informații minime pentru raportarea cu privire la testul cometei (MIRCA): recomandări pentru descrierea procedurilor și rezultatelor testului cometei

orientările MIRCA au fost elaborate de membrii HCOMET COST Action cu scopul de a îmbunătăți analiza și raportarea rezultatelor testului cometei (http://www.hcomet.eu/). Autorii sunt experți comet test cu un minim de opt ani de experiență cu aceste teste (15 dintre autori au >20 de ani de experiență relevantă). Am folosit un chestionar bazat pe internet pentru a eșantiona opiniile autorilor cu privire la importanța detaliilor de raportare (Tabelul 1; Date suplimentare). Fiecare informație a fost clasificată de autori ca ‘esențială’, ‘dezirabilă’ sau ‘neimportantă’, iar pentru clasificări s-a utilizat un prag de 75% congruență. În cazul în care numărul de răspunsuri privind informațiile esențiale nu a atins pragul de 75% de acord, răspunsurile privind informațiile esențiale și informațiile dezirabile au fost combinate, iar informațiile au fost clasificate drept informații dezirabile dacă 75% dintre autori au fost de acord că sunt fie esențiale, fie dezirabile. În tabelul 1, includem note explicative pentru fiecare recomandare.

recomandări specifice MIRCA pentru fiecare etapă a testului comet

pasul 1a: Izolarea celulelor și prepararea suspensiilor cu o singură celulă

deoarece testul comet utilizează suspensii de celule unice, specimenele care nu sunt obținute ca celule unice trebuie tratate mecanic sau enzimatic pentru a perturba atașarea celulelor la o matrice extracelulară sau una la cealaltă. Omogenizarea țesuturilor prin perturbare mecanică poate provoca ea însăși deteriorarea ADN-ului, în timp ce digestia enzimatică a țesutului poate duce la îndepărtarea leziunilor ADN datorită activității enzimelor endogene de reparare a ADN-ului sau la creșterea nivelului de deteriorare a ADN-ului prin eliberarea nucleazelor din celule. Compoziția tamponului de omogenizare este o informație’ dezirabilă’, în special în ceea ce privește componentele necesare pentru păstrarea integrității ADN-ului (de exemplu, acidul etilendiaminotetraacetic)24,25. O descriere a procedurii de izolare a suspensiilor monocelulare, inclusiv omogenizarea țesutului, este considerată a fi o informație de dorit pentru a fi raportată în articole.

probele de sânge sunt adesea utilizate în studiile de biomonitorizare umană. Deoarece sângele reprezintă o populație eterogenă de celule, informațiile detaliate despre populația celulară sunt esențiale în publicații. Textul ar trebui să descrie cu precizie dacă eșantioanele sunt sânge integral (inclusiv globule roșii), leucocite, celule sanguine mononucleare sau un subset de celule (de exemplu, limfocite). De asemenea, poate fi util să includeți informații despre procedura de venipunctură, tipul de anticoagulant și metoda ulterioară de izolare celulară (adică etapele de centrifugare și spălare) pentru cei care repetă experimentul, deci aceasta este clasificată ca informație de dorit. Informațiile privind condițiile de păstrare a celulelor sau țesuturilor în cazul în care acestea sunt crioconservate, precum și metoda de înghețare (de exemplu, înghețarea rapidă pe gheață uscată sau în azot lichid sau o procedură de înghețare lentă) și procedura de decongelare sunt considerate informații esențiale de raportat, deoarece s-a demonstrat că aceste procese afectează nivelul bazal al migrației ADN-ului26.

pasul 1b: Pregătirea celulelor substrat pentru testul in vitro de reparare a ADN-ului

orice tip de celulă eucariotă poate fi utilizat ca celulă substrat pentru testul in vitro de reparare a ADN-ului, iar tipul și densitatea celulei sunt informații ‘de dorit’ de raportat. Este esențial să se raporteze metoda și tipul compusului genotoxic utilizat pentru inducerea leziunilor ADN în celulele substratului și condițiile ulterioare de stocare a celulelor, în timp ce nivelul total al leziunilor ADN care pot fi detectate în celulele substratului (de ex., numărul de situsuri sensibile la formamidopirimidin ADN glicozilază din celulele tratate cu Ro19-8022 plus light) este considerat a fi doar informații dezirabile.

pasul 1C: controale de testare

în acest articol, controalele de testare se referă la eșantioane care sunt incluse în fiecare experiment de testare a cometelor; acestea sunt uneori numite standarde de referință, controale interne sau controale tehnice16,27. Controalele testului sunt de obicei alicote crioconservate dintr-un singur lot de celule care au fost expuse la un agent de rupere a catenei ADN (de ex., radiații ionizante, peroxid de hidrogen sau metansulfonat de metil) sau un tratament care provoacă un tip specific de leziune ADN (de exemplu, fotosensibilizatorul Ro19-8022 plus light sau tratamentul cu bromat de potasiu, pentru a induce oxidarea ADN-ului). Există diferite controale de testare pentru testul standard al cometei alcaline și testul cometei modificat de enzime. Compusul utilizat pentru testul modificat enzimatic nu ar trebui să genereze rupturi ale catenei ADN, deoarece acestea scad intervalul dinamic al situsurilor sensibile la enzime. În studiile de biomonitorizare, precum și în studiile transversale, intervenționale și clinice, celulele neexpuse pot fi utilizate ca controale de testare. Este esențial să se raporteze nivelurile de deteriorare în controalele de testare și variația testului (deviația standard) atât în testul comet standard, cât și în testul Comet modificat de enzime.

testul de reparare ADN in vitro utilizează controale experimentale interne, care sunt, de asemenea, utilizate în calculul activității de reparare, mai degrabă decât controalele de testare în sine. Este esențial să se raporteze nivelul inciziilor de reparare a ADN-ului în nucleoizi din (i) celulele substratului neexpuse incubate cu tampon de reacție, pentru a determina nivelul bazal al deteriorării ADN-ului în ADN-ul substratului (adică controlul de fond); (ii) celulele expuse incubate cu tampon de reacție, pentru a descoperi nivelul oricăror rupturi nespecifice ale catenei ADN sau situsuri abazice care rezultă din tratamentul cu agentul dăunător (adică controlul tratamentului); (iii) celule substrat neexpuse incubate cu extract proteic din eșantion, pentru a verifica activitatea nespecifică de incizie sau clivaj (adică ‘controlul specificității’); și (iv) celule substrat expuse incubate cu enzimă specifică leziunii, similar cu controalele de testare pentru testul Comet modificat enzimatic (adică ‘controlul reacției de incubație’).

pasul 1D: controale Negative și pozitive

în acest articol, controalele negative și pozitive se referă la grupurile experimentale, așa cum este descris în orientarea OCDE (TG 489) pentru testul in vivo al cometelor în țesuturile animale18. Astfel, controalele negative și pozitive se referă la întregul experiment. Un control pozitiv se referă la un compus genotoxic cu acțiune directă sau indirectă care produce pauze de catenă ADN sau site – uri sensibile la enzime detectate cu testul cometei. Pentru testul cometei modificat enzimatic, nu există nicio listă de controale pozitive disponibile care să corespundă compușilor enumerați de OCDE ca controale pozitive pentru testul cometei alcaline (pentru inducerea ruperilor catenei ADN) în țesuturile animale specifice. În plus, nu există un control pozitiv pentru studiile de biomonitorizare umană, deoarece persoanele sănătoase nu pot fi expuse în mod deliberat la un agent genotoxic. Controalele pozitive sunt deja considerate obligatorii în experimentele de cultură celulară în toxicologia genetică și vor fi de facto informații esențiale în articolele care utilizează testul comet. Cu toate acestea, în studiile pe animale, în scopuri practice, datele cometelor privind controalele de testare (adică., eșantioanele menționate în secțiunea de mai sus intitulată ‘etapa 1C, controale de testare’) sunt suficiente, în timp ce rezultatele controalelor negative și pozitive reale sunt considerate a fi doar informații ‘dezirabile’.

Pasul 2: încorporarea celulelor în agaroză

testul cometei a fost inițial dezvoltat folosind trei straturi de agaroză pe lamele de sticlă, stratul mijlociu conținând celulele. Cu toate acestea, stratul superior de agaroză nu este necesar și anumite proceduri nu utilizează un strat inferior (de exemplu, testele de film Gelbond). Este’ de dorit ‘ să se raporteze tipul de diapozitive și dimensiunea (i. e., suprafața) gelurilor, pe măsură ce proporția celulelor de lângă marginea gelului crește pe măsură ce dimensiunea gelului scade și ADN-ul din nucleoizii de la marginea gelului poate migra diferit de cel din nucleoizi spre centrul gelului22. Concentrația finală de agaroză (cu celulele încorporate în ea) este esențială pentru raportare, deoarece migrarea ADN-ului depinde de densitatea gelului.

Pasul 3: liza celulelor

există mai multe proceduri pentru lizarea celulelor în testul cometei. Informațiile despre compoziția soluției de liză sunt esențiale. O etapă suplimentară de incubare enzimatică (de exemplu, cu proteinaza K) poate fi necesară pentru anumite tipuri de celule, iar detaliile incubației ar trebui, de asemenea, raportate ca informații esențiale. Unele rapoarte sugerează că durata lizei poate afecta stabilitatea anumitor tipuri de leziuni ale ADN-ULUI28,29,30, astfel încât durata lizei și temperatura soluției de liză sunt informații de dorit de raportat.

pasul 4A: Tratamentul enzimatic reparator în testul Comet modificat enzimatic

deoarece soluția de liză poate inhiba activitatea enzimei reparatoare, este de dorit să se stabilească dacă s-a efectuat o etapă de spălare între etapa de liză și tratamentul enzimatic (adică compoziția tamponului de spălare, numărul de spălări și durata). Este esențial să se transmită informații despre sursa enzimelor reparatoare, deoarece s-a demonstrat că enzimele de la diferiți producători diferă atât în ceea ce privește activitatea, cât și specificitatea lor față de leziunile nucleobazice16. În majoritatea studiilor comet, experimentele cu curba de titrare sunt efectuate pentru a identifica condițiile optime pentru tratamentul enzimei31; cu toate acestea, rezultatele curbelor de titrare a enzimei sunt rareori raportate și sunt clasificate aici ca informații dezirabile (în schimb, s-ar putea face referire la un studiu anterior), deși considerăm că este esențial să raportăm durata și temperatura tratamentului. Concentrația de enzimă aplicată gelului este o informație esențială; este de preferat să se raporteze concentrația în unități enzimatice (U/ml), deși concentrația de proteine (mg / ml) este de asemenea utilă. Tipul de unitate de incubare (de exemplu, incubator, șanț glisant sau sistem cu 12 gel) și modul de incubare sunt informații de dorit de raportat. Trebuie precizat dacă incubația a fost efectuată (i) într-o baie de enzime sau cu o picătură și o lamelă pe diapozitiv, (ii) într-o versiune standard cu 2 gel, 12 gel sau sistem cu mai multe puțuri sau (iii) într-o cutie umidificată într-un incubator, pe o placă de încălzire sau într-un șanț cu tobogan încălzit.

pasul 4B: Pregătirea și incubarea extractului pentru testul in vitro de reparare a ADN-ului

este ‘de dorit’ să se raporteze numărul de celule sau masa de țesut utilizat pentru prepararea extractelor proteice, în timp ce este ‘esențial’ să se raporteze concentrația proteică finală a extractelor celulare sau tisulare care se adaugă ADN-ului substrat. Compoziția tamponului de extracție (informații dezirabile) este mai puțin crucială decât compoziția tamponului de incubație (informații esențiale), deoarece acesta din urmă poate afecta nivelul de fond al migrării ADN-ului. În conformitate cu informațiile pentru testul Comet modificat enzimatic, este de dorit să se raporteze rezultatele experimentelor de titrare sau ale studiilor anterioare de referință din același laborator, unde acestea au fost efectuate. Volumul de extract adăugat la celulele substratului încorporat în gel este o informație ‘de dorit’. Este esențial să se raporteze durata și temperatura perioadei de incubație, deoarece acestea afectează numărul de incizii reparatorii. În ceea ce privește testul Comet modificat enzimatic, modul de incubație este de dorit să fie raportat pentru testul de reparare in vitro. Informațiile privind identitatea enzimei utilizate ca control al reacției de incubație (indicând cantitatea de leziuni ADN din celulele substratului) și compoziția tamponului utilizat pentru nivelul de fond al inciziilor de reparare a ADN-ului în celulele substratului neexpuse sunt esențiale, deoarece sunt esențiale pentru a demonstra fiabilitatea activității inciziei de reparare a ADN-ului.

Pasul 5: Tratamentul alcalin

soluția cu pH alcalin ridicat perturbă legătura de hidrogen care ține firele ADN împreună și transformă, de asemenea, anumite leziuni nucleobazice în pauze ale catenei ADN. Astfel, durata tratamentului alcalin poate afecta nivelul migrației ADN în electroforeza ulterioară32, 33, 34. Informațiile specifice privind compoziția soluției alcaline, pH-ul, temperatura și durata tratamentului sunt astfel informații esențiale de raportat.

Pasul 6: electroforeza

cei mai importanți factori ai migrației ADN sunt durata electroforezei și potențialul electric (căderea de tensiune pe platforma rezervorului de electroforeză)35. Este esențial să se raporteze compoziția tamponului de electroforeză, rezistența electroforezei (gradient de tensiune (V/cm) pe platforma rezervorului de electroforeză) și durata electroforezei. Temperatura ridicată în timpul electroforezei poate afecta migrarea ADN-ului36; astfel, informațiile despre temperatura soluției de electroforeză sunt ‘esențiale’, iar acest lucru poate fi însoțit de descrieri ale măsurilor luate pentru a menține temperatura constantă (de exemplu, răcirea platformei sau circularea tamponului).

Pasul 7: Neutralizare

această etapă implică eliminarea excesului de soluție alcalină din lamele pentru a asigura o colorare eficientă. Este de dorit să se descrie compoziția soluției de neutralizare.

Pasul 8: colorarea și vizualizarea

coloranții de legare a ADN-ului au afinități de legare diferite la ADN și,prin urmare,pot afecta calculul descriptorilor primari de analiză a cometelor în software-ul de analiză a imaginilor diferit36, 37, 38. Tipul de colorant este o informație esențială, în timp ce concentrația este o informație de dorit, la fel ca și timpul dintre colorare și vizualizare. Intensitatea luminii de la diferite tipuri de lămpi de microscop diferă. În plus, variază în funcție de vârsta lămpii și de timpul în care a fost aprinsă în timpul notării cometelor. Cu toate acestea, nu există o procedură standard pentru măsurarea intensității luminii și corectarea nivelului de migrare a ADN-ului în consecință. Mai mult, aceeași cometă poate părea să aibă niveluri diferite de migrare a ADN-ului la măriri diferite ale microscopului. Astfel, este’ de dorit ‘ să se raporteze mărire microscop folosit pentru notare. Este’ de dorit ‘ să se afișeze imagini reprezentative ale cometelor (de ex., control cu migrare redusă sau deloc, migrare moderată și extinsă a ADN-ului) alături de nivelurile raportate de migrare a ADN-ului.

pasul 9A: punctarea și analiza datelor

această etapă necesită raportarea informațiilor esențiale pentru descriptorul principal al testului cometei (de ex.. % ADN în coadă, lungimea cozii, momentul cozii sau scorul vizual), numărul de comete care sunt analizate pe eșantion și modul în care este exprimat nivelul general al migrației ADN (de exemplu, mediana sau media scorurilor cometei). Nu este important să raportați rezultatul individual al fiecărei comete din fiecare gel; acestea sunt combinate pentru a calcula nivelul general al daunelor. Deoarece nu se poate exclude faptul că diferite pachete software de analiză a imaginilor pot avea moduri diferite de a calcula predictorul principal al testului comet, este esențial să raportați software-ul utilizat (numele software-ului, producătorul, versiunea). Toți descriptorii primari împărtășesc limitarea că este necesar să existe expertiză în testul cometei pentru a înțelege ce înseamnă, în timp ce dacă se creează o curbă de calibrare (folosind radiații ionizante, care induce pauze la o frecvență cunoscută), rezultatele pot fi convertite la frecvența relativă a leziunii în comparație cu nucleotidele nealterate sau perechile de nucleobaze; astfel de date sunt neechivoce și transmit informații pe care toți cercetătorii le pot înțelege39. Procedura de obținere a unei curbe de calibrare, utilizând radiații ionizante, și conversia nivelurilor de migrare a ADN-ului la frecvența leziunii în raport cu nucleotidele nealterate sau perechile de nucleobaze a fost raportată anterior40. Astfel, raportarea rezultatelor ca niveluri de leziuni la 109 nucleotide nealterate sau 106 perechi de nucleobaze este de dorit.

pasul 9B: Calcularea siturilor sensibile la enzime sau a numărului net de incizii în ADN-ul substratului pentru testul in vitro de reparare a ADN-ului

incubarea cu enzime de reparare a ADN-ului crește nivelul migrării ADN-ului, deoarece atât nivelul bazal al rupturilor catenei ADN, cât și leziunile specifice enzimei contribuie la numărul total de rupturi ale catenei ADN. Deoarece migrarea ADN care este atribuită nivelului bazal al afectării ADN și leziunilor specifice enzimei poate proveni din diferite mecanisme de genotoxicitate, este insuficient să se raporteze numai nivelul total al afectării ADN după tratamentul enzimatic. În schimb, este esențial să se raporteze genotoxicitatea ca situsuri sensibile la enzime, unde nivelul bazal al migrării ADN-ului a fost scăzut din migrarea ADN-ului în diapozitivele tratate cu enzime.

deoarece testul in vitro de reparare a ADN-ului utilizează aceleași celule substrat cu toate probele de extract de celule sau țesuturi, nu este necesar să existe controale concomitente de fond și tratament pentru fiecare probă din același experiment (adică, testul). Este posibil să existe mai mult de un substrat (de ex., atunci când se analizează atât activitatea de reparare a exciziei de bază, cât și a nucleotidelor) și, prin urmare, sunt necesare controale separate pentru fiecare tip de test de reparare a ADN – ului. Este esențial să se raporteze inciziile nete prin extractul de reparare din ADN-ul substratului.

pasul 9C: analiza statistică a rezultatelor

analizele statistice sunt ‘esențiale’. Tipul de analiză statistică depinde de proiectarea studiului și urmează ipotezele generale în testarea Statistică în toxicologia genetică și biomonitorizarea41,42.