la specimene în care rapoartele de analiză urinară au oferit suport provizoriu pentru UTI cauzate de bacterii (vezi metode). Nu am analizat probele de urină în cazurile în care a fost pus la dispoziție diagnosticul specific de bacteriurie asimptomatică. Au fost obținute date extinse UA pentru toate cele 120 de probe. Aceasta a inclus teste de jojă, examinarea microscopică a sedimentelor urinare pentru diferite tipuri de celule și mucus și – în 46% din cazuri – date despre cultura urinei (UC). Datele privind aspectul urinei, cum ar fi turbiditatea, culoarea și culoarea și volumul peletelor de urină au fost, de asemenea, revizuite. Rezultatele analizei urinei au permis o comparație cuprinzătoare a metodelor convenționale de diagnosticare a bolilor tractului urinar cu datele din anchetele metaproteomice (fișier suplimentar 3: tabelul A3).

neutrofilele, efectorii dominanți ai răspunsurilor imune înnăscute în tractul urinar, reprezintă niveluri ridicate de inflamație în multe probe

datele Proteomice au dat dovezi puternice pentru rolul important al neutrofilelor ca efectori și mesageri ai inflamației în tractul urinar. Neutrofilele eliberează molecule antimicrobiene și inflamatorii din granulele secretoare pe care le produc și ucid agenți patogeni invadatori în fagolizozomi după fagocitoza lor. O analiză ierarhică de grupare optimizată pentru ordinea frunzelor de probă (HCLSO) a identificat patru grupuri de probe cu profiluri de abundență de proteine umane dominate de neutrofile (23 din 111 cazuri; clustere NAD1 în Figura 1) și două clustere cu cantități de proteine specifice neutrofilelor comparabile cu cele asociate cu citoscheletul (25 cazuri; clustere NAD2 în Figura 1). Proteinele citoscheletice sunt foarte exprimate în celulele epiteliale care acoperă tractul urogenital și alcătuiesc majoritatea proteomului sedimentului urinar în absența condițiilor fiziopatologice din tractul urinar. Treizeci și cinci din cele 48 de profiluri ale clusterului NAD au fost pozitive pentru ID-urile unui uropatogen, inclusiv G. vaginalis, indicând faptul că un motiv dominant pentru inflamație la pacienții respectivi a fost bacteriuria și un răspuns imun față de microbii invadatori. Motivul distanțelor dintre clusterele NAD din arborele de legătură a fost variația considerabilă a numărului de proteine umane identificate, variind de la 200 la 1.500 ID-uri pe eșantion.

analiza ierarhică de grupare a profilelor proteomice ale peletelor urinare pentru 110 probe. Gruparea ierarhică a fost efectuată pe seturi de date cantitative de proteine umane folosind metoda TPA în software-ul MaxQuant. Seturile de date au fost supuse analizei de corelație Pearson cu optimizarea ordinii frunzelor de probă și gruparea completă a legăturilor folosind instrumentul software MeV . Am eliminat harta de căldură a abundenței de proteine din arborele ierarhic afișat al probelor UP. Partea inferioară a panoului din partea stângă se conectează la partea superioară a panoului din partea dreaptă, deoarece se referă la legăturile arborelui. Numele clusterului de eșantioane, afișate în extrema dreaptă a graficului cu acronimele lor, sunt discutate în detaliu în text. Barele colorate indică tipul, dimensiunea și poziția fiecărui grup de eșantioane din arbore.

abundențele proteinelor neutrofile derivate din datele proteomice se corelează bine cu activitățile LE și numărul leucocitelor

o motivație cheie pentru acest studiu a fost determinarea modului în care datele proteomice derivate din sedimentele urinare comparativ cu testele convenționale pentru a cuantifica nivelurile de inflamație în probele de urină. Am determinat cantitățile de 35 de proteine cunoscute a fi foarte exprimate în neutrofile activate (fișier suplimentar 2: Tabelul A2) în raport cu abundența totală de proteine pentru fiecare probă UP, așa cum se arată în segmentele cu bare albastre ale graficului afișat în Figura 2. Nu în mod neașteptat, 85% la sută din cazurile aparținând clusterelor NAD1 menționate mai sus au fost în secțiunea graficului cu un conținut de proteine neutrofile mai mare de 30% (pe partea stângă). Cele 35 de proteine au inclus cinci grupe funcționale: proteinele familiei S100 care leagă calciul S100-A8, S100-A9 și S100-A12 care contribuie cu 40-50% din conținutul total de proteine citosolice din neutrofile; proteine eliberate în timpul inflamației din granulele neutrofile, inclusiv mieloperoxidază (MPO), catepsină G (CTSG), defensin-1 (DEFA1), elastază (elan), lizozom (LYZ), lactotransferină (LTF) și cathelicidină (CAMP) ; proteine implicate în formarea, traficul și fuziunea granulelor cu fagolizozomi, inclusiv grancalcin (GCA), plastin-2 (LCP1), anexină A3 (ANXA3), și tetraspanină (antigen cd63); proteine care influențează migrarea neutrofilelor în mediul unei matrice extracelulare REORGANIZATOARE, cum ar fi integrina am/INKT2, gelatinaza (MMP9) și colagenaza neutrofilă (mmp8); și NADPH oxidaza, o enzimă cu subunități multiple, inclusiv citocromul b-245 (CYBA, Figura 3) situată în membrana fagolizozomilor celulelor fagocitare și responsabilă de explozia oxidativă care ucide direct agenții patogeni. Multe dintre aceste proteine, în special defensina-1, au fost foarte abundente în probe cu dovezi de UTI (de exemplu, SA_112 și PM_20, Figura 3). Agenții patogeni bacterieni în cele două cazuri au fost S. aureus (SA) și P. mirabilis (PM) și, nu în mod neașteptat, au fost localizați pe partea stângă în graficul din Figura 2 și adiacenți unul altuia într-un cluster NAD1 (Figura 1). Recunoaștem că aceste date Reflectă cantități aproximative de neutrofile având în vedere faptul că proteine precum defensin-1, LTF, S100-A8 și S100-A9 sunt, de asemenea, eliberate în tractul urinar de către celulele uroteliale. Cu toate acestea, analiza ierarhică de grupare optimizată pentru ordinea frunzelor proteice (HCLPO) a arătat că aceste proteine s-au grupat între ele, susținând noțiunea de rol dominant al neutrofilelor în producția lor (fișier suplimentar 4: Figura A1). Peroxidaza eozinofilă (EPX) și proteina cationică eozinofilă (ECP), ambele fiind, de asemenea, efectoare ale răspunsului față de agenții patogeni, au fost un ordin de mărime mai puțin abundent decât proteinele derivate din neutrofile, nefiind astfel un rol major al eozinofilelor în răspunsul inflamator. Factorul inhibitor al migrației specifice macrofagelor (MIF) a fost prezent în cantități și mai mici, sugerând aproape absența macrofagelor ca participanți la răspunsurile imune acute în urma invaziei patogene în tractul urinar.

profiluri proteice care prezintă contribuții cantitative ale neutrofilelor, sistemului complementar și eritrocitelor la proteomul total al probelor de pelete urinare. Graficul afișează abundențele proteice însumate, în raport cu proteomul total, pentru trei categorii biologice de proteine. Axa x enumeră identificatorii probelor UP asociate cu 110 subiecți umani. Cele trei categorii reprezintă proteine produse de neutrofile activate (albastru), proteine foarte exprimate în eritrocite și eliberate la leziuni vasculare (verde) și proteine asociate cu activitatea sistemului complementar și coagularea (roșu). Metoda utilizată pentru cuantificarea tuturor proteinelor este metoda iBAQ în instrumentul software MaxQuant. Ordinea probelor se bazează pe abundența proteinelor neutrofile, scăzând de la stânga la dreapta. Pentru a permite comparații directe pentru evaluarea inflamației, scorul pentru testul LE a fost inclus în graficul de deasupra fiecărei bare reprezentând un eșantion. Sub axa x, o bară suplimentară descrie probele care au fost asociate cu ID-ul unui agent patogen care provoacă UTI (segmente de culoare portocalie), bacterii comensale (segmente de culoare verde) sau lipsa ID-urilor bacteriene (fără culoare).

abundența proteinelor neutrofile selectate în probele UP. Treisprezece proteine enumerate în legenda din extrema dreaptă sunt proteine de granule neutrofile. Alte trei proteine sunt fibrinogenul-XV (FGB; implicat în coagulare), hemoglobina-subunitate (hba1; și uromodulină (UMOD; abundent în urină de donatori sănătoși). Probele SA_112 și PM_20 au reprezentat itu cauzate de S. aureus (SA) și, respectiv, de P. mirabilis (PM). Profilul LG_23 (Lactobacillus) a indicat lipsa inflamației și a reprezentat colonizarea uretrală, posibil și contaminarea vaginală minoră a probei de urină. KP_10 (K. pneumoniae) părea să reprezinte o infecție vaginală, deoarece sângerarea vaginală a fost diagnosticată clinic pentru pacient. Profilurile proteice ale EC_13 (UPEC) și KP_55 au sugerat aproape absența inflamației și, prin urmare, cel mai probabil colonizarea uretrală. Proteinele au fost cuantificate folosind metoda iBAQ, în fiecare caz împărțite la valorile iBAQ însumate pentru întregul proteom UP.

scor NAD

reprezentarea cantităților de proteine neutrofile în graficul din Figura 2 este derivată din scorurile NAD (activare și degranulare a neutrofilelor) furnizate și în (fișier suplimentar 3: tabelul A3). Figura 2 include scoruri LE variind de la negativ (N) la trace (T), 1, 2 și 3 pentru fiecare eșantion. În general, se observă o corelație puternică între abundența proteinelor neutrofile și scorurile LE. Scorul LE măsoară activitatea esterazei leucocitare, reprezentând probabil în principal elastaza (elan) și mieloblastina (PRTN3), două proteaze neutrofile cuantificate pentru opt probe în Figura 3. Toate profilurile din partea stângă a graficului (Figura 2) și cincizeci și trei din cele 60 de probe cu conținut de proteine neutrofile mai mare de 30% (iBAQ) au avut scoruri LE de 2 sau 3. Douăzeci și nouă din cele 40 de probe cu mai puțin de 23% (iBAQ) conținut de proteine neutrofile au avut scoruri LE variind de la negativ la 1. În doar patru din unsprezece cazuri în care scorul LE a fost de 2, dar conținutul de proteine neutrofile a fost relativ scăzut, numărul microscopic de leucocite a fost mai mare de 11 celule pe câmp de putere mare (HPF), un prag utilizat pentru a defini pyuria. În general, a existat un acord ușor mai mic în comparația numărului de leucocite care stabilește pragul La 11 celule / HPF cu un conținut de proteine neutrofile mai mare de 30% (iBAQ): 14 din cele 60 de cazuri au avut un număr de 10 (fișier suplimentar 3: Tabelul A3). Pe scurt, evaluarea conținutului de neutrofile din sedimentele urinare prin proteomică pare a fi cel puțin la fel de precisă ca testul LE pentru a diagnostica inflamația în tractul urinar. Acesta măsoară suma abundențelor a 35 de proteine îmbogățite în neutrofile și poate fi mai puțin susceptibilă la rezultate fals pozitive în comparație cu testul LE.

abundența conținutului de proteine eritrocitare servește ca indicator de diagnostic al leziunilor vasculare

leziunile vasculare la nivelul tractului urinar, asociate de obicei cu inflamația, sunt evaluate cu teste de jojă pentru hemoglobină și numărarea microscopică a globulelor roșii din sânge în analiza convențională a urinei. Având în vedere îmbogățirea ridicată a proteinelor distincte în eritrocite, am reușit să dezvoltăm o abordare proteomică echivalentă cu testele convenționale pentru hematurie. S-au determinat abundențe însumate de 32 de proteine ale celulelor roșii din sânge, inclusiv subunități de hemoglobină, proteine de transport anionice de bandă 3, proteine membranare integrale de bandă 7 și anhidrază carbonică-1, în raport cu conținutul total de proteine din fiecare probă UP, prezentate de segmentele barei verzi ale graficului afișat în Figura 2. Aceste cantități de proteine sunt enumerate ca scoruri ERY în (fișier suplimentar 3: tabelul A3) pentru fiecare probă. Nu a existat nicio dovadă a unei corelații bune fie a scorurilor NAD, fie a rezultatelor testului LE cu scorurile ERY, sugerând că, chiar și în cazurile de detectare a unui agent patogen (arătat prin colorarea barei orizontale din partea de jos a parcelei din Figura 2), infiltrarea neutrofilelor din tractul urinar nu implică întotdeauna hematurie semnificativă și leziuni tisulare. Stabilirea pragurilor pentru hematurie la 2 + pentru testul jojei și 4,5% pentru scorul ERY, a existat un acord între 81% din toate cazurile. Pentru cele 21 de cazuri în care scorurile nu au fost de acord, au fost evaluate numărul microscopic de globule roșii. Folosind un număr mai mare de 10 celule pe câmp de putere mare (HPF) ca dovadă a hematuriei, am constatat că în două treimi din cazuri analiza microscopică a fost în acord cu datele proteomice. Concluzionăm că scorurile proteomice ERY oferă o bună estimare cantitativă a hematuriei în urină.

probe de urină îmbogățite în proteine implicate în activitățile complementului și coagulare

am observat că analiza HCLPO aplicată tuturor profilurilor proteomice urinare a grupat 21 de proteine cu roluri funcționale în căile de coagulare și / sau în sistemul complementului (fișier suplimentar 4: Figura A1). Motivul pentru măsurarea abundențelor proteice legate de aceste căi inflamatorii în comun s-a bazat, de asemenea, pe rapoarte de interacțiuni funcționale extinse . Am identificat 42 de proteine asociate cu activitățile sistemului complementar și coagularea (CAC) ale căror abundențe însumate sunt incluse ca scor CAC pentru fiecare probă UP în (fișier suplimentar 3: tabelul A3). Sistemul complementar contribuie la răspunsul în fază acută și imunitatea înnăscută, iar componentele distincte sunt pro – sau antiinflamatorii. O componentă centrală este componenta complementului C3. C3 se maturizează în opsonina C3b și anafilatoxina C3A și este secretată în plasma sanguină și în tractul urinar în urma producției în celulele tubulare renale . C3 joacă un rol în infecția tractului urinar superior și în absorbția și calmarea UPEC în celulele uroepiteliale posibil asociate cu problema clinică a ITU recurente . Chiar dacă cantitățile de proteine legate de activitățile de completare și coagulare nu au fost la fel de mari proteine neutrofile, analiza HCLSO a generat două grupuri de probe, adiacente în arbore și cu un număr total de 12 probe, caracterizate printr-o abundență relativ mare de astfel de proteine (clusterele CAC din Figura 1). Clusterele CAC au evidențiat un număr redus de cazuri cu un ID pentru un agent patogen (3 din 12). Scorurile CAC au fost reprezentate în Figura 2 reprezentate de segmentele de bare roșii ale fiecărui eșantion (coloană). Cantitățile totale mari de proteine CAC nu s-au corelat bine cu cantitățile mari de proteine neutrofile, ceea ce sugerează că activitățile inflamatorii mediate de sistemul complementar (de exemplu, C3 și C4) și coagularea (de exemplu, fibrinogenul) pot fi reglate separat la invazia patogenilor sau la alte tensiuni la care a fost expus tractul urinar la pacienți. Cantitățile mari de proteine CAC și ERY au fost observate mai frecvent în tandem. Multe proteine de coagulare și complement sunt într-adevăr abundente în plasma sanguină. Acest fluid corporal se scurge în lumenul tractului urinar la leziuni vasculare. Testele de analiză a urinei echivalente cu măsurarea scorurilor CAC sunt rareori utilizate în laboratoarele clinice.

precipitarea sărurilor acidului uric și a profilurilor proteomice asociate sedimentelor urinare

inspecția vizuală a celor 12 probe UP din grupurile CAC a arătat că nouă probe de urină au fost foarte tulbure și zece pelete de urină relativ mari, cu o culoare roz-maro deschis. Aceste caracteristici au fost legate de niveluri ridicate de saturație a acidului uric și precipitarea sărurilor de acid uric, în special la un pH sub 6, în urină. Precipitarea acidului uric poate fi o stare precursoare a formării pietrelor urinare . Este rezonabil să presupunem că aparițiile tulburi ale probelor au contribuit la identificarea greșită a precipitatelor ca bacterii în timpul microscopiei. A fost disponibilă o singură înregistrare clinică care a raportat apariția pietrelor la rinichi (GV_64). Deși profilul proteomic pentru acest pacient nu a făcut parte din clusterul CAC, caracteristicile vizuale ale eșantionului au indicat, de asemenea, turbiditate și o culoare de pelete de urină roz până la maro deschis. Presupunem că proteinele relativ abundente în fracțiunea solubilă a urinei se leagă de precipitatele de sare și, prin urmare, contribuie la modele distincte de abundență de proteine în probele UP respective. Într-adevăr, proteinele în general solubile în urină și, în mod normal, cu abundență scăzută în peletele urinare au fost crescute din abundență în unele probe de cluster CAC în raport cu un control fără dovezi de UTI și precipitate de sare (LG_21). Exemple de astfel de proteine sunt IgG-lanț, AMBP (bikunin) și fibrinogen-lanț, așa cum se arată în Figura 4. Proteinele defensin-1 și subunitățile HBA1 și HBD ale hemoglobinei au fost cel mai puternic crescute din abundență în comparație cu datele pentru LG_21. Deși majoritatea proteinelor prezentate în Figura 4 sunt cunoscute a fi crescute în urină și plasmă ca o consecință a leziunilor locale și contribuie la răspunsul în fază acută, aceste date au arătat o variabilitate cantitativă ridicată. Semnificația patologică, în special vătămarea tractului urinar, nu poate fi dedusă din aceste date. Profilele proteomice au fost raportate recent pentru matricea de piatră urinară . Printre proteinele cele mai frecvent observate în matricea de piatră au fost lanțurile grele IgG, subunitățile fibrinogene, S100-A8, lizozima C și LTF, proteine prezentate și în graficul din Figura 4. Sunt necesare investigații suplimentare pentru a evalua valoarea analizei proteomice pentru a identifica biomarkerii din probele de urină care conțin precipitate de sare de urină, de exemplu pentru a evalua riscul formării de pietre la rinichi.

abundența proteinelor selectate în probe cu dovezi de precipitare a sării în urină. Probele care încep cu nm_ (fără microbi) nu au prezentat dovezi de colonizare bacteriană, dar sedimentele urinare au avut un aspect vizual sugerând precipitarea sării acidului uric și au fost prezente în două clustere CAC. LG_21 (Lactobacillus) a reprezentat absența inflamației. Pacientul asociat cu proba GV_64 (G. vaginalis) a fost diagnosticat cu pietre la rinichi. În plus față de acele proteine descrise în legenda din Figura 3, altele sunt componenta complementară C3 (C3), ceruloplasmina (CP), inhibitorul activatorului de plasminogen-3 (PAI-3), AMBP (bikunin), hemoglobina subunitate-subunitate (HBD) și imunoglobulină-lanț (IG gamma). Toate aceste proteine sunt implicate în răspunsul de fază acută, care este de obicei inițiat de leziuni tisulare și invazie patogenă. Profilurile eșantionului prezintă o variabilitate ridicată a cantităților de proteine, deși proteinele distincte de fază acută au fost crescute în comparație cu LG_21 de control în unele dintre probe.

colonizarea uretrală prin bacterii comensale care nu provoacă răspunsuri imune gazdă

tehnologiile de secvențiere a ADN-ului foarte paralele au arătat că urina nu este complet sterilă, iar noțiunea de microbiom urinar a evoluat ca un subiect de cercetare interesant . Este probabil ca părțile externe ale uretrei, în special la femei, să fie colonizate cu bacterii din surse perineale și vaginale. De asemenea, este evident că colectarea suboptimă de urină curată de la pacienții de sex feminin poate duce la contaminarea urinei cu proteine și bacterii comensale din cavitatea vaginală. Datele prezentate aici pot fi explicate prin, dar nu disting cele două scenarii menționate mai sus. Aproximativ 25% din profilurile proteomilor urinari obținute în acest studiu au fost îmbogățite pentru proteinele secretate în urină într-un mediu fiziologic normal (de exemplu, uromodulină și citokeratine) sau produse abundent de celulele epiteliale vărsate de suprafețele mucoasei care acoperă tractul urinar și vaginal. Analiza HCLSO a identificat patru grupuri (Figura 1), un grup mare cu 15 eșantioane UP, derivate de la pacienți de sex feminin cu doar două excepții. Profilurile au evidențiat o abundență mare de proteine citoscheletice (de exemplu, actine și anexine), proteine desmosomale (de exemplu, desmoplakin și periplakin) și proteine învelitoare celulare cornificate (de exemplu, citokeratine, cornulină și proteine mici bogate în prolină 3). Proteinele aparținând primelor două categorii sunt prezente în majoritatea tipurilor de celule , inclusiv celulele uroteliale, în timp ce epiteliul scuamos stratificat situat în meatul uretral și tractul vaginal produce proteine din toate aceste categorii din abundență . Examinarea microscopică a sedimentelor urinare a confirmat creșterea conținutului de celule epiteliale scuamoase cu scoruri de 2 + pentru majoritatea probelor prezente în cele patru clustere (fișier suplimentar 3: tabelul A3), denumite uromodulină și clustere de celule epiteliale scuamoase cu bacterii vaginale (USEV) de aici înainte. Uromodulina , o proteină care contribuie la echilibrul apă/electrolit în tractul urinar, a fost, de asemenea, abundentă în probele clusterului USEV. Bacteriile vaginale (Lactobacillus și G. vaginalis) au fost identificate din 22 din 30 de probe, iar bacteriile au fost absente în 5 dintre aceste probe. Datele proteomice au confirmat un nivel foarte scăzut de inflamație pentru clusterele USEV în 74% din cazuri conform scorurilor NAD, așa cum este evident din pozițiile probelor din graficul din Figura 2. Un profil reprezentativ al clusterului USEV este LG-23, cu un scor NAD de 20% și abundențe scăzute de proteine asociate inflamației, cu excepția defensinei-1 și S100A8 (Figura 3). Comparativ cu profilurile pentru SA_112 și PM_20, toate proteinele care contribuie la inflamație au fost mai puțin abundente în LG_23. G. vaginalis poate fi un agent patogen oportunist în tractul urinar și vaginal. Gruparea profilurilor proteice gazdă în grupurile USEV, selectate pentru ID-urile Lactobacillus, G. vaginalis sau ambele specii, a indicat lipsa unui răspuns imun puternic față de aceste specii bacteriene. Concluzionăm că analiza proteomică are valoare diagnostică prin furnizarea de dovezi ale absenței unei infecții în tractul urogenital al femeilor.

colonizarea uretrei de către agenți patogeni oportuniști

clusterele USEV au inclus trei cazuri în care au fost identificați agenți patogeni comuni ai tractului urinar, UPEC și K. pneumoniae. Cele două cazuri (EC_13 și KP_55) au prezentat scoruri nad și ERY scăzute, ceea ce a fost în concordanță cu absența inflamației declanșate de neutrofile și a leziunilor vasculare. Abundențele relative ale proteinelor prezentate în Figura 3 pentru aceste două cazuri și similitudinea lor cu modelul observat pentru LG_23 au susținut ideea că răspunsurile imune caracteristice UTI nu au fost provocate la colonizarea de către bacterii. Dacă cazurile reprezintă bacteriurie asimptomatică (ASB) nu poate fi evaluată din cauza lipsei de cunoștințe privind răspunsurile imune la nivel molecular pentru ASB. În rezumat, aceste date susțin ideea că profilurile proteomice pot identifica cazurile de colonizare uretrală de către uropatogeni fără activarea sistemului imunitar înnăscut.

contaminare vaginală cu dovezi de infecții urogenitale

analiza HCLSO a generat un grup de eșantioane UP pe care l-am numit cluster de contaminare vaginală (VCO), prezentat în Figura 1. Profilurile clusterului VCO au prezentat abundențe mari de proteine citoscheletice, desmosomale și înveliș celular cornificat, dar cantități scăzute sau moderate de uromodulină, sugerând că conținutul de proteine vaginale a fost crescut în aceste probe. S-a calculat scorul VCO, un raport cantitativ de cinci proteine exprimat în țesutul epitelial cervicovaginal cu specificitate relativ ridicată conform bazei de date TiGER comparativ cu uromodulina. Aceste proteine au fost cornifelin, cornulin, serpin B3, galectin-7 și proteoglican mucin-5B. Moleculele proinflamatorii specifice neutrofilelor, cum ar fi proteina S100-A12 și lizozima (LYZ) și proteinele care indică sau răspund la leziuni vasculare (HBA1 și, respectiv, fibrinogenul-XV) au fost mai abundente în grupul VCO comparativ cu grupul USEv, așa cum se arată pentru KP_10 în comparație cu LG_23 în Figura 3. Clusterul VCO conținea 14 probe, toate cu excepția unuia derivat de la pacienți de sex feminin, dintre care jumătate au fost asociate cu un ID pentru un uropatogen. În cinci probe, a fost identificat G. vaginalis sau Lactobacillus. Dovezile clinice au sugerat sângerări vaginale pentru pacient referitoare la eșantionul KP_10, susținând diagnosticul unei infecții urogenitale sau vaginale cu K. pneumoniae. Scorurile VCO sunt incluse în fișierul suplimentar 3: tabelul A3. Un test Wilcoxon rank sum comparând scorurile VCO ale clusterelor VCO și USEV a dat o valoare p de 0,017, sugerând că Scorul este util pentru a discerne no sau minor de contaminarea vaginală majoră în probele de urină. Nu se pot face evaluări clare cu privire la utilitatea scorului VCO pentru a distinge o UTI de infecția vaginală.

analiza proteomică a sedimentelor urinare identifică microbii cu niveluri de sensibilitate și specificitate comparabile cu cele ale uroculturii

am identificat bacterii din 76 de probe UP și Candida albicans dintr-o probă UP (63% din toate cazurile analizate). Culturile de urină au fost efectuate în doar 55 de cazuri, dintre care 44% au identificat cel puțin un agent patogen, 24% organisme comensale și 17% nu au prezentat creștere microbiană (fișier suplimentar 3: tabelul A3). În contextul identificării agenților patogeni, datele proteomice și rezultatele UC nu au fost întotdeauna în acord (Tabelul 1). Mai multe motive par să contribuie la dezacorduri. Urmează provocările interpretării datelor metaproteomice pe baza proteinelor microbiene identificate. În primul rând, ID-urile proteice pentru uropatogeni mai puțin obișnuiți pot fi ratate din cauza absenței secvențelor lor de proteine din Baza de date căutată. Speciile bacteriene reprezentate în baza de date au fost identificate prin analize proteomice (K. pneumoniae și E. faecalis) în două cazuri, dar datele UC au sugerat prezența speciilor apropiate filogenetic Enterobacter aerogenes și, respectiv, E. faecium. În al doilea rând, organismele microbiene prezente în abundență scăzută în urină sunt mai dificil de identificat în prezența microbilor foarte abundenți, mai ales dacă speciile microbiene împărtășesc o identitate extinsă a secvenței între proteinele ortologice. Profilurile EC_85 și KP_11 din (fișierul suplimentar 5: setul de date A1) ilustrează această problemă și, în special, se referă la familia Enterobacteriaceae care provoacă majoritatea tuturor UTI. Adnotări genomice inexacte, de ex. genele lipsă, pentru o specie (prezentă în proba UP) au ca rezultat identificarea proteinelor ortologe corect adnotate în genomul unei specii înrudite (dar absente în proba UP). Peptidele Triptice mici sunt identificate într-o analiză proteomică a puștii, ceea ce face ca atribuirea incorectă a proteinelor de către algoritmul de căutare să fie mai probabilă în cazurile de identitate foarte secvențială. În al treilea rând, ID-ul bacteriilor prezente în număr scăzut în urină, mai mic de ~ 10.000 celule/mL, combinat cu un fond proteomic gazdă ridicat poate fi ratat, deoarece proteinele gazdă și microbiene nu sunt examinate separat de LC-MS/MS.numărul scăzut de CFU pentru organismele bacteriene conform datelor UC a arătat o rată de potrivire mai mică cu ID-uri proteomice decât numărul ridicat de CFU (fișier suplimentar 3: tabelul A3). În schimb, identificările proteomice ale microbilor au avantajele că sunt independente de cultură și că oferă informații despre virulență, rezistența la antibiotice, stresul întâlnit și starea de creștere pentru agenții patogeni identificați. Două exemple care dezvăluie astfel de date complete sunt furnizate în (fișierul suplimentar 5: setul de date A1). Într-un set de date (EC_85), proteinele UPEC, G. vaginalis și Lactobacillus au fost profilate. În celălalt set de date (KP_11), cauza UTI a fost K. pneumoniae. Tabelul 1 oferă o imagine de ansamblu a comparației testului nitrit, identificând Enterobacteriaceae în urină pe baza capacității lor de a reduce nitrații și rezultatele UC cu datele proteomice. 90% din testele de nitriți pozitivi s-au referit într-adevăr la cazuri de bacteriurie cu UPEC sau K. pneumoniae ca agent cauzator și au fost identificate invariabil și cu metodele proteomice și UC. Spre deosebire de analiza proteomică, testele de nitriți par să nu fie suficient de sensibile pentru a identifica Enterobacteriaceae în zece cazuri. Testele cu nitriți nu au fost pozitive în 21 de cazuri în care ID-ul din analizele proteomice a fost G. vaginalis. În ceea ce privește diferențele dintre ID-urile patogene prin metode proteomice versus UC, streptococii hemolitici de tip XV au fost identificați prin experimente UC în trei cazuri, în timp ce datele proteomice au sugerat prezența G. vaginalis. După cum se arată în tabelul 1, numărul ID-urilor potrivite pentru UPEC și, într-o măsură mai mică, pentru K. pneumoniae, a fost ridicat. În rezumat, metoda proteomică a demonstrat o sensibilitate mai mare decât testul nitrit și niveluri de sensibilitate și specificitate comparabile cu UC. Fundalul proteomic al gazdei ridicate într-o probă de urină scade sensibilitatea pentru identificarea microbiană.