matricile injectabile de colagen recombinant uman limitează remodelarea adversă și îmbunătățesc funcția cardiacă după infarctul miocardic

Proiectarea studiului

aici, am efectuat un studiu pentru a (i) proiecta hidrogeluri de colagen relevante clinic folosind colageni umani recombinanți de tip I și materiale rhciii; (iii) evaluarea potențialului terapeutic al materialelor pentru tratarea IM la șoareci; și (iv) identificarea mecanismelor care stau la baza efectelor terapeutice observate ale tratamentului rHC. Pentru experimentele in vivo, ligarea arterei LAD la șoareci a fost aleasă ca un model animal relevant din punct de vedere clinic și bine stabilit de IM. Pentru evaluările funcționale, histologice și moleculare, numărul de animale pe grup a fost redus la trei până la cincisprezece șoareci, așa cum se specifică în legendele figurii. Șoarecii au fost repartizați aleatoriu în grupuri de tratament și toate analizele au fost efectuate într-un mod orb.

prepararea și caracterizarea matricelor rHC

s-a preparat o soluție de colagen 1% prin dizolvarea a 0,1 g de colagen liofilizat (rHCI și rHCIII, din Fibrogen) în 10 ml de ddh2o ultra-pur. s-au adăugat sulfat de condroitină (CS; Wako), n-etil-n-(3-dimetilaminopropil) carbodiimidă (EDC) și n-hidroxizuccinimidă (NHS) se produce un amestec final cu un raport de masă de 1:4:0,5:0,3 pentru colagen:cs:NHS:EDC. Materialele au fost preparate pe gheață folosind un sistem închis care permite amestecarea omogenă fără a adăuga bule. După amestecarea completă, pH-ul a fost ajustat la 7.4 de NaOH (1.0 N). Matricile fără CS au fost preparate în mod similar, dar cu PBS adăugat pentru a compensa volumul de CS. Matricile etichetate cu Alexa-Fluor 594-NHS au fost preparate prin adăugarea a 20 de unqql de soluție stoc de colorant (1 mg/mL în DMSO) la geluri înainte de a adăuga NaOH (25 nmol de colorant per hidrogel), urmată de 20 de etape de amestecare.

vâscozitatea materialului

măsurătorile de vâscozitate au fost efectuate cu ajutorul unui reometru Brookfield R/S Plus (Brookfield) la 37 C. un ax conic C25–2/30 a fost utilizat pentru a comprima Materialul (deplasare de 50 mm) pe un piedestal cu temperatură controlată. Vâscozitatea a fost măsurată cu un bloc de rotație a rampei la o viteză de 1/min unități prestabilite la o rată de forfecare de cinci unități pe un timp de 30 min.

gradul de reticulare

au fost efectuate experimente de calorimetrie de scanare diferențială (DSC) pentru a evalua gradul de reticulare. Pe scurt, măsurătorile au fost efectuate într−un calorimetru de scanare diferențială q2000 (instrumente TA) în intervalul 8 până la 80 CTC folosind o rată de scanare de 5 CTC min-1. Matricile de colagen (5-20 mg) au fost uscate la suprafață cu hârtie de filtru și sigilate ermetic cu un capac din aluminiu (Tzero; Instrumente TA) într-o tavă de probă din aluminiu (Tzero; instrumente TA). Temperatura de denaturare (Td) a fost măsurată la debutul vârfului endotermic.

conținutul de apă

conținutul de apă al materialelor a fost măsurat prin cântărirea greutății în stare umedă (W0) a probei, echilibrată în PBS timp de 96 h la 4 centimetrii C. materialul a fost apoi uscat în vid la temperatura camerei timp de 96 h pentru a obține masa uscată (W). Conținutul total de apă al hidrogelilor (Wt) a fost apoi calculat conform ecuației:

degradarea

degradarea enzimatică a fost măsurată folosind 50-100 mg de hidrogel plasat în 5 ml de colagenază de tip I (10 U/ml în PBS) la 37 C. masa solidă rămasă a fost măsurată pe o perioadă de până la 24 h. rata de degradare este calculată de la panta inițială a parcelelor de masă rămasă vs.Timp și raportată ca mg/min.

porozitatea materialului

măsurătorile cu microscopie electronică de scanare la temperatură joasă (crio-sem) au fost efectuate la -50 CTC folosind un Tescan (model: Vega II-XMU) echipat cu un suport pentru eșantioane în stadiu rece, un detector de electroni de backscatter (ESB) și un detector de electroni secundari (SE). Dimensiunile porilor au fost măsurate de la cel puțin 250 de persoane, de la 4 la 6 zone aleatorii ale eșantionului, utilizând software-ul ImageJ. Diametrul porilor a fost cuantificat folosind axa longitudinală a porilor folosind instrumentul de linie dreaptă. Zona imaginii a fost ajustată în raport cu bara de scară de dimensiune obținută din sistemul Tescan Vega II 65.

experimente pe animale

toate procedurile au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea animalelor de la Universitatea din Ottawa și efectuate în conformitate cu Ghidul Institutului Național de sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator.

MI model

MI a fost indusă la 9 săptămâni de sex feminin c57bl/6 șoareci (Charles River; numărul de șoareci/grup sunt în legendele figura) și livrarea tratamentului a fost efectuată utilizând un protocol stabilit26,27. Șoarecii au fost anesteziați (2% izofluran), intubați, iar inima a fost expusă prin a patra toracotomie intercostală. Artera coronară descendentă anterioară stângă (LAD) a fost apoi ligată chiar sub apariția sa din atriul stâng. Această procedură are ca rezultat o MI mare care implică părțile anterolaterale, posterioare și apicale ale inimii, care a fost confirmată la momentul intervenției chirurgicale prin albirea miocardică în regiunea furnizată de arteră. Buprenorfina cu acțiune scurtă a fost administrată cu cel puțin o oră înainte de intervenția chirurgicală, iar buprenorfina cu acțiune lungă a fost administrată subcutanat imediat înainte de intervenția chirurgicală pentru analgezie perioperatorie. La 1 săptămână post-im (valoarea inițială), șoarecii au fost repartizați aleatoriu pentru a primi tratament cu matrici PBS (control), rHCI sau rHCIII, livrate în cinci injecții intramiocardice echivolumetrice (10 unktil fiecare loc, 50 unktil total) printr-un ac de 27 G folosind o procedură toracică închisă ghidată cu ultrasunete. Seringa este fixată într-un micromanipulator (VisualSonics) și, înainte de procedura de injectare, atât acul, cât și sonda capului de scanare RMV sunt aliniate de-a lungul axei lungi a inimii. Prin câmpul de vizualizare cu ultrasunete, micromanipulatorul este utilizat pentru a poziționa vârful acului în locația dorită în miocard pentru administrarea injecțiilor(Vezi Fig suplimentar. 1 și video suplimentar 1). Șoarecii au fost uciși prin anestezie terminală la 2 zile sau 4 săptămâni după tratament și inimile au fost colectate pentru histologie și/sau măsurători ale proprietăților mecanice.

ecocardiografia

ecocardiografia transtoracică a fost efectuată pe vizualizări pe axe lungi folosind un sistem Vevo770 în modul B cu o sondă scanhead de microvisualizare în timp real din seria 707b (VisualSonics). Imagistica a fost efectuată la momentul inițial înainte de injectarea tratamentului (7 zile post-IM) și la 28 de zile post-injectare pentru a determina fracția de ejecție a ventriculului stâng (FEVS), modificarea ariei fracționale (FAC), volumul sistolic final (vse), volumul diastolic final (EDV), volumul accidentului vascular cerebral și debitul cardiac. Rețineți că FEVS, ESV și EDV sunt utilizate ca predictori clinici ai HF și supraviețuirea după MI44.

imagistica Ex vivo a matricei marcate cu Alexa-Fluor 594

matricele rHC etichetate chimic (25 nmol de colorant per hidrogel) au fost injectate în inima de șoarece infarctată, așa cum este descris mai sus. Animalele au fost ucise la 2 ore, 2 zile și 7 zile după tratament, iar inimile au fost recoltate și imaginate ex vivo de IVIS spectrum XV (PerkinElmer) pentru a vizualiza distribuția rHCI și rHCIII în interiorul inimilor (570 nm; 640 nm). Pentru histologie, secțiunile de țesut au fost preparate în acetonă și apoi colorate cu DAPI, urmate de imagistică folosind un scaner de diapozitive Leica Aperio Versa cu o mărire finală de 20 și o stivă Z cu opt trepte la 1,5 mm.

analiza tulpinii

ecocardiografia transtoracică a fost efectuată pe vizualizări pe axe lungi folosind un sistem Vevo3100 în modul B cu o sondă scanhead de microvisualizare în timp real din seria MX400 (VisualSonics). Imagistica a fost efectuată la momentul inițial înainte de injectarea tratamentului (7 zile după IM) și la 2 zile după injectare pentru a determina tulpina endocardică longitudinală în momentul închiderii valvei aortice (reprezentând sistola finală). Tulpina în segmentul 5 (segmentul mediu anterior), corespunzătoare zonei de frontieră vizate pentru injectarea tratamentului, a fost analizată utilizând aplicația Vevostrain a software-ului VEVO LAB 3.1.1 (VisualSonics)41. Exemple reprezentative pentru măsurătorile efectuate sunt incluse în Fig. 10 pentru toate loturile experimentale plus un animal sănătos (neinfarct).

electrocardiografia

electrocardiogramele au fost obținute simultan cu ecocardiografia utilizând un sistem Vevo3100 (VisualSonics) la momentul inițial înainte de injectarea tratamentului (la 7 zile după IM) și la 2 zile după injectare. Electrocardiogramele au fost exportate din Vevo LAB 3.1.1. software (VisualSonics). Lungimea intervalelor PR, QT și QRS a fost determinată utilizând software-ul ImageJ (tabelul suplimentar 1).

proprietățile mecanice ale miocardului

șoarecii au fost eutanasiați prin anestezie terminală la 2 sau 28 de zile după tratament, iar inimile au fost recoltate. Au fost excizate bucăți rectangulare (2,5 x 5 mm) ale ventriculului stâng cuprinzând cicatricea și zona de frontieră. Pentru a determina elasticitatea la tracțiune a țesutului (modulul lui Young), probele au fost supuse testării mecanice într−un tester Universal mecanic Instron (Model 3342, Instron) echipat cu software Seria IX/S, folosind o viteză a capului încrucișat de 10 mm min-1.

Histologie/imunohistochimie

lamele secțiunilor țesutului miocardic au fost preparate dintr-un subset de inimi care nu au fost utilizate pentru măsurarea proprietăților mecanice. La 28 de zile după injectare, inimile au fost recoltate, perfuzate cu PBS, încorporate în OCT și înghețate în azot lichid. Secțiunile de 10 mm au fost tăiate cu ajutorul unui criostat. Pentru a evalua dimensiunea cicatricilor, secțiunile de țesut au fost fixate în 4% PFA timp de 1 oră și colorate cu procedura tricromă a lui Masson (Sigma). Imaginile realizate cu un microscop Olympus Bx50 folosind un obiectiv de 2 centimi și opt secțiuni pe șoarece au fost utilizate pentru a măsura grosimea peretelui la distanță și pentru a determina dimensiunea cicatricilor folosind metoda arcului de linie medie folosind software-ul Miquant66. Pentru imunohistochimie, secțiunile de țesut au fost fixate în acetonă timp de 20 min, permeabilizate cu 0,1% Triton timp de 10 min și apoi blocate în ser de 10% timp de 1 oră la temperatura camerei. Anticorpii primari au fost aplicați peste noapte la 4 centimetric C în ser 10%, iar apoi lamele au fost clătite și tratate cu anticorpi secundari timp de 1 oră la temperatura camerei, înainte de a fi montate cu mediu de montare fluorescent (Dako). Pentru detectarea vaselor de sânge și a miofibroblastelor, PECAM-1 (cunoscut și sub numele de CD31; Santa Cruz 101454, 1: 50) și XV-SMA (Abcam 5694, 1:200) anticorpi au fost utilizați și detectați cu AF594 anti-șobolan (Life Technologies a11008, 1:500) și AF488 anti-iepure (Life Technologies a11007, 1:500), respectiv. Macrofagele M2 au fost detectate de anticorpul anti-CD206 conjugat AF488 (Biolegend 141710, 1:50). Pentru colorarea troponinei cardiace i, secțiunile au fost incubate cu aglutinină din germeni de grâu marcată cu AF488 (ThermoFisher, W11261) timp de 1 oră la 37 CTC urmată de incubarea cu anticorpi primari ai troponinei cardiace i de capră (Abcam ab56357, 1:200) și detectate de anticorpi secundari af594 anti-capră de măgar (Life Technologies a-11058, 1:500). În cele din urmă, pentru colorarea connexin 43, secțiunile au fost incubate cu connexin 43/GJA1 (Abcam ab11370, 1:400) și troponina cardiacă i (Abcam ab188877, 1:200) anticorpi primari urmată de detectarea cu AF488 anti-iepure (Life Technologies a11007, 1:500) și anticorp secundar af594 anti-capră măgar (Life Technologies a-11058, 1:500), respectiv. Imaginile fluorescente au fost obtinute cu ajutorul unui microscop Zeiss Axio Observer cu un obiectiv de 20 de centimetri, iar pentru sectiunile colorate connexin 43 a fost utilizat un scanner de diapozitive Leica Aperio Versa cu un obiectiv de 20 de centimetri. Pentru toate petele IHC, au fost analizate patru secțiuni pe șoarece și pentru fiecare secțiune au fost utilizate pentru analiză 2-4 imagini din zona de frontieră, infarct și regiuni îndepărtate. Pentru colorarea H& E, secțiunile de țesut au fost fixate în formalină 10%. Secțiunile au fost apoi colorate mai întâi în soluția hematoxilină gill 2 timp de 7 minute, urmată de diferențierea alcoolului acid și apoi de 0,5% eozină timp de 7 minute, urmată de deshidratare (toate soluțiile de la Sigma). Imaginile au fost realizate cu un microscop Olympus Bx50. Zona de frontieră a fost desemnată ca FOV direct adiacentă fiecărei părți a regiunii infarctului care începe atunci când 50% din LV este țesut cicatricial fibrotic (vezi Fig suplimentar. 11 pentru o reprezentare schematică).

cx3cr1-EGFP experimente pe șoarece

pentru a evalua recrutarea celulelor mononucleare circulante la miocard în urma tratamentului cu rHC, șoarecii B6.129p-cx3cr1 tm1litt/J (Cx3cr1-EGFP) au fost achiziționați de la Laboratorul Jackson. Acești șoareci exprimă proteine fluorescente verzi îmbunătățite în monocite, celule dendritice, celule NK și microglia creierului și sunt un model raportat pentru studiul recrutării celulelor mononucleare la inimă67. La 1 săptămână post-im, șoarecii au primit tratament de 50 unqql de PBS, rHCI sau rHCIII, așa cum este descris mai sus. Animalele au fost ucise la 2 zile după tratament și sângele a fost colectat în tuburi EDTA. De asemenea, inimile au fost perfuzate cu PBS și au fost colectate ventriculul drept și regiunea apicală a ventriculului stâng. Țesuturile au fost clătite cu HBSS și digerate în 2.4U / ml dispase I (Roche) și 1 mg/ml colagenază B (Roche) timp de 40 min la 37 C. probele au fost spălate de trei ori cu PBS, centrifugate timp de 5 min la 400 g, iar celulele izolate au fost pregătite pentru citometrie în flux (FACS Aria III; Becton Dickinson). Celulele au fost etichetate cu APC anti-șoarece/om CD11b (Biolegend 101211), PE anti-șoarece Ly-6G/6C (Biolegend 108407), pe/Cy5 anti-șoarece F4/80 (Biolegend 123111), pe/Cy7 anti-șoarece CD38 (Biolegend 102717) și Alexa Fluor 700 anti-șoarece cd206 (Biolegend 141733), urmând diluțiile recomandate de producător (0.25%/l pentru 1% 106 celule pentru CD11b, Ly-6G/6C, CD38 și CD206 și 1%/l pentru 1% 106 celule pentru F4/80). A Se Vedea Fig. 12 pentru sortare / strategia de gating.

izolarea celulară și citometria în flux pentru subseturile de monocite

la două zile după injectare șoarecii au fost uciși prin inhalare de CO2 urmată de dislocare cervicală. Sângele a fost colectat de la șoareci prin puncție cardiacă într-o soluție EDTA de 50 mM, iar RBC-urile au fost lizate cu tampon de liză a globulelor roșii (RBC) conform protocolului producătorului (Biolegend 420301). Celulele au fost izolate din inimile de șoarece recoltate folosind un tampon de digestie care conține: Dnază I (50 U/ilctil; Sigma D5025), colagenază de tip II (400 U/mL; ThermoFisher 17101015), colagenază D (0,15 U/mL; Sigma 11088866001) și hialuronidază (10 U/mL; Sigma H3506). După o oră de digestie la 37 de Centimetre, celulele inimii izolate au fost trecute printr-un filtru de 70 de Centimetre. În cele din urmă, splinele de șoarece recoltate au fost piure și triturate printr-un filtru de 70 de centimetri, urmate de incubare cu tampon de liză a globulelor roșii (RBC). Peletele celulare au fost colectate prin centrifugare la 400g de la hectar timp de 5 min la 4 C de la hectar. Celulele izolate din toate țesuturile au fost incubate cu Zombie Aqua fixable viability dye (1: 500, Biolegend 423101) timp de 20 min la temperatura camerei. Apoi, receptorii Fc au fost blocați cu reactiv TruStain X (1: 100, Biolegend 103319) timp de 10 minute la temperatura camerei. Celulele au fost apoi incubate cu un cocktail de anticorpi timp de 45 min la temperatura camerei conținând CD45-APC/Fire 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-pe/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1A8), CD3-pe (1:160, Biolegend 17A2), B220-af488 (1:50, BioLegend RA3-6B2), F480-Af647 (1:100, BioLegend BM8) și Ly6C-BV421 (1:80, bd Biosciences AL-21). Citometria în flux a fost efectuată utilizând un BD FACS Aria III, iar datele au fost analizate cu software-ul FlowJo V10.5.2 (Vezi Fig suplimentar. 12 pentru strategia de sortare/închidere). Numărul total de celule viabile pentru fiecare post-izolare tisulară a fost determinat prin excluderea albastru trypan folosind un hemocitometru. Numărul total de celule din cadrul fiecărei populații de leucocite a fost determinat utilizând procentul de celule vii pentru o anumită populație de celule și numărul total de celule vii numărate post-izolare, care a fost apoi normalizat la mg de țesut sau mL de sânge colectat. Strategia de închidere: celulele unice au fost închise pe baza FSC-a și FSC-H. celulele unice vii au fost închise la o colorare scăzută pentru Zombie Aqua live/Dead dye. Din această populație cu celule unice vii, leucocitele au fost CD45+. Subseturile de leucocite au fost caracterizate după cum urmează: neutrofile CD45+CD11b+Ly6G+, Ly6C monocite joase CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C−, Ly6C monocite înalte CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C+, macrofage CD45+CD11b+Ly6G−F480+, celule T CD45+CD11b−Ly6G−CD3+B220− și celule B CD45+cd11b−ly6g−Cd3−B220+. Notă pentru expresia F480 de sânge nu a fost utilizată în strategia de închidere. Porțile au fost setate în raport cu controalele izotipului.

studiile cu cardiomiocite neonatale

miocitele ventriculare neonatale de șobolan (Smnr) au fost izolate proaspăt utilizând un protocol stabilit68. Ventriculele stângi colectate de la șobolani Sprague-Dawley de 2 zile (Harlan) au fost digerate de tripsină (Amersham Biosciences) și colagenază de tip II (Worthington Biochemical). Celulele izolate au fost Re-suspendate în mediul m-199 (Life Technologies) suplimentat cu 10% FBS, 19,4 mm glucoză, 2 mM L-glutamină, 2 U/mL penicilină, 0,8 hectogg/mL vitamina B12, HEPES 10 mM și 1 aminoacid neesențial mem (Sigma-Aldrich). Au fost efectuate două runde de pre-placare de 60 de minute, în timpul cărora fibroblastele cardiace se atașează la fundul vasului, îmbogățind astfel populația neaderentă pentru NRVMs. Celulele nonadherente (Nrvm) au fost apoi însămânțate pe diferitele matrice de colagen în plăci cu 24 de godeuri (40.000 celule/cm2). Pentru testul de supraviețuire, Nrvm-urile de cultură de 3 zile au fost supuse mediilor M-199 care conțin 50 peroxid de hidrogen pentru 3 ore, după care s-a efectuat un test Terminal deoxinucleotidil transferază Dutp Nick-end Labeling (TUNEL) și celulele moarte au fost numărate în trei câmpuri de vedere aleatorii.

culturi celulare

utilizând un protocol stabilit, macrofagele derivate din măduva osoasă au fost izolate de la mice69 c57bl/6J vechi de 8-12 săptămâni. Șoarecii au fost eutanasiați prin inhalare de CO2 și luxație cervicală, iar oasele tibiei au fost colectate și spălate cu medii pentru a izola măduva osoasă. Izolatul măduvei osoase a fost pipetat în mod repetat pentru a obține o suspensie cu o singură celulă, care a fost apoi trecută printr-un filtru celular. Celulele proaspăt izolate au fost cultivate timp de 1 săptămână în DMEM suplimentate cu 10% FBS, 20% l929-medii condiționate și penicilină–streptomicină și apoi re-placate pe hidrogelurile rHC timp de 3 zile. Celulele au fost colectate din hidrogelurile rHC folosind soluție salină tampon CaCl2 Hank de 3 mM care conține 250 de unități de colagenază I (Gibco). Polarizarea macrofagelor a fost evaluată prin citometrie în flux (FACS Aria III; Becton Dickinson) utilizând CD86 și CD206 (Biolegend) pentru a identifica macrofagele M1 și respectiv M2. Pentru izolarea celulelor mononucleare, măduva osoasă din oasele tibiei a fost colectată așa cum este descris mai sus. Celulele mononucleare au fost purificate prin centrifugare cu gradient de densitate folosind Histopaque XV (Sigma) conform instrucțiunilor producătorului. Celulele au fost etichetate cu 0.5%/ml dapi (Sigma) timp de 30 min la 37% C.

testul de adeziune macrofage

celulele mononucleare au fost izolate prin înroșirea tibiei și femurului șoarecilor cu vârsta cuprinsă între 6 și 12 săptămâni. Celulele au fost purificate prin centrifugare cu gradient de densitate folosind Histopaque XV (Sigma) conform instrucțiunilor producătorilor. Celulele mononucleare au fost numărate și etichetate cu DAPI. Celulele au fost placate pe diferite biomateriale la o concentrație de 50.000 celule/cm2 timp de 24 h. celulele au fost fixate cu 4% PFA timp de 5 minute, iar celulele au fost numărate. Datele au fost exprimate în raport cu controlul (puțuri neacoperite, adică., TCPS) pentru a minimiza efectul variabilității celulelor inter-donatoare.

testul de migrare a macrofagelor

celulele mononucleare ale măduvei osoase au fost cultivate în DMEM suplimentat cu 10% FBS, 20% mediu condiționat L929 și Pen/Strep timp de 7 zile pentru a genera macrofage derivate din măduva osoasă (DMDM) și etichetate cu DAPI, așa cum este descris mai sus. Bmdm-urile (2 xtx105) au fost apoi suspendate din nou în EBM lipsit de factori de creștere și ser și încărcate în camera superioară a unei plăci Transwell (Life Technologies) acoperită cu 100 XTL de rHCI sau rHCIII. Camera inferioară conținea medii macrofage complete, așa cum este descris mai sus. După 24 de ore, inserțiile au fost îndepărtate, iar numărul de DMO-uri care au migrat prin biomaterial a fost cuantificat în mod orb, folosind un microscop de fluorescență Zeiss Z1. Datele au fost exprimate în raport cu martor (godeuri neacoperite, adică TCPS) pentru a minimiza efectul variabilității celulelor inter-donatoare.

testul de polarizare macrofage

DMDM au fost generate în DMEM suplimentat cu 10% FBS, 20% mediu condiționat L929 și stilou/Strep timp de 7 zile, așa cum este descris mai sus. Pentru experimentele de activare a macrofagelor, celulele au fost stimulate timp de 3 zile cu lipopolizaharidă (1 hectolix/ml; Sigma) plus IFN-hectolix (50 ng/ml; Sigma) pentru activarea M1 sau cu IL-4 (20 ng/ml; r&D) pentru activarea M2. ARN-ul total a fost extras folosind tri Reactiv (Zymo Research), conform protocolului producătorului. ADNc din prima catenă a fost sintetizată cu transcriptază inversă Smartscribe (Takara Bio USA) și primeri hexameri aleatori (Fisher Scientific). Nivelurile de ARNm ale genei țintă au fost evaluate prin RT-PCR cantitativ cu LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix (Roche) și un sistem PCR LightCycler 480 în timp real (Roche). Secvențele pentru perechile de grunduri sunt enumerate în tabelul suplimentar 2. Modificările Relative ale expresiei ARNm au fost determinate prin metoda ct ct, exprimată ca niveluri în raport cu 18S. datele au fost exprimate în raport cu martor (godeuri neacoperite, adică TCPS) pentru a minimiza efectul variabilității celulelor inter-donatoare.

supraviețuirea după expunerea la H2O2

celulele au fost cultivate timp de 7 zile în DMEM suplimentat cu 10% FBS, 20% mediu condiționat L929 și stilou/streptococ. În ziua 7, mediul a fost schimbat în DMEM conținând 0,5 mM peroxid de hidrogen, iar celulele au fost cultivate timp de 3 ore înainte de a fi colorate cu 7-AAD pentru analiză prin citometrie în flux. Datele au fost exprimate în raport cu martor (godeuri neacoperite, adică TCPS) pentru a minimiza efectul variabilității celulelor inter-donatoare.

analiza statistică

analiza statistică s-a realizat folosind graficul Kaleida 4.5 inkt. Toate datele sunt prezentate ca valoarea medie a sem-ului de la 0 la opt. Pentru compararea datelor in vivo între tratamente, a fost utilizată o ANOVA urmată de corecția Holm pentru comparații multiple. Dimensiunea cicatricilor a fost analizată utilizând o regresie multiplă, incluzând grupul de tratament (rHCI, rHCIII și PBS) și FEVS de bază. rHCI și rHCIII în comparație cu PBS au fost predictori semnificativi ai dimensiunii infarctului, în plus față de FEVS inițial. Coeficientul de corelație pentru model este de 0,6 folosind regresia liniară multiplă STATA. Datele nrvm in vitro, macrofage și fibroblaste cardiace au fost analizate fie prin testul T al unui Student, fie printr-o ANOVA unidirecțională cu o corecție Holm pentru comparații multiple, așa cum se specifică în legendele figurii.

rezumat de raportare

informații suplimentare privind proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare privind cercetarea naturii legat de acest articol.