direcționarea anticorpilor claudin-1 ca terapie potențială a cancerului colorectal

probe CRC

pentru profilarea expresiei genetice, am selectat 143 de probe tumorale de la 143 de pacienți incluși în trei cohorte: studiul prospectiv cu un singur centru REGP (19 pacienți) (GSE62322) , studiul retrospectiv studiul centru cosival (68 pacienți) și studiul prospectiv multicentric biocolon (56 pacienți) (Gse62080 și gse72970) . Pentru aceste trei studii, criteriile de includere au fost: adenocarcinom de colon dovedit histologic, tumoră avansată și măsurabilă bidimensional (stadiul IV), vârsta cuprinsă între 18 și 75 de ani și starea de performanță a Organizației Mondiale a Sănătății (OMS) 2. Înainte de orice tratament, toți pacienții au suferit o intervenție chirurgicală pentru rezecția tumorii primare sau biopsia endoscopică.

pentru analiza western blot, au fost utilizate 13 probe tumorale suplimentare din studiul prospectiv cu un singur centru REGP, dar care nu au fost incluse în cele 143 de probe.

pentru analiza imunohistochimiei, probele de țesut de la 52 de pacienți suplimentari cu CRC au fost selectate retrospectiv de la Institutul de cercetare a Cancerului din fișierele de patologie Montpellier numai atunci când au fost disponibile probe normale de mucoasă, adenom și adenocarcinom pentru același pacient.

toate studiile care au folosit probe de țesut uman au fost aprobate de comitetele de etică relevante și toți participanții au fost informați cu privire la obiectivele și metodele studiului și au semnat un consimțământ scris informat înainte de înscriere.

analiza expresiei genetice

probe de Colon (probe normale de colon, tumori primare și metastaze hepatice pentru studiul REG/P, dar numai probe tumorale primare pentru studiile COSIVALE și BIOCOLON) au fost colectate la momentul intervenției chirurgicale în urma unei proceduri standardizate pentru obținerea ARN de înaltă calitate . Probele au fost apoi hibridizate la genomul uman u133 Plus 2.0 matrice (Affymetrix Inc. Santa Clara, CA).

pentru a identifica noi ținte terapeutice pentru terapia pe bază de anticorpi în mCRC, am comparat profilurile de Expresie genică ale mucoasei normale (n = 17), tumorii primare (n = 20) și metastazelor hepatice (n = 19) probe de țesut.

deoarece eterogenitatea CRC trebuie luată în considerare la compararea profilurilor de expresie genetică, probele tumorale primare (n = 143) au fost clasificate folosind clasificările moleculare CRC bazate pe profiluri de expresie genetică care au fost propuse de trei grupuri independente și clasificarea recentă a consensului . Pe scurt, de Sousa E. Melo și colab. propus să grupeze tumori în trei clase: CCS1 (CRC cu instabilitate microsatelită, MSI), CCS2 (cancer cu instabilitate cromozomială, CIN) și CCS3 (Subtip nou) . Sadanandam și colab. au identificat cinci subtipuri moleculare, bazate pe fenotipul celular: Caliciformă, amplificare de tranzit (TA), enterocite, asemănătoare tulpinii și inflamatorii . Marisa și colab. s-au descris șase subtipuri moleculare (C1 până la C6) cu următoarele caracteristici principale: C1 = CIN și reglarea descendentă a căilor imune, C2 = MSI, C3 = KRAS mutant, C4 = fenotip de celule stem, C5 = CIN și reglarea ascendentă a căilor WNT și C6 = CIN și profil de Expresie genică de tip normal . În cele din urmă, pornind de la șase semnături publicate anterior, un consorțiu internațional a prezentat o clasificare cu patru subtipuri de consens: MSI (CMS1), canonic (CMS2), metabolic (CMS3) și mezenchimal (CMS4) (pentru revizuire ). Distribuția eșantionului CRC în funcție de subtipul molecular este prezentată în fișierul suplimentar 1: Tabelul S1.

analiza imunohistochimică

probele au fost asamblate într-o micro-matrice de țesut (TMA) folosind trei nuclee de țesut (0,6 mm diametru fiecare) așa cum s-a descris anterior . Pe scurt, secțiunile de 3-centimm ale TMA au fost deparafinizate și rehidratate în alcooli gradați. Recuperarea antigenului indusă de căldură s-a efectuat prin incubarea secțiunilor TMA în tampon EDTA (pH 9) la 98 de centicc într-o baie de apă timp de 20 min. După neutralizarea activității peroxidazei endogene, secțiunile TMA au fost incubate cu un anticorp policlonal anti-CLDN1 (JAY-8, zymed laboratories Inc, CA, SUA) sau diluant de anticorpi (Dako, Glostrup, Danemarca) singur timp de 60 de minute. Legarea primară a anticorpilor a fost vizualizată cu ajutorul sistemului Envision XV și al Autostainerului Dako (Dako, Glostrup, Danemarca). Procentul de celule CLDN1-pozitive și intensitatea colorării (0, fără colorare; 1, gălbui; 2, maro; și 3, maro închis) au fost evaluate pentru fiecare spot TMA individual.

analiza Western blot

probele de țesut tumoral de la pacienți au fost măcinate direct în tampon de liză (150 mm Naci, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 2 mm PMSF, 100 mm NaF, 10 mM ortovanadat de sodiu, un comprimat 10 ml) cu ajutorul unui mixer mill de 300 mm (QIAGEN, Valencia, ca). Concentrația de proteine a fost determinată cu testul Bradford(testul Pierce Coomassie Plus Protein). Apoi, 50% din proteinele totale au fost rezolvate cu 12% SDS-PAGE și transferate pe membrane de nitroceluloză (Whatman XCT Protran xtct, dimensiunea porilor 0,45 xtct). Locurile de legare nespecifice au fost blocate cu lapte degresat de 5% (wt/vol) în PBS cu 0,1% (vol/vol) între 20 (PBS-T) la temperatura camerei timp de 1 oră și apoi membranele au fost incubate la 4 centicc cu un anticorp policlonal anti-CLDN1 (JAY-8) peste noapte. Membranele au fost apoi spălate și incubate cu anticorpul secundar conjugat cu peroxidază de hrean adecvat timp de 1 oră. revelația a fost efectuată cu un sistem de chemiluminescență (Amersham Biosciences); expresia tubulinei a fost utilizată pentru normalizare.

extracția proteinelor subcelulare

extracția proteinelor a fost efectuată conform descrierii anterioare . Pentru fiecare probă s-au tăiat secțiuni cu grosimea de 20 de centimetri cu un criotom, amestecate în azot lichid și măcinate ușor cu un micro-pistil. Pentru extracția proteinelor subcelulare, Trusa de extracție a Proteomilor Subcelulari ProteoExtract a fost utilizată conform instrucțiunilor producătorului (Calbiochem). Fracțiile subcelulare (10 hectog/fiecare) au fost încărcate pe 12% geluri SDS-PAGE. Imunoblotting-ul s-a făcut așa cum s-a descris mai sus cu următorii anticorpi primari: anti-CLDN1 (JAY-8),-CD71 (Invitrogen), – Histona H3 (Pierce) și-XV-tubulină (Sigma T4026).

linii celulare

au fost utilizate următoarele linii celulare CRC umane: SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (un cadou de la C. Montagut, Departamentul de Oncologie Medicală, spitalul del Mar, Barcelona, Spania), HCT116 (CCL-247) și ls174t (atcc cl-188). Pentru a obține linia celulară CLDN1-pozitivă SW480 (SW480-CLDN1), celulele SW480 au fost transfectate stabil cu clona umană cldn1 ADNc (Invitrogen MGC collection) sau cu vector gol (pcDNA) folosind reactivul de transfecție jetPRIME implus (Polyplus-transfection Inc., Franța). Clonele CLDN1-pozitive au fost selectate prin creșterea celulelor transfectate în prezența a 500 hectogg/ml de geneticină. Pentru reducerea la tăcere a CLDN1, SW620 a fost transdus cu vectorul pSIREN care conține shRNA împotriva CLDN1 (SW620shCLDN1) sau împotriva luciferazei (shLUC, martor negativ). După 24 de ore, s-au selectat celule cu 1 hectolitru/mL puromicină și s-au grupat clone stabile. Toate transfecțiile tranzitorii s-au făcut cu ajutorul reactivului de transfecție jetPRIME.

producția de anti-CLDN1 mAb 6 F6

pentru producerea de anticorpi, șoarecii BALB/C de sex feminin cu vârsta de 6-8 săptămâni (Harlan, Gannat, Franța) au fost provocați prin injectarea intra-peritoneală (I.p.) A 4 milioane de celule NIH de șoarece transfectate tranzitoriu cu ADNc CLDN1 (celule NIH-CLDN1) la fiecare două săptămâni (cinci injecții în total). Celulele NIH-CLDN1 au fost amestecate cu adjuvantul complet Freund (Sigma) pentru prima injecție și cu adjuvantul incomplet Freund (Sigma) pentru celelalte patru injecții. O injecție intravenoasă de rapel de celule NIH-CLDN1 a fost administrată la trei luni după a cincea imunizare. Trei zile mai târziu, celulele splinei de la șoareci imunizați au fost fuzionate cu linia celulară de mielom de șoarece P3-X63-Ag.8.653 pentru a produce hibridomas mouse-ul. Supernatanții din clonele nou generate au fost examinați prin sortare celulară activată prin fluorescență (FACS) folosind celule SW480-CLDN1 și SW480 (control negativ). Rezultatele screeningului au fost confirmate prin efectuarea și screeningul suplimentar utilizând celule SW620 și SW620-shCLDN1. Clona anti-CLDN1 hybridoma 6 F6 a fost selectată și clonată prin limitarea diluării. Izotiparea anticorpilor a arătat că 6 F6 a fost un IgG3k.

toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu orientările guvernului francez pentru studii experimentale pe animale (acordul CEEA-LR-12052).

marcarea radioactivă și imagistica SPECT-CT

șoareci nud athimici de sex feminin (în vârstă de 6-8 săptămâni) au fost achiziționați de la Harlan. 6 F6 mAb a fost marcat radioactiv cu 125I (Perkin Elmer) la activitatea specifică de 370 MBq/mg pentru tomografie computerizată cu emisie de un singur foton (SPECT) imagistică, folosind iodo-GEN (Pierce Chemical Co.) metodă. După injectarea venei de coadă de 16 MBq/50 6 F6 etichetate cu 125i, imagini cu tomografie cu emisie de fotoni cu un singur corp întreg/tomografie computerizată (SPECT / CT) au fost achiziționate cu o cameră nanospect multi-pinhole cu 4 capete multiplexare (Bioscan Inc., Washington, SUA) în diferite momente (48, 72 și 96 h). Concomitent, au fost obținute imagini micro-CT pe tot corpul pentru co-înregistrare anatomică cu date SPECT. Datele SPECT și CT reconstruite au fost vizualizate și coînregistrate cu ajutorul Invivoscope XV.

test Clonogenic

celulele canceroase colorectale au fost însămânțate într-o placă cu 6 godeuri (150, 250 sau 400 celule/godeu) și au fost lăsate să adere la 37 de Centimetre C peste noapte. Apoi, în fiecare godeu s-a adăugat 1 ml de RPMI cu sau fără 6 F6 mAb (concentrație finală: 100 hectog/ml) și s-au cultivat celule timp de șase zile. După încă șase zile în mediu fără anticorp, plăcile au fost citite folosind un Citometru imagistic celigo de la celigo și aplicația” verificarea unei singure colonii”. Cytometer celigo este un benchtop in situ sistem de analiză celulară care oferă imagini ale puțurilor folosind iluminarea câmpului luminos (Nexcelom Bioscience, MA, SUA).

stabilirea culturilor sferoide tridimensionale (3D)

atașament Ultra-scăzut, plăci cu fund rotund cu 96 de puțuri (Corning Costar) au fost utilizate pentru formarea sferoidelor. Celulele SW480, SW480-CLDN1 sau SW620 au fost însămânțate la o densitate de 5 104. Celulele agregate și fuzionate în sferoide 3D în 24-72 h. Imaginile sondelor au fost realizate cu un microscop cu contrast de fază folosind un obiectiv de 5 centimi sau capturate cu citometrul imagistic celigo centimi folosind aplicația “Tumorosphere”. Viabilitatea celulară a fost evaluată cu ajutorul testului de viabilitate celulară luminescentă CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI, SUA). După adăugarea a 100 unqql de reactiv Celltiter Glo la fiecare godeu timp de 10 minute, luminescența a fost măsurată pe un cititor de microplăci de luminiscență MicroBeta TriLux de 1450 (Perkin Elmer).

analiza ciclului celular și a proliferării în sferoidele

Sferoidele au fost preparate prin placarea a 1000 de celule DiFi per godeu în plăci cu 96 de godeuri cu atașament ultra-scăzut și creșterea lor în prezența a 100 de centig/ml din 6 F6 mAb sau MAB irelevant (retuximab) timp de 5 zile. Pentru analiza ciclului celular, celulele au fost granulate, tripsinizate, spălate cu PBS, fixate în 75% etanol și colorate cu 40 de iodură de propidiu de 400 de ml−1 rnază (Qiagen). Distribuția ciclului celular a fost determinată cu un Citometru Fc500 Beckman Coulter folosind canalul FL-3. Celulele au fost închise pe un grafic punct care afișa vârful ADN-puls vs zona ADN-puls pentru a exclude dubletele. Distribuțiile ciclului celular au fost ilustrate folosind software-ul de analiză Flow Jo (Treestar, FLOWJO, Ashland, or, SUA).

în ziua a 4-a de cultură, proliferarea celulară a fost măsurată prin incubarea celulelor cu 5-etinil-2′ – deoxiuridină (EdU) timp de 24 de ore. Apoi, după tripsinizarea celulară și fixarea/permeabilizarea în etanol 75%/PBS, Edu încorporat a fost etichetat și detectat cu kitul de testare a citometriei în flux click-iT Edu Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Celulele au fost apoi incubate cu 1 hectolitru/ml de 4′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) în PBS/0,1% Triton X100 la 37 CTC timp de 30 min. Aplicația “Expression Analysis” (Target 1 + Mask) a fost utilizată pentru cuantificarea semnalului fluorescent și pentru analiza datelor. Celulele au fost identificate folosind pata nucleară DAPI, iar sinteza ADN a fost cuantificată prin măsurarea încorporării EdU.

modelele de xenogrefă de șoarece

1,5 celule x 606 x 620 sau 3 celule x 106 x DiFi au fost suspendate în mediu de cultură și injectate subcutanat (s.c.) în flancul drept al femelelor de șoarece atimic nud de 6-8 săptămâni de la Harlan. Când volumul tumorii a atins aproximativ 100 mm3, șoarecii au fost randomizați în diferite grupuri și tratați prin injecție I.p. de 0,9% NaCl sau 6F6 mAb (15 mg/Kg pe injecție) de două ori pe săptămână timp de trei săptămâni consecutive pentru primul experiment și de trei ori pe săptămână pentru al doilea experiment. Tumorile au fost măsurate bi-săptămânal cu un etrier și volume calculate cu formula: D1 x D2 x D3/2.

model de colonizare hepatică Intrasplenică

în fiecare experiment, 2 milioane de celule SW620 care exprimă luciferază (celule SW620-LUC) au fost injectate în splina șoarecilor nud athimici de sex feminin în vârstă de 6-8 săptămâni. Splina a fost îndepărtată la 2 minute după injectarea celulelor. În ziua 1 după injectare, șoarecii au fost împărțiți aleatoriu în două grupuri de 10 șoareci care au fost tratați fie cu 15 mg/kg de 6 F6 mAb, fie cu 0,9% NaCl prin injecție I.p., de trei ori pe săptămână. Pentru a evalua formarea și diseminarea metastazelor, expresia luciferazei a fost monitorizată prin imagistică prin luminiscență după injectarea luciferinei (Camera Ivis Lumina II, PerkinElmer XV) o dată pe săptămână. În săptămâna 5 după operație, șoarecii au fost sacrificați, ficatul a fost îndepărtat, fotografiat și metastazele vizibile macroscopic pe suprafața ficatului au fost numărate.

analiza statistică

analiza statistică a fost realizată cu ajutorul software-ului STATA 13.0 (StataCorp). Pentru experimentele de exprimare a genelor sau imunohistochimie, diferențele dintre grupuri au fost analizate folosind testul Kruskall Wallis/Dunn. Corelațiile dintre expresia genei CLDN1 și supraviețuirea fără progresie (SFP) și supraviețuirea globală (OS) au fost evaluate în întregul grup (n = 143 pacienți) și în funcție de subtipul molecular tumoral. În acest scop, cei 143 de pacienți au fost împărțiți în două grupuri pe baza expresiei mediane a genei CLDN1 (adică 9,75 ). Valorile SFP și OS au fost comparate folosind metoda Kaplan-Meier și diferențele dintre distribuțiile de supraviețuire evaluate folosind testul log-rank.

testul t asociat a fost utilizat pentru a compara efectul incubației cu 6 F6 mAb în experimentele in vitro.

în experimentele in vivo, a fost utilizat un model liniar de regresie mixtă pentru a determina relația dintre creșterea tumorii și numărul de zile după injectare. Partea fixă a modelului a inclus variabile corespunzătoare numărului de zile post-grefă și diferitelor grupuri de tratament. Termenii de interacțiune au fost încorporați în model; interceptările aleatorii și pantele aleatorii au fost incluse pentru a lua în considerare efectul de timp. Coeficienții modelului au fost estimați prin probabilitate maximă. Ratele de supraviețuire au fost estimate de la data injectării până la data la care tumora a atins un volum de 1500 mm3 folosind metoda Kaplan–Meier. Curbele de supraviețuire au fost comparate folosind testul log-rank. Pentru experimentele de colonizare hepatică, diferențele dintre grupuri au fost evaluate cu testul Mann-Whitney U. Pentru toate experimentele, diferențele au fost considerate semnificative atunci când P < 0,05.