expresia constitutivă a genelor selectate din căile fosfat de pentoză și aromatice crește randamentul acidului shikimic în culturile loturilor bogate în glucoză ale unei tulpini Escherichia coli lipsite de PTS și pykF

construcția tulpinilor derivate din PB12 Arok-aroL plasmidă concepută pentru expresia constitutivă a unui operon sintetic utilizat în producția de acid shikimic

dovezile nepublicate din laboratorul nostru indică faptul că producția de compuși aromatici în tulpina pb12 evoluată în laborator poate atinge niveluri mai ridicate atunci când inducția transcripțională a genelor implicate în canalizarea fluxului de carbon în calea AAA are loc la începutul fermentațiilor. Luând în considerare această observație, a fost elaborată o nouă strategie pentru optimizarea producției de SA în PB12 care transportă gene Arok și arol inactive (Figura 1). Această strategie a inclus proiectarea și construirea unei plasmide pentru expresia puternică și stabilă a șase gene cheie aranjate sub forma unui operon sintetic, controlat exclusiv de un singur promotor Trc. Pentru a reduce povara metabolică, o singură plasmidă derivată din pBR327 care transportă locusul par pentru o stabilitate plasmidă crescută a fost utilizată ca vector , după încorporarea unui fragment care conține promotorul, polilincherul și terminatorii transcripționali din pTrc99A (Figura 2).

partea inițială a operonului a fost construită prin amplificarea secvențială și ligarea primelor 4 secvențe de codificare (aroB, tktA, aroGfbr și aroE) în polilinker-ul plasmidei Pbrint-Ts Cm, utilizat ca schelă de clonare (vezi metode). Ulterior, construcția cu 4 gene a fost transferată la plasmida hibridă pTrc327par împreună cu încă 2 gene (aroD și zwf), ducând la un operon de 8KB conținut într-o plasmidă de 12KB (Figura 2). Plasmida rezultată, denumită pTrcAro6, a fost transformată în tulpina Arok-aroL pb12 lipsită de gena lacIq, permițând exprimarea constitutivă a genelor de interes (Tabelul 1). Pentru simplitate, tulpina pb12 Arok-arol-lacI generată a fost denumită AR2. După ce gena pykF a fost inactivată în AR2, tulpina rezultată a fost numită AR3. Tulpinile derivate din AR2 și AR3 care transportă plasmida pTrcAro6 au fost denumite ar26 și, respectiv, ar36 (Tabelul 1).

dispunerea spațială a secvențelor de codificare care constituie operonul sintetic din pTrcAro6, flancată de promotorul Trc și terminatorii transcripționali, este prezentată în Figura 2. aroB este prima genă din operon, deoarece mai multe dovezi indică faptul că expresia sa scăzută este una dintre etapele limitative în producerea compușilor aromatici . Plasmida pTrcAro6 poartă, de asemenea, genele tktA și aroGfbr, ale căror produse sunt implicate în sinteza E4P și condensarea sa cu PEP pentru a forma DAHP, primul compus aromatic (Figura 1). genele aroD și aroe au fost, de asemenea, incluse pentru a promova o conversie eficientă a DHQ în SA. În plus, această plasmidă poartă gena zwf, codificând prima enzimă a PPP (Figura 1). Decizia de a include această genă sa bazat pe următoarele observații: 1) supraexprimarea zwf a recuperat substanțial pierderea ratei de creștere datorată încărcării metabolice plasmidice în tulpina JM101 crescând pe glucoză ca sursă de carbon unică ; 2) s-a raportat că tulpina PB12 prezintă o partiție a fluxului de carbon deosebit de scăzută la nodul glucoză 6-fosfat (G6P) spre PPP (5% din G6P consumat comparativ cu 22% în tulpina parentală JM101). Prin urmare, o supraexprimare a acestei gene ar trebui să crească disponibilitatea NADPH, necesară în cantități catalitice de enzima shikimat dehidrogenază (AroE) și poate atenua potențialele afecțiuni de creștere prin redirecționarea mai multor G6P către biosinteza nucleotidelor și aminoacizilor în tulpinile derivate din PB12 . Cu toate acestea, experimentele prezentate în acest raport nu au avut ca scop disecția efectului specific al oricărei gene utilizate, ci au căutat să caracterizeze consecințele exprimării tuturor acestora ca operon.

pentru a promova o traducere eficientă a fiecărei gene, fiecare secvență de codificare a fost amplificată folosind primeri desemnați care au introdus o secvență Shine-Dalgarno consensuală situată la 8 bp în amonte de locul de pornire a traducerii. Secvența nucleotidică a operonului construit este prezentată în fișierul suplimentar 1.

evaluarea efectelor cauzate de inactivarea pykF la tulpinile care exprimă operonul Aro6

pentru a evalua efectele cauzate de inactivarea pykF asupra producției de SA, performanța tulpinilor de producție ar26 (pykF+) și AR36 (pykF-) a fost comparată folosind flacoane de agitare conținând 15 g/L de Glc și 5 g/l de YE. Ca martor, au fost incluse și aceleași tulpini care conțin o plasmidă ptrc327par goală (fără operonul Aro6), AR2e și ar3e.

chiar dacă SA acumulat în toate cazurile, așa cum era de așteptat pentru mutanții din Arok și aroL, tulpinile care conțin pTrcAro6 au atins concentrații de sa mai mari decât cele cu o plasmidă goală (figura 3b). În plus, titrul SA a fost de aproape două ori mai mare în AR36 decât în AR26 (6,1 g/l față de 3,3 g/L). O scădere a consumului de Glc a fost observată la tulpina ar26 după aproximativ 18 ore de cultură, corelându-se cu concentrația ridicată de acetat și o oprire în producția de SA. În schimb, tulpina ar36 a prezentat un consum constant de Glc și s-au produs cantități neglijabile de acetat (figura 3c, 3d). Aceste rezultate demonstrează că genele prezente în operonul artificial sunt funcționale și promovează producția de SA de la începutul culturii. Expresia lor constitutivă a diminuat cu 25% Rata de creștere specifică (XV) în fondul pykF+ și a crescut – o marginal în varianta pykF, dar nu a determinat modificări semnificative ale biomasei maxime produse (Xmax) comparativ cu tulpinile cu o plasmidă goală (figura 3a). Remarcabil, în tulpinile care exprimă operon în aceste condiții de creștere, inactivarea genei pykF a crescut producția de SA, a eliminat acumularea de acetat și a permis consumul constant de Glc.

comportamentul tulpinilor Ar26, AR36 și al derivaților lor plasmidici goi, AR2e ( pykF+) și ar3e ( pykF -), folosind flacoane de agitare conținând 15 g/L de Glc și 5 g/l de YE (A, b,C,d) și fermentatori de 1 l conținând 100 g/L de Glc și 15 g/l de YE (e). a) Creștere; B) producția SA; C) Consumul Glc; D) producția de acetat; e) consumul Glc și producția SA de ar26 și AR36 în fermentatori. Barele de eroare reprezintă deviația standard.

pentru a determina dacă producția mai mare de acetat și producția mai mică de SA în AR26 comparativ cu AR36 este o consecință a disponibilității inerent scăzute a oxigenului și a acidificării mediului în culturile de baloane de agitare, ambele tulpini au fost cultivate în fermentatori de lot de 1 L în condiții controlate de pH și tensiune de oxigen dizolvat (DOT). Ca abordare pentru creșterea titrului SA, concentrația inițială de Glc în aceste experimente a fost crescută la 100 g/L, iar concentrația YE a fost crescută concomitent la 15 g/l pentru a permite generarea mai mare a biomasei.

în aceste condiții tulpina ar36 a produs 42 g/L de SA în 60 de ore, consumând tot Glc și acumulând 12 g/l de acetat. În schimb, după tulpina de 47 h, ar26 a produs maximum 13 g/L de SA, nu a epuizat Glc și a acumulat 29 g/l de acetat (figura 3e și Tabelul 2). Indiferent de condițiile controlate din fermentatori, unde pH-ul a fost menținut la 7 și punctul A fost mai mare de 20% în orice moment, profilurile de producție ale ambelor tulpini s-au asemănat cu comportamentul observat în flacoanele de agitare, AR26 producând mai mult acetat și mai puțin SA. Chiar și atunci când rata globală de consum volumetric de Glc (Qsglobal), xlux și Xmax obținute de ambele tulpini au fost similare, productivitatea, randamentul și titrul au fost de peste două ori mai mari în AR36 decât în AR26 (figura 3e și Tabelul 2).

este remarcabil faptul că astfel de diferențe mari în producția de acetat și SA au fost observate prin perturbarea unei singure gene, ceea ce demonstrează avantajele inactivării combinate a PTS și pykF atunci când se utilizează un sistem de Expresie constitutivă într-o tulpină de E. coli evoluată. Pentru a ține cont de îmbunătățirile observate în producția de SA, sugerăm că expresia timpurie și constantă a enzimelor codificate în operon ar putea menține un consum constant de intermediari glicolitici în toate culturile, prevenind fluctuațiile mari ale concentrațiilor lor intracelulare. Presupunem că combinarea acestei stări metabolice constante cu un flux redus de la PEP la piruvat cauzat de inactivarea genei pykF poate crește disponibilitatea PEP și a altor precursori glicolitici pentru producția de SA fără a scădea rata de consum a Glc. Cu toate acestea, recunoaștem că, în absența concentrațiilor măsurate de metabolit intracelular, aceste observații sunt speculative.

profile de fermentare a AR36 în culturi lot

luând în considerare rezultatele anterioare, AR36 a fost selectat pentru caracterizarea ulterioară a performanței sale cinetice și stoichiometrice în fermentatori de 1 L. Pentru a realiza acest scop, producția de SA a fost testată cu trei condiții diferite de cultură cu substrat înalt. Creșterea, Glc și produsele secundare au fost măsurate pentru fiecare caz, ceea ce la rândul său a permis o comparație a productivităților și randamentelor.

în primul rând, s-au utilizat 50 g/L de Glc și 15 g/l de YE (figura 4a). Creșterea a avut loc în timpul primelor 10 ore, generând 6,3 g/L de greutate a celulelor uscate cu un procent de 0,53 h-1. În această condiție, 24 G/L de SA au fost produse în 32 h. consumul de Glc și producția de Sa au avut loc de la începutul fermentației și au durat până la epuizarea Glc, deși rata de consum specifică Glc (qs) și productivitatea specifică SA (qp) au fost mai mari în faza exponențială (Tabelul 3). Randamentul rezultat al SA pe Glc (YSA/Glc) a fost de 0,47 mol/mol, iar productivitatea globală volumetrică sa (Qpglobal) a fost de 0.74 gSA/L * h (Tabelul 3). În ceea ce privește acumularea de produse secundare în calea SA, concentrațiile de 2,4 G/L de DAHP, 2,1 g/l de DHS, 1,4 g/l de QA, 0,4 g/l de GA și 0,3 g/l de DHQ au fost prezente în supernatant la sfârșitul fermentației (figura 5a). În aceste condiții, practic nu s-a produs acetat în cursul fermentației, atingând o concentrație maximă de 1,5 g/L după 32 h (figura 4a).

profilul de fermentare al tulpinii ar36 cultivat în 1 l bioreactori cu trei concentrații diferite de substrat. a) 50 g/L de Glc și 15 g/l de voi; b) 100 g/L de Glc și 15 g/l de voi; c) 100 g/l de Glc și 30 g / l de voi. Glc: cercuri; sa: pătrate; acetat: triunghiuri deschise; concentrația biomasei: triunghiuri inversate. Barele de eroare reprezintă deviația standard.

produși secundari aromatici ai căii SA detectați în culturi fermentoare de 1 L ale tulpinii ar36 folosind trei concentrații diferite de substrat. a) 50 g/L de Glc și 15 g/l de voi; b) 100 g/L de Glc și 15 g/l de voi; c) 100 g/l de Glc și 30 g / l de voi. Diamante: DAHP (3-deoxi-d-arabinoheptulosonat 7-fosfat); pătrate: DHQ (acid 3-dehidrochinic); cercuri: DHS (acid 3-dehidroshikimic); triunghiuri: QA (acid chinic); triunghiuri inversate: GA (acid galic). Barele de eroare reprezintă deviația standard.

având în vedere că 50 g/L de Glc au fost consumate complet, a fost inițiat un al doilea experiment de lot cu 100 g/L de Glc și 15 g/l de YE. După cum s-a menționat în comparația cu ar26 din secțiunea anterioară, AR36 cultivat în aceste condiții a produs aproximativ 42 g/L de SA în 60 h (figura 4b). În acest caz, după consumarea a aproximativ 100 g/L de glucoză și atingerea concentrației maxime de SA, tulpina a produs 12 g/L de acetat. Valorile obținute pentru YSA/Glc, Qpglobal, Qsglobal, Xmax și centimetric au fost similare cu cele obținute cu 50 g/l de Glc și 15 g/l de YE (Tabelul 3). Aceste experimente arată că, atunci când se utilizează aceeași concentrație YE, se consumă de două ori cantitatea de Glc în aproape de două ori, indicând faptul că rata medie de consum de glucoză este menținută între ambele condiții de cultură. Concentrații de 4,8 g/L de DAHP, 2,8 g/l de DHS, 3,4 g / L de QA, 0.7 g/L de GA și 0,9 g/l de DHQ au fost prezente în supernatant după 60 h (figura 5b). Interesant este că, la dublarea concentrației Glc, produsele intermediare ale căii AAA au crescut într-o manieră destul de proporțională cu SA, indicând faptul că consumul de 100 g/L de Glc nu a generat aparent noi blocaje ale fluxului de carbon. Ca rezultat, cantitatea de SA formată în raport cu totalul compușilor aromatici produși a fost aproape de 80% în ambele experimente (Figura 6).

procent Molar din fiecare compus aromatic produs în tulpina AR36 în raport cu totalul culturilor în loturi începând cu: a) 50 g/L de Glc și 15 g/l de YE; b) 100 g/l de Glc și 15 g/l de YE; c) 100 g/l de Glc și 30 g/l de YE. Randamentele calculate și raporturile molare ale compușilor aromatici produși sunt prezentate sub fiecare bară. Comparațiile au fost făcute cu concentrațiile măsurate în supernatant la sfârșitul fermentațiilor. YSA / Glc = randamentul SA din Glc; YTAC / Glc = randamentul compușilor aromatici totali din Glc; Ymax = randamentul teoretic maxim al compușilor aromatici.

efectul creșterii YE asupra productivității SA a fost investigat cu un al treilea set de experimente, folosind 100 g/L de Glc și 30 g/l de YE. Deși biomasa a fost dublată atunci când s-a utilizat de două ori concentrația de YE, titrul SA, inqq și YSA/Glc au fost foarte asemănătoare cu cele obținute în cultură cu 100 g/l de Glc și 15 g/l de YE (figura 4B și figura 4c). Împreună cu datele obținute din celelalte două condiții, aceste constatări sugerează că cantitatea de YE determină în primul rând biomasa maximă care poate fi obținută. În plus, o creștere a concentrației inițiale de YE nu a modificat titrul SA și susține observația că SA este produsă în principal din glucoză. Relația directă dintre concentrația inițială de YE și biomasa maximă generată, indiferent de concentrația inițială de Glc testată în aceste condiții de creștere, sugerează că unul sau mai mulți nutrienți limitativi sunt furnizați de YE. De asemenea, s-ar părea că astfel de nutrienți nu pot fi sintetizați din Glc, prin urmare epuizarea lor din ye limitează creșterea cu mult înainte ca Glc să fie epuizat. Este de așteptat ca aminoacizii aromatici și vitaminele prezente în YE care sunt necesare pentru a contracara auxotrofia AR36 să devină limitative; cu toate acestea, alți compuși din acest mediu complex pot juca, de asemenea, un rol în limitarea creșterii în timp.

pentru o concentrație inițială de YE de 30 g/L, un total de 106 g/L de Glc și 43 g/l de SA au fost consumate și, respectiv, produse în aproximativ jumătate din timp decât fermentația cu 15 g/l de YE. Cu 30 g/L de YE, Qsglobal și Qpglobal au crescut de două ori, în comparație cu fermentațiile cu 15 g / L de YE, chiar dacă titrul SA a rămas neschimbat (Tabelul 3). Deoarece biomasa a crescut de asemenea de două ori, QP și qs calculate au fost similare între cele trei experimente, atât în faze exponențiale, cât și staționare, prezentând robustețea metabolică a tulpinii proiectate în condițiile testate.

în plus, rezultatele au arătat că o creștere a concentrației YE nu a crescut considerabil concentrația intermediarilor căii SA (figura 5c). În acest sens, s-a recunoscut faptul că prezența unor cantități mari de intermediari de cale poate avea un impact negativ asupra recuperării SA din bulionul de fermentație . Această preocupare a îndreptat unele eforturi asupra subiectului, ducând la testarea condițiilor de cultură, a fundalurilor genetice și a utilizării analogilor de glucoză nemetabolizabili, ca încercări de a minimiza generarea de produse secundare .

în aceste experimente, o proporție mare de SA în raport cu produsele secundare a fost detectată fără a aplica nicio modificare suplimentară tulpinii sau procesului. Concentrația fiecărui intermediar de cale a fost comparată cu suma tuturor intermediarilor aromatici, iar procentele lor au fost utilizate pentru a calcula raportul molar al SA la fiecare produs secundar la sfârșitul fermentațiilor (Figura 6). Raportul SA sa dovedit a fi mai mare de 10 pentru DHS, QA sau DAHP și mai mare de 40 pentru GA sau DHQ pentru toate concentrațiile de substrat testate. În mod remarcabil, în toate condițiile, randamentele SA obținute au fost apropiate de 50% din maximul teoretic, iar randamentele compușilor aromatici totali (TAC) au fost peste 60% din maximul teoretic, estimat ca 0.86 molTAC / molGlc (a se vedea metodele și Figura 6). Aceasta reflectă redirecționarea eficientă a glucozei către calea AAA în tulpina ar36, chiar și atunci când se utilizează culturi de lot cu conținut ridicat de glucoză. Raportul dintre SA și produsele secundare, precum și randamentele sa și TAC obținute sunt destul de constante pentru toate condițiile evaluate și reprezintă, după cunoștințele noastre, cele mai mari valori raportate pentru un proces de fermentare a producției de SA. Aceste îmbunătățiri pot fi justificate prin luarea în considerare a faptului că platforma prezentă în tulpina proiectată permite o expresie mai omogenă a enzimelor necesare pe un fond genetic eficient. Acest lucru, spre deosebire de alte sisteme de Expresie în care genele necesare sunt exprimate din plasmide separate, sub promotori diferiți sau în tulpini care nu sunt optimizate pentru utilizarea eficientă a nivelurilor ridicate de Glc. Pe lângă avantajele privind dinamica expresiei genelor, faptul că IPTG nu este necesar pentru inducerea operonului Aro6 reprezintă un beneficiu economic important pentru procesul de producție, deoarece prețul ridicat al IPTG restricționează utilizarea acestuia în fermentații la scară largă.

perspective asupra metabolizărilor glicolitice și acetate ale tulpinii AR36 de către RT-qPCR

pentru a obține o perspectivă mai profundă a modificărilor metabolice induse de expresia constitutivă a operonului sintetic Aro6 în tulpina ar36, nivelurile de transcriere ale mai multor gene au fost măsurate în trei etape diferite de creștere în culturi cu 50 g/L de Glc și 15 g/l de YE. După cum se detaliază în metode, datele obținute din faza exponențială timpurie (EE), faza exponențială târzie (LE) și faza staționară (ST) au fost normalizate în raport cu valorile măsurate din tulpina ar3e la ee, cultivată în aceleași condiții de cultură.

rezultatele indică faptul că prezența și expresia operonului în tulpina ar36 crește nivelurile transcripționale ale mai multor gene care codifică enzimele glicolitice în timpul fazelor EE și LE (Figura 1 și figura 7a). Creșterea expresiei genelor galP și glk este deosebit de interesantă, deoarece s-a raportat că produsele lor controlează importul și fosforilarea glucozei în PB12, tulpina parentală a AR36 . În plus, există o creștere semnificativă a nivelurilor transcripționale ale IGP și eno, dar nu pykA. Aceste modificări se pot traduce într-o disponibilitate mai mare de PEP și fructoză 6-P (care poate fi transformată direct în E4P de transketolaza codificată cu plasmidă), crescând randamentul compușilor aromatici. Teoretizăm că reglarea ascendentă observată a genelor glicolitice în tulpina ar36 ar putea fi una dintre consecințele asupra nivelurilor scăzute ale unor intermediari glicolitici (glucoză 6-fosfat, fructoză 6-fosfat și PEP), cauzată de expresia puternică și constitutivă a enzimelor codificate de operon care consumă acești metaboliți.

modificări transcripționale rezultate din expresia operonului sintetic Aro6 în tulpina ar36. Pentru comparație, nivelul de transcripție al fiecărei gene a fost determinat în trei puncte diferite în curba de creștere a tulpinii ar36, crescută cu 50 g/L de Glc și 15 g/l de YE (vezi figura 4a). Toate datele au fost normalizate în raport cu valorile obținute din tulpina ar3e în faza de creștere exponențială timpurie. a) gene care codifică enzimele glicolitice; b) gene implicate în asimilarea și biosinteza acetatului; c) gene cuprinse în operonul sintetic Aro6 (vezi Figura 1 și Figura 2). Bare negre: faza exponențială timpurie; bare gri: faza exponențială târzie; bare albe: faza staționară. Barele de eroare reprezintă deviația standard.

pe de altă parte, nivelurile transcripționale ale genelor care codifică enzimele implicate în biosinteza acetatului (poxB, ackA și pta) nu au fost modificate de prezența operonului sintetic, în timp ce actP și acs, care codifică enzimele implicate în asimilarea acetatului, au fost puternic reglate în fazele EE și LE (figura 7b). Reglarea în sus a genelor actP și acs a fost, de asemenea, detectată în faza de creștere exponențială a tulpinii parentale PB12 care este capabilă să co-utilizeze Glc și acetat în mediu minim . Aceste constatări se corelează cu nivelurile scăzute de acetat în starea de creștere testată (figura 4a). Important, valorile transcripționale ale acestor gene implicate în asimilarea acetatului au fost scăzute în faza ST (figura 7b). Dacă acest răspuns este reprezentativ pentru celelalte condiții de creștere utilizate, ar putea explica parțial acumularea de acetat observată în fermentații cu 100 g/L de Glc, care consumă cantități mai mari de Glc în timpul fazei staționare (figura 4B și figura 4c). Aceste rezultate evidențiază actP și acs ca potențiale ținte genetice pentru a-și crește artificial expresia în etapele culturii târzii, profitând de capacitățile așteptate ale tulpinii ar36 de a utiliza simultan Glc și acetat, prezent în tulpina sa parentală PB12 .

genele prezente în operonul sintetic au prezentat niveluri de Expresie foarte puternice (chiar și în faza staționară), reflectând natura constitutivă a promotorului și numărul mare de copii ale plasmidei (figura 7c). Aceste rezultate se corelează cu consumul neîntrerupt de Glc și producția de SA observate pe parcursul întregii fermentații (figura 4a), sugerând că enzimele codificate de genele din operon sunt prezente pe tot parcursul timpului de cultivare. Se poate observa în figura 7c că nivelurile de transcriere ale arodului și zwf sunt comparativ mai mari și, respectiv, mai mici decât celelalte patru gene din operon. Această observație trebuie luată cu precauție, deoarece cele șase gene din operon sunt comparate cu cele prezente în cromozomul tulpinii de referință ar3e. Deoarece valorile obținute pentru cele șase gene nu sunt normalizate între ele, variațiile dintre expresia lor cromozomială în tulpina ar3e pot modifica comparațiile relative cu tulpina ar36. Cu toate acestea, datele transcriptomice sunt în concordanță cu raportul ridicat dintre sa și intermediarii aromatici obținuți în condițiile testate, ceea ce este de așteptat dacă toate genele din operon au fost exprimate în mod adecvat. Împreună cu datele cinetice și stoichiometrice, aceste rezultate evidențiază beneficiile utilizării unui operon sintetic exprimat constitutiv ca strategie alternativă pentru creșterea randamentului SA din Glc într-o tulpină evoluată care nu are PTS și pykF.