gap junction protein Connexin-43 este un regulator transcripțional direct al n-cadherinei in vivo

manipularea embrionilor

Adult X. laevis au fost menținute la 17 C și utilizate în conformitate cu reglementările unității de servicii biologice de la University College London, respectând liniile directoare ale Biroului de acasă din Marea Britanie stabilite în Legea animalelor 1986 așa cum este Descris45. Embrionii X. laevis au fost obținuți și etapizați așa cum s-a descris anterior46,47. Pentru a viza în mod specific creasta neuronală, embrionii au fost injectați în blastomerii ventrali ai animalelor în stadiul cu opt celule pe o parte pentru toate experimentele, cu excepția cazului în care au fost utilizați lizați embrionari. În acest caz, embrionii au fost injectați în ambele părți animale ale embrionilor cu două celule. Microinjecțiile embrionare au fost efectuate în conformitate cu48. Dacă este necesar, fluoresceină-dextran (FDX; Invitrogen, D1821, 20 ng) sau rodamină-dextran (RDx; Invitrogen, D1824, 20 ng) au fost utilizate ca marcatori. Oligomorfolinos împotriva lui X. laevis Cx43 (Cx43MO1; 8-24 ng, 5′-TTCCTAGGCACTCCAGTCACCCAT-3′, Cx43MO2; 8-24 ng, 5′-AAAAATGGTTTTCTTGTGGGTCGA – 3′) și BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′-Aacggaccgggtttaaaggcttcct-3′) au fost sintetizate și furnizate de Gene Tools LLC. Au fost utilizate concentrații echimolare ale morfolino-ului martor standard (CTLMO: 3′-ATATTTAACATTGACTCCATTCTCC-5′). Cantitățile de morfolinos corespund cantităților injectate într-o parte a embrionilor în stadiu de opt celule, în timp ce cealaltă parte a fost utilizată ca control intern. Când embrionii au fost utilizați pentru colectarea lizatelor embrionare, aceștia au fost injectați în stadiul cu două celule în ambele blastomere animale și s-au utilizat doze duble din dozele menționate. Pentru a testa eficiența cx43mos pe ARNm endogen cx43, am efectuat analiza western blot. Ambele Cx43MOs au redus eficient nivelurile de proteine ale cx43fl endogen și Cx43iso (Fig. 3a, b). Pentru a valida eficiența BTF3MO, am testat prin imunostimularea celulelor crestei neuronale expresia proteinei BTF3, care a arătat niveluri scăzute de BTF3 în celulele BTF3MO comparativ cu CTLMO (Fig suplimentar. 3a).

hibridizarea in situ a fost efectuată conform descrierii anterioare49,50. Pe scurt, embrionii au fost fixați în MEMPFA, urmată de hibridizarea peste noapte cu sonde marcate cu digoxigenină, incubate cu un anticorp AP și activitatea AP a fost dezvoltată folosind substraturi NBT/BCP. Sondele ARN marcate cu digoxigenină au fost pregătite pentru foxD348 snail251, twist52, n-cadherin53, C353, btf3 (Xenbase: XL075i22) și sox1054, sox954. C3 (1 µg/ml), snail2 (0,8 µg/ml), foxD3 (2 µg/ml), sox10 (1 µg/ml), sox9 (1 µg/ml), și poftă de mâncare (de 0,7 µg/ml) au fost utilizate pentru a evalua crestei neurale inducție, poftă de mâncare (0.7 / ml) pentru migrarea crestei neuronale, n-cadherin (1/ml) pentru evaluarea nivelurilor de expresie și modelul de Expresie btf3 (0,7/ml). Imunostimularea cu montare integrală a fost efectuată așa cum sa descris anterior55 utilizând anticorpi Cx43 (1:1000, Sigma, C6219). Pe scurt, embrionii au fost fixați în MEPMFA și incubați peste noapte cu anticorpul la diluția descrisă.

explantele cu capac de animale au fost disecate din Xenopus blastulas (etapa 8) folosind o tehnică standard48,56 și pregătite pentru hibridizare in situ așa cum este descris mai sus. Pentru testele cu capac la animale, ARNm de 500 pg a fost injectat în partea animală a celor două blastomere ale embrionilor în două etape celulare. Analiza ISH a fost efectuată pe 20-25 embrioni pe condiție pentru fiecare experiment independent.

manipularea și imagistica creastei neuronale

transplanturile de creastă neuronală au fost efectuate așa cum s-a raportat anterior57. Pe scurt, creasta neuronală preluată din etapa 18 embrionii marcați fluorescent au fost disecați cu cuțite pentru sprâncene și altoiți în embrioni gazdă neetichetați. Pentru experimentele in vitro, explantele crestei neuronale craniene au fost disecate în stadiul 18 folosind o tehnică standard58,59 și placate cu plăci acoperite cu fibronectină (Sigma, F1141), așa cum s-a descris anterior53. Pentru testele cu o singură celulă, celulele crestei neuronale au fost disociate pe scurt în Ca2+/Mg2 + -liber Danilchick medium53. Pentru fiecare afecțiune, au fost analizați zece embrioni transplantați cu nc marcat fluorescent pe experiment.

Imunosupresarea a fost efectuată pe explante de creastă neurală așa cum s-a descris anterior54 folosind anti-n-cadherin (1:50, IgG de șobolan, clonă MNCD2, DSHB), anti-e-cadherin (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. Imagistica migrației creastei neuronale in vitro a fost realizată utilizând cinematografia time-lapse,așa cum a fost descrisă anterior53, 60. Pe scurt, celulele crestei neuronale au fost cultivate în vase petri din plastic sau sticlă acoperite cu fibronectină, iar microcopia time-lapse a început după o oră de cultură in vitro. Pentru motilitatea și migrarea celulelor, au fost utilizate Microscoape compuse (fie un microscop Nikon Eclipse 80I cu o cameră digitală Hamamatsu, fie un microscop DMRXA2 Leica cu o cameră digitală Hamamatsu controlată de un program PCI simplu) echipat cu trepte motorizate și un obiectiv uscat de 10 Irak/0,30 NA. Culturile NC au fost preparate așa cum este descris mai sus. Imaginile au fost achiziționate la fiecare 5 minute pentru o perioadă de 12 ore. pentru imagistica morfologică celulară, a fost utilizat un microscop TCS SP8 cu lentile de obiectiv de imersie în apă de 63 Irak /0,90 NA și controlat de software LAS–AF. Celulele fixe au fost imaginate folosind un obiectiv de imersie în ulei de 63 /1,4 NA și un microscop confocal Leica TCS SPE controlat de software-ul LAS-AF.

pentru localizarea construcției sau nivelurile IF endogene, au fost analizate 10-15 NCCs pentru fiecare afecțiune pe experiment.

analiza migrării celulare și a morfologiei celulare

testul de chemotaxie a fost efectuat în urma unei proceduri standard61 utilizând granule acrilice de heparină (Sigma, H5263) acoperite cu factor-1 derivat de celule stromale umane purificate-1 (Sigma, SRP3276). Motilitatea celulară și chemotaxia au fost analizate folosind instrumente de analiză ImageJ (https://imagej.nih.gov), așa cum s-a descris anterior53,60. Pe scurt, fiecare celulă individuală a fost urmărită manual folosind pluginul de urmărire manuală a ImageJ, datele au fost colectate și analizate folosind pluginul Chemotaxis al ImageJ. Morfologia celulară a fost evaluată prin implementarea indicelui de circularitate (cerc complet = 1) și estimată prin instrumente de analiză ImageJ. Dispersia celulară a fost analizată folosind algoritmul de triangulare Delaunay (plugin-uri ImageJ) și a fost reprezentată grafic ca suprafață medie a triunghiului explant, așa cum este descris înainte54. Zona proeminentă celulară a fost analizată în celulele crestei neuronale la marginea unui explant care măsoară zona de creștere care derivă din două intervale de timp consecutive cu interval de timp de 4 minute; aceste două cadre consecutive au fost scăzute pentru a genera noua zonă12. Pentru analiza chimiotaxiei celulare și a dispersiei celulare au fost analizate 10-15 explante pe condiție pentru fiecare experiment independent. Pentru motilitatea celulară, morfologia celulară și proeminențele celulare au fost analizate 15-25 NCCs pe condiție pe experiment.

Biologie Moleculară, plasmide și reactivi

pentru sinteza ADNc, ARN-ul total a fost izolat din 10-15 embrioni stadiile 23-24 sau 10-15 capace animale etapa 8 de la X. laevis per condiție pentru fiecare experiment independent și au fost utilizate trei replici tehnice în cadrul fiecărui experiment25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) ca șablon. Lungimea completă Cx43 (cx43fl, aa 1-379), constructul cx43 carboxi trunchiat terminal (cx43trunc, aa 1-212) și constructul cx43-20k (cx43tail, aa 213-379) au fost clonate în 5 ‘Bamhi/3’ Xhoi de vectori pCS2+ sau pCS2-EGFP. Vectorul pCS2-EGFP a fost furnizat cu amabilitate de Dr. Masa Tada. Construcția inductibilă a Cx43Tail a fost preparată prin fuzionarea cx43-20ktail (aa 219-379) la domeniul de legare a ligandului GR uman (aa 512-777). Cx43-20k a fost clonat în 5 ‘Ecori/3’ saci și GR în 5 ‘saci/3’ Xhoi de pCS2+ și pCS2-EGFP. Construcțiile BTF3 au fost sintetizate folosind X. secvența laevis din clona ADNc (Id UniGene XL. 3536). BTF3FL (aa 1-162) a fost clonat în 5 ‘Ecori/3’ Xhoi de pCS2+ sau pCS2-EGFP. Construcția de ștergere BTF3 lipsită de regiunea NLS RRKKK (BTF3-dNLS, aa 1-158) a fost clonată în 5 ‘Bamhi/3’ Clai de pCS2+. Pentru experimentele BiFC (Fig. 4b, c), Cx43Tail și Cx43Trunc au fost clonate în 5 ‘Bamhi/3’ Bamhi de pCS2-VC155. Btf3fl a fost clonat în 5 ‘Bamhi/3’ Bamhi de pCS2-VN9m. vectorii BiFC au fost furnizați cu amabilitate de profesorul James C. Smith. Toate secvențele de construcție sunt verificate prin secvențierea automată a ADN-ului (Source Biosciences, MAREA BRITANIE). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); 213 CX43 (800 pg/embrion,63).

toate analizele privind construcțiile fluorescente au fost evaluate prin normalizarea la fluorescența de fond și, atunci când a fost necesar, la fluorescența totală a suprafeței celulare.

au fost utilizați următorii reactivi: acidul flufenamic (50 µM pentru NC explant de incubație −de pana la 100 µm pentru embrion de tratament, Sigma, F9005), acid meclofenamic (50 µM pentru NC explant de incubație −de pana la 100 µm pentru embrion de tratament, Sigma, M4531), actinomicină D (20 µM, Sigma, A1410), CHX (10 µM, Sigma, C7698) și etanol-a dizolvat dexametazona (10 µM) a fost adăugat în mediul de cultură în etapele 14-15 și a menținut până crestei neurale migratoare embrionare etape (etapa 23). Pentru a controla posibila scurgere a himerelor inductibile, un lot frate de embrioni a fost cultivat fără dexametazonă și prelucrat pentru hibridizare in situ. Pentru testul de cuplare (testarea activității canalului de joncțiune gap), au fost analizate 10-15 NCCs pe condiție pe experiment.

Imunoprecipitare, fracționare și western blotting

pentru fiecare afecțiune au fost utilizați 10-15 embrioni pentru prepararea embrionilor lizați per experiment. Embrionii întregi au fost pregătiți pentru western blot după omogenizare în tampon de liză (20 mm Tris, 100 mM NaCl, 0,01% Triton-X, pH 8,0) cu inhibitori de protează adăugați (Roche, 11836153001) și inhibitori de fosfatază (Roche, 04906837001)54,64. Pentru western blots, au fost utilizați următorii anticorpi: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); pe scurt, celulele au fost suspendate în tamponul de liză și centrifugate la 20.000 de centi g timp de 5 min la 4 centi C, supernatantul a fost recuperat și volumul ajustat cu tamponul de diluare. Perlele au fost echilibrate în tamponul de diluare și amestecate cu lizatul celular omogenizat. Amestecul a fost purificat magnetic și pregătit pentru western blot. Izolarea fracției nucleare a embrionilor X. laevis a fost efectuată utilizând protocoale de centrifugare diferențială cu modificări64, 65. Pe scurt, etapa 18 X. laevis embrioni lizați folosind un ac de 22 G și tampon de omogenizare de 20 de ilqull (HB: 250 mm zaharoză, 20 mm Hepes, 10 mm KCl, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 1 mM DTT, inhibitori de fosfatază și protează) pe embrion. Toate probele au fost centrifugate la 250 g pentru 5 min pentru a îndepărta resturile embrionare. După colectarea supernatantului, acesta a fost distribuit în trei tuburi diferite și s-a rotit la trei viteze diferite (400 XTX g, 600 XTX g) timp de 5 min pentru a izola nucleele celulare. Supernatanții postnucleari au fost păstrați pentru prelucrare ulterioară. Peletele nucleare au fost spălate încă o dată în tampon HG și centrifugate la viteza corespunzătoare (400 g, 600 g). Peletele nucleare au fost apoi resuspendate în 40 xqql 10% glicerol/0,1% SDS/1% Triton-X în HB. S-a adăugat o cantitate adecvată de tampon de probă la fiecare probă, iar probele au fost prelucrate pentru electroforeza în gel de acrilamidă și analiza western blot. Pentru a evita erorile de încărcare, aceeași membrană a fost ștearsă împotriva controlului de încărcare după stripare,așa cum este descris înainte54, 64.

datele Western blot au fost analizate folosind instrumente de analiză ImageJ. Intensitățile imaginii au fost normalizate și raportul dintre proteina de interes și controlul încărcării (adică. S-a calculat, s-au calculat raporturile medii. Bloturile neacoperite sunt incluse ca figuri suplimentare (smochine suplimentare. 5–7).

culturi celulare

celulele HeLa (colecțiile de microorganisme și culturi celulare ale Institutului Leibniz, Dsmz, Germania) au fost cultivate în DMEM suplimentat cu 10% ser de vițel fetal (Life Technologies, ca, SUA) la 37 CTC într-o atmosferă umidificată de 10% CO2 și transfectat conform indicațiilor folosind Rotifect (Carl Roth, Germania) conform instrucțiunilor producătorului.

fibroblastele embrionare Xenopus (XTC, un fel de cadou de la Ana Losada) au fost cultivate în 67% DMEM/H2O suplimentat cu 10% ser de vițel fetal la 25% C într-o atmosferă umidificată de 5% CO2 și transfectate conform indicațiilor folosind Viafect (Promega, SUA). Plasmidele pentru transfecție au fost cele indicate și au fost analizate 10-20 celule Hela sau XTC pentru fiecare afecțiune pe experiment.

pentru experimentele siARN, o combinație de trei siARN orientate împotriva BTF3 au fost transfectate așa cum este descris mai sus. Un siRNA standard (scrambled siRNA de la Sigma) a fost folosit ca control. Numărul de Catalog pentru aceste siRNA comerciale împotriva BTF3 sunt: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. Celulele au fost colectate la 48 de ore după transfecție și prelucrate pentru qPCR, western blot sau experimente imunohistochimice. Așa cum este descris în secțiunile respective.

toate liniile celulare au fost testate pentru contaminarea cu micoplasme.

imunohistochimie și colorare cu faloidină

pentru detectarea proteinelor, celulele mamiferelor sau explantele crestei neuronale au fost fixate în 4% formaldehidă în 0,2% PBS-T (PBS + 0,2% Triton X-100) timp de 10 minute și blocate cu 10% NGS timp de 1 oră. Anticorpii primari au fost incubați la 4 centimetri C în 10% NGS. S-au utilizat următorii anticorpi: 1/100 anti-BTF3 (Abcam, ab107213), 2,5 hectolitri/ml de anti-n-cadherin (MNCD2 Developmental Studies Hybridoma Bank) și 1:100 anti-Cx43 (Sigma, C6219) în 10% NGS și incubați pe la 4 C. Explantele au fost spălate de 3 ori cu PBS + 0,2% Tween-20 și incubate pe la 4 C cu anticorp secundar, diluat la 1:350 în 10% NGS. DAPI a fost diluat la 1: 1000 și amestecat cu anticorpii secundari.

spectrometrie de masă

pentru co-imunoprecipitarea Cx43Tail-ului marcat cu pavilion pentru analiza spectrometrică de masă, celulele au fost lizate și lizatele au fost incubate peste noapte cu bile anti-HA și echilibrate cu afinitate ridicată la 4 CTC, imunoprecipitatele au fost apoi spălate și elutate27. Ulterior eluției acide cu 0,1 m glicină pH 2,5, pH-ul eluaților a fost ajustat la pH 8,0 cu 0,5 m Tris. Pentru digestia proteinelor, probele au fost incubate peste noapte cu 2 tripsină (tripsin Gold, Promega, SUA), urmată de adăugarea a 0.1 Lys-c (Roche, Germania) și incubare pentru încă 6 h. peptidele au fost desalinizate pe vârfuri de fază inversă C-18 (Nest Group, SUA), uscate în vid și depozitate la -20 C până la analiză. Amestecurile de peptide uscate au fost recuperate în acid formic 3-30% și diluate cu apă până la 23-23-L. Au fost injectate cinci unqq din digest pe un sistem Nano-LC (Eksigent425 2D Nano-LC; Sciex, SUA), iar peptidele au fost separate prin cromatografie de fază inversată pe coloanele C-18 preparate in-house (Reprosil-Pur C18-AQ, 1,9 unktomm, Dr.Maisch, Germania, coloane PicoFrit, 75 unktom i.d., New Obejctive, SUA) într-un gradient liniar de 100% eluent a (0,1% acid formic) până la 55% eluent B (60% actenitril, 0,1% acid formic) în 120 min. Sistemul LC a fost configurat ca coloană ventilată, iar eșantionul a fost încărcat și desaltat la un debit de 400 nl/min, iar separarea a fost efectuată la un debit de 200 Nl/min. Sistemul nano-LC a fost cratimat la spectrometrul de masă (Q-Exactive HF, ThermoScientific, Germania) care a fost operat în modul dependent de date. Interpretarea datelor a fost realizată cu Mascot V2.2 (Matrixscience, UK) și Progenesis LC–MS V4.1 (neliniar Dynamics, UK). Interpretarea datelor a fost efectuată cu MaxQuant V1.6.1.0 și Perseus V1.6. 1. 3 (MPI de Biochimie, Germania).

testul de cuplare

comunicarea intracelulară a joncțiunii Gap a fost testată folosind un test de cuplare a colorantului. Aici a fost folosit colorantul fluorescent Calcein-AM (Sigma, 17783). O populație de creastă neuronală disecată din embrioni neinjectați a fost incubată cu colorantul Calcein-AM timp de aproximativ 10 minute sau până când colorantul a fost încărcat în toate celulele. O altă populație de creastă neuronală din embrioni injectați cu un marker nuclear (injecții cu ARNm nRFP, vezi mai sus) a fost disecată separat. După ce cele două populații au fost disociate în absența calciului și a magneziului, acestea au fost amestecate și incubate timp de 1 oră la 14 centi C într-o eprubetă. După centrifugare ușoară, explantele crestei neuronale au fost tăiate în bucăți de dimensiuni similare și cultivate așa cum este descris mai sus și apoi filmate. Pentru a testa activitatea canalului joncțiunilor gap, s-au utilizat blocante de joncțiune gap; acid meclofenamic (Sigma, M4531) și acid flufenamic (Sigma, F9005). Comunicarea celulară a fost evaluată prin estimarea raportului dintre numărul de celule care afișează ambii marcatori, markerul nuclear și Calceina și numărul total de celule care au markerul nuclear.

analiză statistică

estimarea mărimii eșantionului s-a făcut în urma lucrărilor publicate anterior și nu s-a utilizat nicio metodă statistică specifică. Experimentele nu au fost randomizate și datorită naturii experimentelor, autorii nu au fost orbiți de alocare în timpul ambelor experimente și analiza rezultatelor. Au fost analizați doar embrioni și explante viabile. Embrionii injectați greșit nu au fost incluși pentru experimentele de hibridizare in situ. Injectarea corectă a fost determinată prin injectarea de trasoare liniare. Parametrii noștri experimentali au fost măsurați la întâmplare odată ce au fost selectați embrioni viabili și injectați corespunzător.

Compararea procentelor a fost efectuată utilizând tabele de contingență66. Normalitatea seturilor de date a fost testată folosind testul lui Kolmogorov–Smirnov, testul lui D ‘ Agostino și Pearson și testul lui Shapiro–Wilk folosind Prism6 (GraphPad). Seturile de date după distribuția normală au fost comparate cu testul T al elevului (cu două cozi, varianțe inegale) sau ANOVA cu comparațiile multiple ale lui Dunnett post – test folosind Excel sau Prism6 (GraphPad). Seturile de date care nu au urmat o distribuție normală au fost comparate folosind testul lui Mann Whitney sau un ANOVA neparametric (Kruskal Wallis cu comparațiile multiple ale lui Dunn post-test) folosind Excel sau Prism6. Comparațiile încrucișate au fost efectuate numai dacă valoarea totală P A ANOVA a fost mai mică de 0,05. În toate legendele figurilor N = numărul de experimente independente; n = dimensiunea totală a eșantionului.

X. laevis n-cadherin identificarea promotorului parțial

pentru a identifica promotorul de bază al Xenopus n-cad am folosit următoarea strategie. Regiunea promotor de bază din genele n-cadherin de pui și mamifere a fost descrisă în regiunile 5′-UTR, în poziția -3000 până la -1 bp respectă site-ul de inițiere a traducerii41,67. Folosind resursa X. laevis Genome Project (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/) am identificat o regiune de 2800 bp în 5′-UTR a genei X. laevis n-cadherin (Fig suplimentar. 4). Deoarece datele noastre indică faptul că Cx43Tail, BTF-3 și Pol II formează un complex, folosim ElemeNT tool68 pentru a căuta cutii TATA potențial active în regiunea pe care am izolat-o. Analiza noastră in silico dezvăluie o regiune bogată în cutie TATA între pozițiile -166 până la -618 bp, în raport cu site-ul de pornire a traducerii (Fig suplimentar. 4). În cele din urmă, proiectăm grunduri suprapuse pentru a amplifica fragmente de 200 bp în această regiune. Secvențele de primeri sunt enumerate în secțiunea cip și regiunile lor de legare sunt evidențiate în Fig suplimentar. 4.

imunoprecipitarea cromatinei (cip)

pentru imunoprecipitarea cromatinei (cip), am urmat o procedură standard pentru embrionii X. laevis69,70. Pentru fiecare experiment independent am folosit două replici tehnice și 250-300 embrioni Xenopus per condiție. Pe scurt, embrionii X. laevis în stadiul neurulei au fost fixați timp de 15 minute și au fost utilizați 3 centigg de anticorp Pol II (Diagenode, C15100055) sau anticorp de tip cip GFP (Abcam, ab290). Pentru extragerea ADN-ului am urmat un protocol standard69,70. Folosind resursa de analiză a elementelor, am căutat cutii tata presupuse în X. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5′ – GCCAAGTTTTCCCTTTTGTTGT-3′,

P8F: 5′ – GGAAGCAAATGCTTTTTCTGTC-3′,

P8R: 5 ‘- AGTCTGCTTTAGGAGACAACG-3 ‘

și locurile lor relative de legare sunt prezentate în Fig suplimentar. 4B. experimentele cu cipuri au fost cuantificate după cum urmează: raportul normalizat al intensității benzii pentru fiecare condiție a fost mediat și creșterea pliului respect controlul IgG a fost calculat și reprezentat ca îmbogățire a pliului. Intensitatea Band a fost înregistrată prin utilizarea plugin-ul de analiză geluri ImageJ. Gelurile neacoperite sunt prezentate în Fig. 7c, d.