genomica comparativă a Clostridium bolteae și Clostridium clostridioforme dezvăluie proprietăți genomice specifice speciilor și numeroși determinanți presupuși ai rezistenței la antibiotice

caracteristicile generale ale genomilor dezvăluie variații intra și interspecii

un total de 1 până la 21 de contiguri generat din asamblarea citirilor de la Illumina (acoperire de 134 până la 185 de ori) pentru cele șase tulpini de C. bolteae (Tabelul 1). Au fost generate în total 10 până la 48 de contiguri (acoperire de 82 până la 264 de ori) pentru cele șase tulpini de C. clostridioforme. Dimensiunea totală a genomului a variat între specii și tulpini. Dimensiunea C. bolteae a variat de la 6159 kb pentru tulpina 90A7 la 6480 kb pentru tulpina 90B3 cu 5833 și 6059 secvențe de codificare a ADN-ului (CDSs), respectiv, și patru 16S ARNr gene. Dimensiunea genomului C. clostridioforme a fost mai mică, de la 5467 kb pentru tulpina 90a3 la 5970 kb pentru tulpina 90A6 cu 5231 până la 5916 CDSs, respectiv, și patru gene 16S rRNA. Arborele filogenetic bazat pe secvențele ARNr 16S a arătat că C. bolteae și C. clostridioforme studiate au fost strâns legate de C. hathewayi, C. aldenense, C. citroniae, C. saccharolyticum și C. symbiosum, membri ai cluster-ului Clostridium XIVa al Firmicutes, așa cum au fost raportate anterior (datele nu sunt prezentate).

genomii C. bolteae și C. clostridioforme sunt genomi mari, unde redundanța genetică este predominantă (datele nu sunt prezentate). Genele redundante au fost implicate într-o varietate de căi metabolice, inclusiv metabolismul carbonului, transportul, metabolismul fierului și biosinteza aminoacizilor. Diferențele în numărul de CDSs între genomi au reflectat variația redundanței genetice mai mult decât câștigul sau pierderea anumitor funcții. În plus, genomii au integrat elemente mobile, adică transpozoni, secvențe de inserție, plasmide sau fagi (integrază, proteină capsidă,…) indicative ale transferurilor laterale ale genelor. Unii dintre ei purtau gene de rezistență antimicrobiană (vezi mai jos).

pentru a examina pangenomul celor două specii, am comparat cele 97.210 CDSs obținute din cele 12 genomuri nou secvențiate cu cele ale altor cinci genomi (C. bolteae BAA613, C. bolteae WAL-14578, C. clostridioforme CM201.1, C. clostridioforme 2149faa.1, și C. clostridioforme WAL-7855). Toate CDSs au fost grupate folosind algoritmul BlastClust la o stringență ridicată, peste o întrerupere a identității secvenței de 90% și o suprapunere de 90% lungime. Au fost găsite în total 10.530 de clustere. Doar 2294 (21,78%) clustere au fost împărtășite de cele două specii.

în utilizarea doar a genomurilor nou secvențiate, am estimat genomul de bază (specie) și genele (specifice tulpinii) celor șase C. bolteae și cele șase C. clostridioforme (Tabelul 1). Un total de 3714 gene au format genomul de bază al lui C. bolteae. Numărul de gene specifice tulpinii din această specie a variat de la 73 la 846. În C. clostridioforme, 3660 de gene au definit genomul de bază. Un total de 2409 clustere au fost împărtășite de cele două specii; 1305 gene au fost specifice C. bolteae și 1251 la C. clostridioforme.

C. bolteae 90A7 și 90B8 au avut cel mai mare număr de gene unice pentru această specie (735 și, respectiv, 846). C. clostridioforme 90A8, cu 1006 (17%) gene unice au avut cel mai mare număr de gene specifice tulpinii în acest studiu. Aceste tulpini au integrat un număr mare de elemente mobile. Unele CDSs unice au fost adnotate ca transportatori sau autorități de reglementare. Puțini dintre ei au fost implicați în mecanisme de apărare (gene de rezistență antimicrobiană..) sau căi metabolice. Cele mai multe dintre ele, adesea înconjurate de CDSs din fagi sau transpozoni, aveau funcții necunoscute (datele nu sunt afișate).

diferențe funcționale între specii în genomul de bază

provocarea studiului nostru a fost de a furniza informații fiabile din genomul de proiect. Prin urmare, ne-am concentrat analiza asupra genomurilor de bază. Clasificarea CDSs în funcție de sistemul Clusters of Orthologous Groups (COGs) a permis să ofere o imagine de ansamblu asupra funcțiilor afișate de cele două specii. Genomul de bază al lui C. bolteae și C. clostridioformele au fost îmbogățite (peste 7% din numărul total de potrivire a COG) în categoriile COG K, E, G și R în raport cu transcripția (309 și 290 CDSs), transportul și metabolismul aminoacizilor (335 și 276 CDSs), transportul și metabolismul carbohidraților (431 și 425 CDSs) și predicția generală a funcțiilor (366 și 331cdss) (Tabelul 2).

în timp ce C. bolteae și C. clostridioformele sunt legate fenotipic, modelul funcțiilor obținute prin modificarea adnotării COG diferă între cele două specii (Tabelul 2). 30 de CDSs suplimentare ale transportului și metabolismului nucleotidelor (F), 97 CDSs ale transportului și metabolismului aminoacizilor (E) și 79 CDSs care codifică categoriile mecanismelor de transducție a semnalului (T) au fost specifice pentru C. bolteae. 40 CDSs pentru biogeneza peretelui celular/membrană/înveliș (M), 50 CDSs pentru replicare, recombinare și reparare (L) și 18 CDSs pentru transportul și metabolismul lipidelor (I) au fost specifice pentru C. clostridioforme. Diferențele dintre căile metabolice în C. clostridioforme și C. bolteae par a fi suficient de mari pentru a susține delimitarea speciei.

dintre căile de carbohidrați, C. bolteae și C. clostridioforme au adăpostit diferite sisteme de asimilare a lactozei, care diferă în ceea ce privește stările de fosforilare, metaboliții intermediari și bioenergetica (fișier suplimentar 1: Tabelul S1). La ambele specii s-au găsit gene care codifică o lactoză-galactozidază, care hidrolizează lactoza producând glucoză și galactoză. O cale catabolică alternativă a lactozei, sistemul fosfotransferazei dependente de lactoză/celobioză (lac/cell-PTS) a fost găsit în aproape toate genomii C. bolteae. Operonul lac / cell-PTS, descris anterior în C. acetobutylicum, este format din gene pentru 6-fosfo-inkt-galactozidază, fosfoglicerat mutază și antiterminator transcripțional operon lichenan și din două copii ale genelor pentru componentele lactozei/celobiozei din familia IIC, IIB și IIA. Printr-un astfel de sistem, lactoza este fosforilată la carbonul C-6, iar lactoza 6-fosfat internalizată este degradată în galactoză 6-fosfat și glucoză de către 6-fosfo-galactozidază. În plus, gena pentru 6-fosfo-galactozidază și genele pentru componentele familiei lactoză/celobioză lipseau în C. bolteae 90a7. Este probabil ca acest sistem, inductibil de celobioză sau lactoză și reglat de mai mulți represori (descriși în alte bacterii Gram pozitive ) să reprezinte fenotipul lactoză-negativ din C. bolteae . Folosind sistemul nostru de adnotare, am detectat un represor de operon galactoză (GalR) în rândul regulatorilor familiei lacI, în C. clostridioforme (toate, cu excepția 90A8), dar nu în C. bolteae. Sunt necesare experimente de laborator pentru a determina modul în care factorii de transcripție din cele două specii mediază preferințele în utilizarea anumitor carbohidrați față de altele.

alte caracteristici distinctive între cele două specii au fost CDSs care codifică biosinteza și transportul metaboliților secundari și catabolismul, care au fost găsite doar în C. bolteae (Tabelul 2).

interesant, numărul de gene din categoria motilității și secreției celulare (N) (34 și 18 CDSs) a fost diferit între cele două specii. Printre acestea, am găsit CDSs care codifică motilitatea flagelului recunoscut ca factori esențiali de virulență pentru majoritatea agenților patogeni mobili. În general, douăzeci și patru de gene (46 clustere + 3 orfani) au reprezentat operonul flagelar în genomul lui C. bolteae. Dintre acestea, genele pentru flagelină (fliC) și capacul flagelar (fliD), una dintre adezinele multiple de suprafață celulară ale bacteriilor, au evidențiat specificitatea clusterului și microevoluția. Genele care codifică fliD au fost reprezentate de un cluster și două gene suplimentare în C. bolteae 90A7 și 90b8. Secvențele FliC din C. bolteae 90A9, 90B3 și 90B8 au format un cluster, cele din 90A5 și 90B7 grupate într-un alt grup, iar secvențele din C. bolteae 90a7 au rămas orfane (gene unice) după grupare (Fig. 1). Au fost strâns legate de secvențele de flagelină ale C. citroniae și C. hathewayi, alte Clostridium spp. din grupul XIVa, izolat ocazional de infecții umane. În plus, C. bolteae 90A9 și 90B3 au împărtășit un al doilea operon de doar 19 gene în syntheny, inclusiv o genă flagelină (flaA) strâns legată de cele ale C. clostridioforme (63% identitate). Pe baza reziduurilor conservate L87, Q88, R89 și Q96 critice pentru semnalizarea TLR5 și polimerizarea flagelinei, s-a prezis că aceste proteine au proprietăți proinflamatorii . În C. clostridioforme, douăzeci de gene (alte 57 de clustere) organizate într-un singur operon au codificat aparatul flagelar. Secvențe FlaA din C. clostridioforma a aparținut unui grup filogenetic strâns legat de secvențele de flagelină din Eubacterium cellulosovens izolate din rumen. În general, genele flagelinei și organizarea loci legate de flagel au fost diferite între specii (fișier suplimentar 2: Tabelul S2 și fișier suplimentar 3: tabelul S3), sugerând că motilitatea, chemotaxia și apariția interacțiunilor potențiale cu mucoasa colonului sunt specifice speciilor .

arborele filogenetic bazat pe distanță al genelor flagelinei. Valorile la noduri corespundeau procentelor de bootstrap obținute din arbori filogenetici pe baza aliniamentelor succesive multiple de către ClustalW, Tcoffee sau, respectiv, Promals. Au fost indicate numele genelor și numerele orfane sau de cluster

diferențele speciilor în căile de sinteză a butiratului

Compararea secvențelor genomului întreg a arătat că căile de sinteză a butiratului, care joacă un rol cheie în sănătatea colonului la om, au fost prezente în C. bolteae și C. clostridioforme.

cele două specii au fost producători de butirat prin moduri diferite și complementare (Fig. 2, fișier suplimentar 4: tabelul S4). Toate C. clostridioforme, cu excepția 90A8, au purtat un locus care codifică calea acetil-CoA (de la acetil-CoA la butiril-CoA), inclusiv gene pentru beta-hidroxilbutirilcoa dehidrogenază (hbd), tiolază (thl), crotonază (cro), butiril-CoA dehidrogenază (bcd) și două proteine de transfer de electroni (ETF alfa, ETF beta) (fișier suplimentar 4: tabelul S4). Numai C. bolteae 90A8 și C. clostridioforme 2149FAA.1 conținea un alt bcd presupus (74.9% identitate) în genomul lor (datele nu sunt afișate). Compoziția și dispunerea locusului au fost similare cu cele din Faecalibacterium prausnitzii, un producător major de butirat al intestinului gros uman . Calea acetil-CoA nu a fost găsită în C. bolteae. Ambele specii au împărtășit gene pentru cele două hidroxi-glutaril-CoA dehidrogenază (HgCoAd) și glutaconil-CoA decarboxilază (Gcd) din calea Glutaratului care poate duce la crotonil CoA și la butiril-CoA prin genele bcd .

diferite căi de sinteză a butiratului potențial prezente în genomii C. clostridioforme și C. bolteae. În linii solide: găsite în C. bolteae și C. clostridioforme ; în linii punctate aldine : găsite numai în C. clostridioforme; în linii punctate fine : găsite numai în C. bolteae 90A5 și 90B7 (pentru mai multe detalii, consultați fișierul suplimentar 4: tabelul S4). Sunt afișate gene (nume de proteine). Ato, acetil-CoA acetiltransferază; Bcd, butiril-CoA deshidrogenază; Buk, butirat kinază; dar, butirat-acetoacetat CoA-transferază ; Cro, crotonază ; ETF, proteină de transfer de electroni ; Gcd, glutaconil-CoA decarboxilază; Hbd, Acetoacetil-CoA reductază; 4hbt, 4-hidroxibutirat CoA transferază ; HgCoAd, 3-hidroxibutiril-CoA dehidrogenază ; Ptb, fosfat butiriltranferază; Thl, tiolază

conversia finală de la butiril-CoA la butirat poate fi efectuată de butirat kinaza (buk) și fosfotransbutirilaza (ptb) prezentă la ambele specii (fișier suplimentar 4: tabelul S4). Grupul de secvențe buk din C. clostridioforme s-a ramificat în vecinătatea secvenței buk din C. citroniae pe arborele filogenetic (fișier suplimentar 5: Figura S1). Secvențele Buk din C. bolteae au format grupuri monofiletice distincte și secvențe distribuite între arborii filogenetici, sugerând polimorfism și / sau variații funcționale ale enzimei la această specie. Alte gene pentru transferazele din calea lizinei (subunitatea ato—alfa și beta ; dar—acetat CoA transferază), detectate în apropierea locusului butirat în șase genomi ai C. clostridioforme, pot fi implicate ca enzime finale. Genele din calea 4-aminobutiratului (4hbt) pot fi o altă alternativă pentru etapa terminală din C. bolteae 90A5, 90B7, WAL14578 și BAA613 .

butiril-CoA:acetat de COA-transferază (dar) a căii acetil-CoA, ultima etapă în producția de butirat predominantă în Clostridium XIVa, nu a fost găsită nici în genomii nucleului comun, nici în genomii C. bolteae studiați . În intestinul uman, studiile anterioare asupra izolatelor colonice ale indivizilor sănătoși au ilustrat că dar calea predomină . Sunt necesare studii suplimentare pentru a evalua impactul producției de butirat prin calea Glutaratului asupra sănătății celulelor colonului, în special în autism unde C. bolteae este supraabundent .

identificarea determinanților rezistenței la antibiotice

genele de rezistență la medicamente care nu au fost recunoscute prin adnotare automată au fost identificate prin cercetarea secvenței omologice pe ARDB. Genele de rezistență au fost prezise pe o valoare de până la 40% identitate (50% din substituțiile pozitive) pe 70% din lungime peste valoarea limită recomandată de obicei (vezi lista din tabelul 3). Apoi, conținutul genei și organizarea genetică a locilor de rezistență microbiană a celor șase C. bolteae și a celor șase C. clostridioforme au fost comparate cu datele anterioare obținute de la C. clostridioforme CM201.1 în laboratorul nostru.

deoarece predicțiile bazate pe secvențe ar putea identifica factorii determinanți care nu duc la rezistență antimicrobiană, s-au efectuat teste de susceptibilitate pentru a obține informații despre răspunsul prezis al bacteriilor la antibiotice. Tulpinile incluse în acest studiu au prezentat modele de rezistență, inclusiv ampicilină, macrolide, lincomicină și chinolone, acum frecvente în anaerobi (Tabelul 4). Atât datele genomice (CDSs și adnotări), cât și testele de susceptibilitate fenotipică au fost luate în considerare pentru a identifica determinanții rezistenței la antibiotice (Tabelele 3 și 4). Testele preliminare pentru clonarea anumitor gene au fost, de asemenea, efectuate pentru a verifica capacitatea lor de a conferi rezistență la antibiotice (vezi mai jos).

gene de rezistență la antibiotice utilizate pentru tratamentul infecțiilor anaerobe

au fost identificate un total de 76 de grupuri și 21 de gene specifice tulpinii potențial implicate în rezistența antimicrobiană (Tabelul 3). Este inclus de la 42 la 50 CDSs în C. bolteae și 48 la 58 CDSs în C. clostridioforme. De la 27 la 42 CDSs per genom au fost legate de mecanismele de rezistență la medicamente la beta-lactame, glicopeptide, macrolide, lincosamide și metronidazol.

șapte clustere implicate în rezistența beta-lactamică sunt partajate sau fac parte din genomul de bază al celor două specii (Fig. 3). Trei tipuri de beta-lactamaze, inclusiv clasa a beta-lactamază, clasa C beta-lactamază, clasa D beta-lactamază și mai multe metalo-enzime au fost recunoscute în cele douăsprezece genomi. Toate tulpinile studiate, selectate pentru rezistența lor la ampicilină, au împărtășit gena blaCLO1, găsită anterior în C. clostridioforme CM201.1 (nepublicată), dar structura elementului conjugativ integrativ (ICE) observată în CM201.1 nu a fost găsită în noile genomuri secvențiate. Gena blaCLO1 conferă rezistență la aminopeniciline și carboxipeniciline în E. coli, iar activitatea sa este inhibată de clavulanat și sulbactam. Nouă modificări ale aminoacizilor au fost observate în beta-lactamazele C. bolteae 90A9, 90B3 și 90a8. Această beta-lactamază strâns legată a fost flancată de secvențe de inserție (IS66) și o genă presupusă pentru beta-lactamaza de clasă D (COG 2602) descrisă și în Clostridium sp M62/1 din microflora intestinală umană (proiectul HMP). Genele pentru beta-lactamazele din clasa C, găsite anterior în cromozomii bacteriilor enterice (COG2680), au fost de asemenea prezente în C. bolteae și C. clostridioforme.

distribuția genelor de rezistență la antibiotice partajate între și în interiorul miezului C. bolteae și C. clostridioforme. Genele care se suprapun cu cel puțin 90% lungime și 90% din similitudine au fost considerate omologi. Genele de rezistență au fost prezise pe o valoare de până la 40% identitate (50% din substituții pozitive) pe 70% din lungime prin cercetarea secvenței omologice pe ARDB. Pentru toate C. clostridioforme și unele C. bolteae 23S ARNr metiltransferază asemănătoare Cfr

un număr mare de gene prezise (32 CDSs) au fost implicate în rezistența la glicopeptide (fișier suplimentar 6: Figura s2). C. clostridioforma 90A8 a fost singura tulpină cu toate genele necesare pentru rezistența glicopeptidelor în concordanță cu fenotipul (MIC > 256 mg/l). Rezistența la vancomicină în această tulpină a fost atribuită unui operon de tip VanB suportat de un element asemănător Tn1549. Din păcate, o ștergere a zece nucleotide din gena relaxazei Tn1549 duce la incapacitatea 90A8 de a transfera rezistența la vancomicină in vitro . Celelalte genomuri ale C. clostridioforme au inclus o parte din operonul de rezistență la vancomicină de tip vand, dar gena d-Ala-Lac ligază vanD a fost perturbată de un codon stop care a dus la o proteină trunchiată (fișier suplimentar 6: Figura s2). În plus, vanH și vanY, care codifică O D-lactat dehidrogenază și, respectiv, o carboxipeptidază DD, lipseau. În mod similar, genomii lui C. bolteae a adăpostit patru CDSs, omolog al vanRG vanUG vanG vanYG, care a format un operon incomplet și nefuncțional din cauza lipsei unui serin racemază genă. Numărul mare de CDSs care codifică rezistența glicopeptidelor (inclusiv vanD sau vanG cunoscute a fi cromozomiale și netransferabile) găsite în genomii C. bolteae și C. clostridioforme, sugerează că fac parte din operoni întregi ancestrali, care au evoluat în absența presiunii selective a antibioticelor . Prezența van operonului incomplet este interesantă, dar observații similare în alte anaerobe care trăiesc în microbiomi, cum ar fi Clostridium difficile 630 sau ruminococcus spp., au fost raportate .

omologi ai genei adenililtransferazei care conferă rezistență la lincosamide, au fost prezenți în genomul de bază al ambelor specii (Fig. 3). Genele LnuA ale C. clostridioforme și C. bolteae au avut o identitate de 70 până la 72% cu ortologii găsiți în C. hathewayi și, respectiv, C. citroniae. C. clostridioforme 90B1 și 90A6 au adăpostit o genă LNU suplimentară (68% identitate cu LnuA90A5), fără urme de elemente mobile. Rezistența la lincomicină este frecventă în C. bolteae și C. clostridioforme, adesea asociată cu rezistența la clindamicină. Proteinele LnuA ale celor două specii au prezentat 51 până la 54% din identitatea cu Lnua din stafilococ sugerând funcționalitate comună, dar rolul genelor lnu este dificil de stabilit datorită prezenței altor mecanisme presupuse . În mod similar, toate tulpinile au fost rezistente la eritromicină, în timp ce două gene omologe genei ribozom metilazei eritromicinei, ermB, au fost prezise doar în genomul C. clostridioforme 90A4 și 90A8. Supraexprimarea pompelor de eflux multidrog și a sistemelor de eflux specifice macrolidelor și a diferitelor sisteme de eflux specifice macrolidelor-Lincosamidei-Streptograminei B, cum ar fi MacB, MefA, VgaA, MsrA/MsrB și CcmA (Tabelul 3, Fișier suplimentar 7: Figura S3), găsite în genomii studiați, pot duce la rezistență la macrolide și lincosamide . În plus, două grupuri de CDSs care codifică acetiltransferazele xenobiotice legate de VatB (48% identitate) au fost găsite în genomul de bază al fiecărei specii (Fig. 3). VatB inactivează virginiamicina, dar aici rezistența nu a fost detectată prin teste de susceptibilitate antimicrobiană (Tabelul 4).

un grup de omologi CDSs la genele de rezistență la metronidazol (nim) a fost detectat în genomul de bază al ambelor specii, iar metronidazolul a fost foarte activ la speciile studiate . În Bacteroides fragilis s-a demonstrat că expresia crescută a genelor nim în aval de elementele IS duce la rezistență la metronidazol . În lipsa este direct în amonte genele nim, mecanismul de conferire a rezistenței metronidazolului la C. bolteae și C. clostridioforme rămâne de stabilit.

observarea neașteptată a noilor gene de rezistență

în ceea ce privește alte rezistențe la medicamente, datele genomului au evidențiat gene legate de mecanismele de rezistență la cloramfenicol și rifampicină (Tabelul 3). În majoritatea genomilor fiecărei specii, am găsit CDSs care codifică un grup a cloramfenicol acetiltransferază care poate inactiva cloramfenicolul. Cu toate acestea, numai C. bolteae 90B3 și 90B8 au fost rezistente la cloramfenicol. Genomul tulpinii 90B8 conținea o a doua copie a genei cat suportată de un transpozon asemănător Tn4451 (identitate 96 și 90% cu Tn4451 și respectiv Tn4453). Genomul 90B3 conținea un omolog CDS la gena cfr care codifică o ARNr 23S metil-transferază răspândită în mare parte în bacteriile Gram-pozitive. Așa cum era de așteptat, tulpina 90B3 a fost, de asemenea, rezistentă la florfenicol, tiamulin și linezolid (MIC = 16 mg/l). Alte 23S ARNr metiltransferază (Cfr-like) CDSs au fost detectate într-un mediu bogat în elemente transpozabile (Tn 6103-6110-CTn4 ) în genomii C. clostridioforme și C. bolteae 90A5 și 90B7, dar metilarea ARNr nu pare să afecteze susceptibilitatea la cloramfenicol (Fig. 3).

analiza datelor genomice a permis recunoașterea omologilor CDSs la genele rifampin-ADP-ribosiltransferază (arr) în C. bolteae, dar nu în C. clostridioforme. Nu s-au găsit elemente mobile sau urme de elemente mobile în jurul genelor arr sugerând că erau indigene acestei specii. Aceste noi secvențe Arr s-au ramificat în vecinătatea proteinelor Arr din C. saccharoperbutylacetonicum și a unor cianobacterii pe arborele filogenetic (fișier suplimentar 8: figura S4). Acestea au fost distincte de proteinele Arr-2 ale Enterobacteriaceae și de proteinele Arr ale Mycobacterium și Streptomyces spp.. Toate tulpinile, cu excepția 90A7, au fost sensibile la rifampicină. În absența mutațiilor în rpoB (cunoscut a fi responsabil pentru rezistența la rifampicină), rezistența C. bolteae 90a7 (MIC: 32 mg/l) S-a datorat probabil selecției pozitive a mutațiilor în aar Cbol90A7. Susceptibilitatea la rifampicină a altor C. bolteae s-a datorat probabil lipsei de promotori în amonte de arr (conform previziunilor din analiza in silico) sau substituțiilor nucleotidice din cadrul arr care au condus la înlocuirea aminoacizilor și la inactivarea funcțională (datele nu sunt prezentate).

în ceea ce privește rezistența tuturor tulpinilor împotriva moxifloxacinei și ciprofloxacinei, toate tulpinile de C. bolteae au prezentat mai multe substituții în “regiunea determinantă a rezistenței chinolonei” (QRDR) a gyrB. Nu am găsit nicio substituție în această regiune pentru gyrA și nici descrisă în proteina tulpinii epidemice rezistente la chinolone, C. difficile 027 . Prin urmare, GyrB a fost probabil ținta preferată în dobândirea rezistenței la chinolone la aceste două specii. În plus, la toate tulpinile au fost prezente mai multe codificări CDSs pentru transportorul cu membrană interioară AcrB. Acești transportori fac parte dintr-o pompă de eflux multidrog cu diviziune de rezistență-nodulare, cunoscută pentru creșterea efluxului de chinolone la unele bacterii Gram-negative . Sunt necesare studii suplimentare pentru a determina influența lor în pierderea susceptibilității Clostridium spp. la fluorochinolone.

în general, profiluri de rezistență similare împotriva antibioticelor în C. bolteae și C. clostridioforme pot rezulta din diferite mecanisme.

gene de rezistență la antibiotice mai puțin active sau inactive împotriva Clostridium spp

genomii C. bolteae și C.clostridioformul a purtat una sau două copii ale genei undecaprenil pirofosfat fosfatază bacA și 2 până la 5 copii ale genelor pompei de eflux, bcrA, implicate în rezistența la bacitracină, în acord cu susceptibilitatea lor scăzută . De asemenea, am găsit un grup de CDSs omolog al genei dihidrofolat reductazei, dfrA20 (41% identitate / 97% lungime) de Pasteurella multocida în genomul de bază al ambelor specii care ar putea explica activitatea slabă a trimetoprimului pe Clostridium spp. . În plus, C. clostridioforme 90A6 adăpostea un CD identic cu dfrA de la Enterococcus faecium. Această genă detectată într-un mediu bogat în elemente mobile este în concordanță cu un nou exemplu de transfer orizontal între Enterococcus spp. și Clostridiales.

interesant, genomul C. bolteae sau C. clostridioforme conținea diferite gene de rezistență împotriva antibioticelor inactive în mod natural la aceste specii. Cinci CDSs au fost omologi ai genelor care fosforilează, acetilat sau adenililat aminoglicozide. Patru dintre aceste gene de rezistență presupuse au fost detectate într-un mediu de elemente mobile. Trei gene, AADE, sat4 și aph (3′)-III, care conferă rezistență la streptotricină, streptomicină și respectiv kanamicină, au fost găsite parte a unui transpozon delimitat de două copii IS1182 în C. clostridioforme 90A3 (două copii), 90A6 și 90b1. Aph(3′)-III detectat a fost identic cu aph (3′) – III, parte a plasmidei multidrog rezistente PF856 din E. faecium , de asemenea legat de un domeniu intern (99% identitate) al unui element SSCmec al Staphylococcus aureus HT20040085. În mod similar, gena aminoglicozidică 6-adenililtransferază ant (6′) – Ia, care conferă rezistență la streptomicină, a fost împărtășită de C. clostridioforme 90A1, 90A3 (2 exemplare), 90A4, 90A6 (2 exemplare) și C. bolteae 90A7. Gena adenililtransferazei aad (9′)-b care mediază rezistența la streptomicină/spectinomicină a fost găsită în C. bolteae 90B3. Două copii ale acetil transferazei AAC (6′)-Im au fost, de asemenea, prezente în genomul C. clostridioforme 90B1. Omologii AAC (6′) – Im care conferă rezistență la tobramicină și rezistență la Amikacină au fost, de asemenea, găsiți în E. coli (identitate 96%), Coprococcus sp, C. difficile și Enterococcus faecium (datele nu sunt prezentate). În plus, au fost observate și trei CDSs care codifică o aminoglicozid kinază (APH), cunoscută a fi distribuită pe scară largă în bacteriile Gram-pozitive, printre toate tulpinile .

numeroase gene de rezistență la tetraciclină au fost, de asemenea, detectate în C. bolteae și C. clostridioforme. Acestea includ atât gene de eflux, cum ar fi tet40, cât și determinanți de protecție a ribozomilor, cum ar fi tetO, tetW și tet32, raportate anterior ca circulând în microflora intestinală printre bacteriile înrudite la distanță .