o viziune critică asupra mutațiilor conservatoare

rezumat

analizând compoziția suprafeței unui set de structuri proteice 3D, completată cu informații compoziționale de suprafață prezise pentru proteine omoloage, am găsit dovezi semnificative pentru o compoziție a stratului de structuri proteice. În părțile cele mai interioare și exterioare ale proteinelor există o sarcină negativă netă, în timp ce mijlocul are o sarcină pozitivă netă. În plus, descoperirile noastre indică faptul că conceptul de mutație conservatoare necesită o revizuire substanțială, de exemplu, s-au găsit preferințe spațiale foarte diferite pentru acidul glutamic și acidul aspartic. Screeningul alaninei folosit adesea în proiectele de inginerie proteică implică înlocuirea reziduurilor cu alanină, pe baza presupunerii că alanina este un reziduu `neutru’. Cu toate acestea, alanina are o corelație negativă ridicată cu toate reziduurile nepolare, cu excepția acestora. Prin urmare, propunem utilizarea, de exemplu, a serinei ca înlocuitor al reziduurilor care sunt corelate negativ cu alanina.

Introducere

la plierea unui lanț peptidic într-o structură proteică 3d, unele reziduuri sunt transferate dintr-un mediu polar într-un mediu mai nepolar în interiorul proteinei pliate. Acest transfer este condus de proprietățile termodinamice ale aminoacizilor și solventului. De-a lungul evoluției moleculare natura a selectat pentru funcția adecvată și stabilitatea proteinei rezultate. Pentru proteinele de dimensiuni mici până la medii—în structura pliată—doar câteva reziduuri sunt complet îngropate ( Chothia, 1976 ; Miller și colab., 1987 ; Petersen și colab., 1998), în timp ce majoritatea reziduurilor sunt doar parțial îngropate. Variația accesibilității solventului depinde de proprietățile reziduului în cauză și se reflectă în compoziția aminoacizilor în întreaga structură proteică. Aceste diferențe în profilul de accesibilitate a solventului au găsit aplicații largi în diferite metode de predicție a structurii ( Holbrook și colab., 1990 ; Rost și Sander, 1994 ; Thompson și Goldstein, 1996 ). De asemenea, utilizarea matricelor de substituție specifice mediului ( Donnelly și colab., 1994; Wako și Blundell, 1994 ) s-au dovedit valoroase. Vecinătatea secvențială a aminoacizilor a fost investigată anterior ( Vonderviszt și colab., 1986 ) și utilizarea sa a fost găsită, de exemplu, în predicția buclei ( Wojcik și colab., 1999 ) și predicția structurii secundare ( Chou și Fasman, 1978 ; Chandonia și Karplus, 1999 ; Jones, 1999 ). Nu a fost descoperită nicio corelație semnificativă între reziduurile de preferință secvențială a vecinului.

vecinătatea spațială din jurul reziduurilor individuale a fost, de asemenea, investigată anterior ( Burley și Petsko, 1985 ; Bryant și Amzel, 1987 ; Miyazawa și Jernigan, 1993 ; Petersen și colab., 1999 ). Mai mult, contactele spațiale au fost studiate pentru a obține potențiale de contact pentru diferitele interacțiuni de aminoacizi ( Brocchieri și Karlin, 1995 ; Miyazawa și Jernigan , 1996, 1999 ). Strategia comună este de a studia numărul de contacte într-o anumită distanță cut-off. Cu toate acestea, literatura de specialitate pare lipsită de investigații privind contactele dependente de distanță și, de asemenea, de rapoarte care utilizează informațiile încorporate privind accesibilitatea solventului reziduurilor implicate.

a fost raportată o predicție în două stări a corelației de accesibilitate a solventului între hidrofobicitate, înclinația de contact îngropată și locația din fereastra de predicție ( Mucchielli-Giorgi și colab., 1999 ). Cu toate acestea, nu descrie nicio corelație între distribuțiile individuale ale reziduurilor.

este important să se poată discrimina între structurile de model pliate corect și cele pliate greșit. S-a subliniat că metodele potențiale bazate pe energie nu discriminează bine între structurile pliate și cele pliate greșit. Cu toate acestea, caracteristici structurale, cum ar fi suprafața polară îngropată ( Overington și colab., 1992 ) și numărul de contacte polare ( Bryant și Amzel, 1987 ; Golovanov și colab., 1999) s-au dovedit valoroase.

în ingineria proteinelor conceptul de mutații conservatoare este frecvent utilizat. Ideea generală este că înlocuirea unui aminoacid cu un alt aminoacid cu proprietăți fizico-chimice similare nu va influența stabilitatea și funcția proteinei. Lucrarea de față arată că preferințele spațiale pentru reziduuri similare pot fi dramatic diferite în structurile proteice în circumstanțe similare (în acest context, accesibilitatea solventului).

rezultatele analizei neighbour vor fi valoroase în validarea modelului, ca instrument de predicție a structurii și mai ales ca ghid în căutarea mutațiilor care sporesc stabilitatea.

metode

secvențele utilizate sunt un subset al setului de identitate a secvenței de 25% a structurilor non-omoloage ( Hobohm și colab., 1992 ; Hobohm și Sander, 1994) derivat din structura proteinei banca de date PDB ( Bernstein și colab., 1977 ). Au fost utilizate numai secvențe Proteice cu un singur lanț. Setul de date rezultat a constat din 336 secvențe cu un singur lanț cu o identitate maximă a secvenței pereche de 25%. Subsetul a fost extins prin utilizarea fișierelor HSSP corespunzătoare (Dodge și colab., 1998 ). Setul total de date conținea 8379 secvențe aliniate și 1 415 986 reziduuri. Aceasta corespunde la 6,7% din toate reziduurile din versiunea 34 a SWISS-PROT ( Bairoch și Apweiler, 1997 ). Lungimea secvențelor a fost cuprinsă între 64 și 1017 reziduuri. Rezoluția structurilor cu raze X utilizate a variat între 1,0 și 3,0 la sută, cu o medie de 2,0 la sută. Mai mult, subsetul conținea 31 de structuri rezolvate de RMN. Cu toate acestea, toate coordonatele atomului de hidrogen au fost aruncate. Pentru a verifica o posibilă părtinire introdusă prin utilizarea secvențelor omoloage, analiza completă a fost făcută cu și fără secvențele aliniate. Nu s-au observat diferențe semnificative, deși dimensiunea redusă a celor mai mici dintre cele două seturi de date, așa cum era de așteptat, a dat naștere la mai mult zgomot.

vecinii spațiali ai fiecărui reziduu au fost determinați pe baza accesibilității solventului și a distanței spațiale. Accesibilitatea solventului a fost preluată din fișierele HSSP respective (Dodge și colab., 1998 ). Pentru fiecare reziduu de suprafață, reziduurile de suprafață învecinate au fost grupate în funcție de distanța lor față de reziduul în cauză. Distanța dintre două reziduuri a fost calculată ca fiind cea mai scurtă distanță dintre setul tuturor perechilor posibile de atomi din cele două reziduuri. Presupunem că alinierea în fișierul HSSP implică faptul că vecinii din secvența principală sunt, de asemenea, vecini în secvențele aliniate și că accesibilitatea solventului este conservată ( Andrade și colab., 1998 ; Goldman și colab., 1998 ). Numărul preconizat de interacțiuni vecine între reziduurile de tip I și j se calculează prin

unde xi și xj reprezintă fracția de aminoacizi i și j din setul de date pentru intervalul de distanță d și la o accesibilitate a solventului mai mare decât limita ACC și N0 este numărul total de contacte vecine observate. Scorul,Sij|d, ACC, se calculează prin

acest lucru oferă un scor negativ pentru perechile vecine defavorizate și un scor pozitiv pentru interacțiunile favorizate. Valoarea scorului Sij/d, ACC poate fi transformată într-un parametru termodinamic aparent prin înmulțire cu RT .

sarcina netă din fiecare strat al proteinei a fost calculată. Acidul Aspartic și acidul glutamic sunt considerate încărcate negativ, iar arginina și lizina sunt considerate încărcate pozitiv. Histidina este fie considerată neîncărcată, fie încărcată pozitiv. Taxa netă relativă , Qrel-ul de la sută, definim ca

unde Npozitiv este numărul de reziduuri pozitive, Nnegativ numărul de reziduuri negative și NTotal numărul total de reziduuri din stratul respectiv.

The PDB identification codes for the structures used are 1ptx, 2bbi, 1hcp, 1iml, 1cdq, 1vcc, 1nkl, 1tiv, 2abd, 2hts, 1tpg, 1fbr, 1pco, 1who, 1beo, 2ncm, 1fim, 1tlk, 1xer, 1onc, 1rga, 1erw, 1fd2, 1put, 1fkj, 1jpc, 1thx, 1jer, 1ccr, 1wad, 2tgi, 1pls, 1neu, 4rhn, 1rmd, 1hce, 1hfh, 1tam, 2pf1, 1bip, 1whi, 1yua, 1bp2, 1zia, 4fgf, 7rsa, 1bw4, 2vil, 1eal, 1rie, 1doi, 3chy, 1cpq, 1msc, 1mut, 1rcb, 1lzr, 1htp, 1lid, 1lis, 1lit, 1kuh, 1nfn, 1irl, 1poc, 2tbd, 1cof, 1pms, 1rsy, 1snc, 1eca, 1jvr, 2end, 1anu, 5nul, 1fil, 1jon, 1lcl, 1itg, 1tfe, 1maz, 1pkp, 1lba, 1vsd, 2fal, 1ash, 1def, 2hbg, 1div, 1gds, 1grj, 1i1b, 1ilk, 1rcy, 1sra, 1ulp, 1mbd, 1aep, 1jcv, 2gdm, 1phr, 1rbu, 1esl, 1hlb, 1mup, 1vhh, 1gpr, 1btv, 1cyw, 1klo, 1l68, 3dfr, 2cpl, 1sfe, 1huw, 5p21, 1ha1, 1wba, 1lki, 2fha, 1prr, 2fcr, 1amm, 1cid, 1hbq, 1cdy, 2stv, 153l, 1rec, 1xnb, 2sas, 1gky, 1knb, 1ryt, 1zxq, 1har, 1cex, 1chd, 2tct, 2ull, 1gen, 1iae, 1nox, 1rnl, 2gsq, 1cfb, 1dyr, 1nsj, 2hft, 1fua, 2eng, 1thv, 1hxn, 2abk, 9pap, 1lbu, 3cla, 1vid, 2ayh, 2dtr, 1gpc, 1dts, 1jud, 1emk, 1ois, 1akz, 1sgt, 1ad2, 1nfp, 1din, 1lrv, 1dhr, 1bec, 1lbd, 1dpb, 1jul, 1mrj, 1fib, 1hcz, 1mml, 1vin, 1dja, 2cba, 3dni, 1lxa, 1arb, 1rgs, 1tys, 3tgl, 1ako, 1eny, 1ndh, 2dri, 1xjo, 1drw, 1kxu, 2prk, 1cnv, 1tfr, 1ytw, 1iol, 2ebn, 1tml, 1han, 1xsm, 1pbn, 1amp, 1ryc, 1bia, 1vpt, 1csn, 2ora, 1ctt, 1bco, 1fnc, 1gym, 1pda, 1cpo, 1esc, 2reb, 1mla, 1sig, 8abp, 1ghr, 1iow, 2ctc, 1gca, 1sbp, 1ede, 1pgs, 2cmd, 1anv, 1gsa, 1tag, 1dsn, 2acq, 1cvl, 1tca, 2abh, 2pia, 1pot, 1vdc, 1axn, 1msk, 1hmy, 2bgu, 1ldm, 1dxy, 1ceo, 1nif, 1arv, 1xel, 1uxy, 1rpa, 2lbp, 3pte, 1uby, 1fkx, 1pax, 3bcl, 1air, 1mpp, 2mnr, 1eur, 1cem, 1fnf, 1pea, 1omp, 2chr, 1pud, 1kaz, 1mxa, 1edg, 2sil, 1ivd, 1pbe, 1svb, 1ars, 1oyc, 1inp, 1oxa, 1eft, 1phg, 1cpt, 1iso, 1qpg, 2amg, 1uae, 1gnd, 2dkb, 1gpl, 1csh, 4enl, 1pmi, 1lgr, 1nhp, 1gcb, 1bp1, 1geo, 2bnh, 3grs, 1gln, 1gai, 2pgd, 2cae, 2aaa, 1byb, 1smd, 2myr, 3cox, 1dpe, 1pkm, 1ayl, 1crl, 1ctn, 1clc, 1tyv, 2cas, 1ecl, 1oxy, 1vnc, 1gal, 1dlc, 1sly, 1dar, 1gof, 1bgw, 1aa6, 1vom, 8acn, 1kit, 1taq, 1gpb, 1qba, 1alo și 1kcw.

rezultate și discuții

distribuția reziduurilor încărcate în diferite straturi ale structurii proteinei 3D și sarcina netă totală sunt prezentate în Figura 1 . În părțile cele mai interioare și exterioare ale proteinelor există o sarcină negativă netă, în timp ce mijlocul are o sarcină pozitivă netă. Această structură aparentă cu trei straturi, cu încărcare alternativă, expunând stratul exterior încărcat negativ la solvent, este interesantă. O astfel de organizare va asigura un anumit nivel de neutralizare a sarcinii radiale și poate contribui, eventual, la ambalarea strânsă a proteinei. De asemenea, această organizare de încărcare a stratului de suprafață ar putea oferi o ghidare electrostatică importantă în timpul evenimentului de pliere. În schimb, schimbarea pH-ului în condiții acide sau alcaline în care subseturile de reziduuri titrabile devin neîncărcate va destabiliza ambalarea reziduurilor la suprafața proteinei. Aminoacizii acizi îngropați pot fi găsiți în mai multe structuri proteice diferite, iar aceste reziduuri joacă roluri funcționale importante, de exemplu, în tripsină ( McGrath și colab., 1992), ribonuclează T1 ( Giletto și Pace, 1999 ) și tioredoxină ( Dyson și colab., 1997; Bhavnani și colab., 2000 ). Structura raportată cu trei straturi este observată atât cu, cât și fără secvența aliniată și, prin urmare, nu este cauzată de o prejudecată introdusă de conservarea grupurilor îngropate, încărcate într-o familie de proteine.

vecinii spațiali din jurul fiecărui tip de reziduu au fost calculați fără nicio discriminare în ceea ce privește accesibilitatea solventului. Cu excepțiile notabile de triptofan și cisteină, aminoacizii nu au fost frecvent observați ca vecini spațiali la tipuri de reziduuri identice. Această tendință nu a fost dependentă de alegerea distanței de tăiere (rezultatele nu au fost afișate). Diferențele de distribuție au fost remarcabil de mici între diferiții aminoacizi pentru o distanță-limită de 8%, ceea ce sugerează că 8% este o distanță suficient de mare pentru ca distribuția să devină independentă de natura reziduului central. Această observație a condus la utilizarea a 8-A ca cea mai mare distanță între vecinii investigați în detaliu.

Figura 2 prezintă valorile scorului pentru toate perechile vecine de aminoacizi care implică triptofan, glicină, alanină, prolină, serină, histidină, lizină și acid aspartic pentru perechile vecine cu accesibilitate la solvent de cel puțin 20%. Rezultatele pentru ceilalți aminoacizi sunt disponibile pe pagina noastră de pornire (http://www.bio.auc.dk/). Valorile scorului au fost calculate în mod similar pentru alte limite de accesibilitate pentru solvenți. Reziduul aromatic triptofan este unul dintre cele două reziduuri care prezintă o preferință clară pentru contactele cu același tip de reziduuri (cealaltă este cisteina). De asemenea, sunt preferate interacțiunile cu celelalte reziduuri aromatice. Interesant este că interacțiunile dintre triptofan și cele două reziduuri acide (acidul aspartic și acidul glutamic) par diferite. În timp ce triptofanul și acidul glutamic sunt observate mai rar decât se aștepta, se observă contrariul pentru triptofan și acidul aspartic. Glicina prezintă scorul negativ tipic pentru interacțiunile cu același tip de reziduuri. De asemenea, glicina nu pare să aibă vecini în vecinătatea spațială apropiată (3.5. Această subreprezentare a vecinilor apropiați este și mai clară pentru proline. Interpretăm această subreprezentare ca un semn al preferinței pentru buclă pe care o au reziduurile de prolină. Lipsa interacțiunilor cu toți ceilalți aminoacizi din vecinătatea sa indică faptul că majoritatea contactelor sunt cu moleculele de solvent. Cu toate acestea, prolina are o abundență de contacte la o distanță mai mare (4-5 inkt). Histidina este interesantă prin faptul că prezintă semne ale proprietăților sale aromatice, prin preferința pentru contactele cu reziduurile aromatice (~3,5%) și prin natura sa polarizabilă, prin contactele preferate cu reziduurile încărcate negativ (~3%). Lizina aminoacidului bazic are, după cum era de așteptat, un scor negativ clar pentru contactele cu alte lizine. Interacțiunile electrostatice favorabile cu aminoacizii acizi sunt evidente.

unele dintre cele mai interesante interacțiuni pereche sunt prezentate în Figura 3 . Figura 3A descrie perechea de poduri de sare acid lizină-aspartic. Supra-reprezentarea puternică observată la separarea de 3 centimetrii este în concordanță cu conceptul clasic de punte de sare. Supra-reprezentarea perechilor de acid lizină-aspartic în straturile cele mai expuse la solvenți observate la 5,5 până la 6% este neașteptată. Propunem ca rețelele de încărcare de pe suprafața proteinei să poată provoca această observație. În figura 3B este prezentat rezultatul pentru perechea acid glutamic–acid aspartic. Cea mai evidentă caracteristică este subreprezentarea așteptată a acestei perechi. Cu toate acestea, aproape de suprafața proteinei, aceeași restricție nu pare să fie prezentă. Din nou, propunem ca rețelele de încărcare localizate la suprafață să contribuie la această observație. În figurile 3C și D sunt prezentate perechile de aminoacizi acid triptofan–glutamic și acid triptofan–aspartic. Credința comună că o mutație a acidului glutamic la acidul aspartic este conservatoare este contrară observațiilor prezentate. Perechea de acid triptofan-glutamic este foarte subreprezentată în straturile expuse foarte solvent ale proteinelor. În mod surprinzător, același lucru nu se poate spune pentru perechea de acid triptofan–aspartic, unde se observă o supra-reprezentare pentru intervalul de distanță de 3,5 până la 6 centi. Observații similare, dar mai puțin pronunțate, au fost făcute pentru perechile de acid tirozin–glutamic și acid tirozin–aspartic. Nu s–au observat diferențe semnificative între perechile de acid fenilalanină–glutamic și acid fenilalanină-aspartic. Singura diferență dintre acidul glutamic și acidul aspartic este lungimea lanțului lateral. Comună atât pentru triptofan, cât și pentru tirozină este polarizabilitatea lor, spre deosebire de fenilalanină. Credem că triptofanii localizați la suprafață implicați în definirea funcționalității proteinelor sunt polarizați de mediul lor electrostatic local. Deși nu putem oferi o explicație cantitativă, este plauzibil ca diferențele dintre lungimea lanțului diferită a acidului glutamic și a acidului aspartic să pună preferință apropierii de triptofan. S-a demonstrat că acidul aspartic are tendința de a avea interacțiuni favorabile între gruparea carbonil a lanțului lateral și gruparea carbonil a coloanei vertebrale ( Deane și colab., 1999), rezultând o structură asemănătoare inelului. Conformații similare nu au fost observate pentru acidul glutamic. În figurile 3e și F sunt prezentate perechile de acid histidină–aspartic și serină–histidină. Deoarece aceste trei reziduuri constituie reziduurile de situs activ ale unei game largi de hidrolaze, acestea prezintă un interes deosebit. Există o supra-reprezentare a perechilor de acid histidină–aspartic în zonele foarte accesibile cu solvent. Distanța este mai mare decât distanța tipică observată în crevasele site-ului activ. Cu toate acestea, supra-reprezentarea mică, dar semnificativă, în intervalul 3–uri, este conformă cu distanțele clasice de acid histidină-aspartic în hidrolaze. Figura 3E arată preferința clară pentru contactele dintre histidinele îngropate și acizii aspartici. Considerăm că această caracteristică este o parte importantă a evoluției moleculare a siturilor catalitice de novo. Stocarea Triadelor catalitice posibile în medii nefuncționale reduce numărul de substituții de aminoacizi necesare pentru activarea sitului.

caracteristica cea mai distinctă din Figura 3F este subreprezentarea clară a perechilor serină-histidină în medii expuse cu solvent ridicat. O supra-reprezentare slabă a perechii serină–histidină este observată la 3 centimetrii în zonele mai puțin accesibile cu solvent. Astfel, prezența triadei catalitice aparent este determinată mai ales de preferința perechii de acid histidină–aspartic, deși perechea serină–histidină dezvăluie tendințe similare, dar mult mai slabe.

s-a determinat compoziția de aminoacizi a fiecărui strat de accesibilitate a solventului. Așa cum era de așteptat, părțile îngropate ale proteinelor sunt compuse dintr-o cantitate mai mare de reziduuri nepolare decât straturile expuse mai multor solvenți. Corelația dintre compoziția aminoacizilor a fost calculată din datele compoziției straturilor structurale individuale. Se așteaptă ca aminoacizii care au preferințe similare pentru contactul cu solventul și mediul local să prezinte o corelație pozitivă ridicată din cauza tendințelor similare în distribuția lor. Prin urmare, aminoacizii care prezintă corelație negativă vor avea preferințe diferite pentru mediul local și, prin urmare, nu sunt considerați compatibili, adică nu se recomandă o mutație unică a acestui tip în această locație. Deoarece reziduurile nepolare sunt abundente în miez și prezintă o scădere treptată pe măsură ce accesibilitatea solventului crește în general, corelația dintre reziduurile nepolare este pozitivă (Figura 4 ). În schimb, reziduurile polare sunt mai abundente în părțile foarte expuse și, prin urmare, sunt corelate negativ cu reziduurile nepolare. Histidina și treonina se comportă semnificativ diferit. Ele prezintă o corelație pozitivă între ele, dar o corelație mică cu oricare dintre celelalte coloane, cu excepția argininei și glicinei. Acest lucru este cauzat de apariția scăzută a histidinei și treoninei atât în zonele îngropate, cât și în zonele foarte expuse și de apariția lor relativ ridicată în straturile medii expuse. Histidina are o corelație pozitivă cu două reziduuri aromatice, triptofan și tirozină, și cu treonina slab polară și arginina polară. Din nou, interpretăm acest lucru ca un semn atât al proprietăților aromatice, cât și al proprietăților de încărcare ale histidinei. Reziduurile slab polare nu au aceeași similitudine clară în distribuție ca reziduurile polare și nepolare. Prolina și Serina par a fi mai strâns legate de reziduurile polare. Reziduul slab polar alanina are corelație pozitivă numai cu reziduurile nepolare. Propunem ca mutațiile dintre reziduurile cu corelație pozitivă ridicată să aibă șanse mari de a menține stabilitatea termodinamică a structurii 3d. Acest lucru este valabil mai ales pentru reziduurile încărcate. În schimb, reziduurile cu un grad ridicat de corelație negativă sunt de obicei reziduuri cu proprietăți fizico-chimice diferite, care nu pot fi schimbate fără a schimba chimia fizică a proteinei. Reziduurile necorelate implică reziduuri cu un rol special în structură, de exemplu, unele reziduuri adesea implicate în cataliză. Considerăm că observația conform căreia prolina din studiul nostru se comportă similar cu reziduurile polare este legată de rolul structural al reziduurilor de prolină și de preferința sa pentru bucle și viraje. Screeningul alaninei folosit adesea în proiectele de inginerie proteică implică înlocuirea reziduurilor cu alanină, pe baza presupunerii că alanina este un reziduu `neutru’. Cu toate acestea, datele noastre arată că alanina are o corelație negativă ridicată cu toate reziduurile nepolare, cu excepția acestora. Prin urmare, propunem utilizarea, de exemplu, a serinei ca înlocuitor al reziduurilor care sunt corelate negativ cu alanina.

în opinia autorilor, lucrarea de față oferă noi informații importante despre organizarea structurală a proteinelor. Suprafața proteinei trebuie privită ca o caracteristică structurală multistrat a proteinei, unde fiecare strat are compoziția sa specifică și caracteristicile rezultate. Această observație cheie simplă credem că va avea o importanță semnificativă pentru multe strategii de Inginerie a proteinelor care vizează modificarea reziduurilor expuse la solvent.

P. H. J. mulțumește Consiliului de cercetare din Norvegia pentru sprijin financiar (NFR-116316/410). S. B. P. își exprimă recunoștința pentru sprijinul financiar din partea Obelsk Familiefond, precum și m Okticl-2.