obținerea clarității: procesul hidrogel creează creierul transparent
procesul de claritate: interviu cu Bioinginerul Stanford și psihiatrul Karl Deisseroth. Lungime: 3:58
“studierea sistemelor intacte cu acest tip de rezoluție moleculară și domeniu global – pentru a putea vedea detaliile fine și imaginea de ansamblu în același timp — a fost un obiectiv major nesatisfăcut în biologie și un obiectiv pe care claritatea începe să îl abordeze”, a spus Deisseroth.
“această ispravă a ingineriei chimice promite să transforme modul în care studiem anatomia creierului și modul în care boala o Schimbă”, a declarat Thomas Insel, MD, director al Institutului Național de sănătate mintală. “Studiul aprofundat al celui mai important organ tridimensional al nostru nu va mai fi constrâns de metode bidimensionale.”
creier de șoarece ADULT Intact înainte și după procesul de claritate de două zile. În imaginea din dreapta, structurile fine ale creierului pot fi văzute slab ca zonele de neclaritate deasupra cuvintelor “număr”, “neexplorat”, “continent” și “se întinde.”
cercetarea din acest studiu a fost efectuată în principal pe un creier de șoarece, dar cercetătorii au folosit claritatea pe peștele zebră și pe probele de creier uman conservate cu rezultate similare, stabilind o cale pentru studiile viitoare ale probelor umane și ale altor organisme.
“claritatea promite să revoluționeze înțelegerea noastră despre modul în care schimbările locale și globale în structura și activitatea creierului se traduc în comportament”, a declarat Paul Frankland, PhD, un om de știință senior în neuroștiințe și sănătate mintală la Institutul de cercetare Hospital for Sick Children din Toronto, care nu a fost implicat în cercetare. Colega lui Frankland, Dr. Sheena Josselyn, a adăugat că procesul ar putea transforma creierul dintr-o “cutie neagră misterioasă” în ceva esențial transparent.
un loc de nepătruns
movila de materie cenușie întortocheată și cabluri care este creierul este un loc complex și de nepătruns. Neurologii s-au străduit să înțeleagă pe deplin circuitele sale în încercarea lor de a înțelege cum funcționează creierul și de ce, uneori, nu.
Karl Deisseroth
claritatea este rezultatul unui efort de cercetare în laboratorul lui Deisseroth pentru a extrage elementele opace — în special lipidele — dintr-un creier și totuși să păstreze caracteristicile importante pe deplin intacte. Lipidele sunt molecule grase găsite în tot creierul și corpul. În creier, în special, ele ajută la formarea membranelor celulare și dau creierului o mare parte din structura sa. Lipidele reprezintă o dublă provocare pentru studiul biologic, totuși, deoarece fac creierul în mare măsură impermeabil atât la substanțe chimice, cât și la lumină.
neurologii ar fi dorit să extragă lipidele pentru a dezvălui structura fină a creierului fără a tăia sau secționa, dar pentru o problemă majoră: îndepărtarea acestor molecule importante din punct de vedere structural face ca țesutul rămas să se destrame.
investigațiile anterioare s-au concentrat în schimb pe automatizarea abordării de feliere/secționare sau în tratarea creierului cu molecule organice care facilitează pătrunderea luminii numai, dar nu și a sondelor macromoleculare. Cu claritate, echipa lui Deisseroth a adoptat o abordare fundamental diferită.
“am apelat la ingineria chimică pentru a transforma țesutul biologic într-o nouă stare care este intactă, dar transparentă optic și permeabilă la macromolecule”, a spus Chung, primul autor al lucrării.
această nouă formă este creată prin înlocuirea lipidelor creierului cu un hidrogel. Hidrogelul este construit din interiorul creierului însuși într-un proces conceptual similar cu petrificarea, folosind ceea ce este inițial o suspensie apoasă de molecule scurte, individuale cunoscute sub numele de monomeri hidrogel. Creierul intact, postmortem, este scufundat în soluția de hidrogel, iar monomerii infuzează țesutul. Apoi, când sunt” declanșați termic ” sau încălziți ușor până la aproximativ temperatura corpului, monomerii încep să se coaguleze în lanțuri moleculare lungi cunoscute sub numele de polimeri, formând o plasă în tot creierul. Această plasă ține totul împreună, dar, important, nu se leagă de lipide.
cu țesutul protejat în acest fel, echipa este capabilă să extragă energic și rapid lipidele printr-un proces numit electroforeză. Ceea ce rămâne este un creier 3-D, transparent, cu toate structurile sale importante – neuroni, axoni, dendrite, sinapse, proteine, acizi nucleici și așa mai departe – intacte și în loc.
mergând lucrurile unul mai bine
claritatea merge apoi unul mai bine. În păstrarea continuității complete a structurilor neuronale, claritatea nu numai că permite urmărirea conexiunilor neuronale individuale pe distanțe lungi prin creier, dar oferă și o modalitate de a aduna informații moleculare bogate care descriu funcția unei celule care nu este posibilă cu alte metode.
“ne-am gândit că dacă am putea elimina lipidele nedistructiv, am putea obține atât lumina, cât și macromoleculele să pătrundă adânc în țesut, permițând nu numai imagistica 3D, ci și analiza moleculară 3D a creierului intact”, a spus Deisseroth, care deține profesorul D. H. Chen.
folosind anticorpi fluorescenți despre care se știe că caută și se atașează doar de proteine specifice, echipa lui Deisseroth a arătat că poate viza structuri specifice din creierul șoarecelui modificat-sau “clarificat” — și face ca aceste structuri și numai acele structuri să se aprindă sub iluminare. Cercetătorii pot urmări circuitele neuronale prin întregul creier sau pot explora profund nuanțele cablajului circuitului local. Ei pot vedea relațiile dintre celule și pot investiga structurile subcelulare. Ei pot chiar să se uite la relațiile chimice ale complexelor proteice, acizilor nucleici și neurotransmițătorilor.
o redare tridimensională a creierului clarificat imaginată de jos (jumătatea ventrală). Un videoclip fly-through al creierului rozătoarelor este disponibil aici.
“abilitatea de a determina structura moleculară a diferitelor celule și contactele lor prin colorarea anticorpilor este o capacitate de bază a clarității, separată de transparența optică, care ne permite să vizualizăm relațiile dintre componentele creierului în moduri fundamental noi”, a spus Deisseroth, unul dintre cei 15 experți din “echipa de vis” care va stabili obiectivele pentru inițiativa de cercetare a creierului de 100 de milioane de dolari anunțată pe 2 aprilie de președintele Obama.
și într-o altă capacitate semnificativă din punct de vedere al cercetării, cercetătorii sunt acum capabili să destine creierul clarificat, eliminând anticorpii fluorescenți și repetând procesul de colorare din nou folosind diferiți anticorpi pentru a explora diferite ținte moleculare în același creier. Acest proces de colorare/destinare poate fi repetat de mai multe ori, au arătat autorii, iar diferitele seturi de date se aliniază unul cu celălalt.
deschiderea ușii
claritatea a făcut posibilă efectuarea unei analize structurale foarte detaliate asupra creierului intact-chiar și a țesuturilor umane care au fost păstrate de mulți ani, a arătat echipa. Transformarea creierului uman în specimene transparente, dar stabile, cu cabluri accesibile și detalii moleculare, poate duce la o mai bună înțelegere a bazelor structurale ale funcției creierului și ale bolii.
vedere tridimensională a hipocampului colorat care prezintă neuroni care exprimă fluorescență (verde), conectând interneuronii (roșu) și susținând glia (albastru).
dincolo de beneficiul imediat și aparent pentru Neuroștiințe, Deisseroth a avertizat că claritatea a sărit în capacitatea noastră de a face față datelor. “Transformarea cantităților masive de date într-o perspectivă utilă reprezintă provocări computaționale imense care vor trebui abordate. Va trebui să dezvoltăm abordări computaționale îmbunătățite pentru segmentarea imaginilor, înregistrarea imaginilor 3D, urmărirea automată și achiziția de imagini”, a spus el.
într-adevăr, astfel de presiuni vor crește pe măsură ce claritatea ar putea începe să susțină o înțelegere mai profundă a sistemelor și organelor biologice intacte la scară largă, poate chiar a organismelor întregi.
“un interes deosebit pentru studiul viitor sunt relațiile intrasistemice, nu numai în creierul mamiferelor, ci și în alte țesuturi sau boli pentru care înțelegerea deplină este posibilă numai atunci când se poate efectua o analiză aprofundată a sistemelor unice, intacte”, a spus Deisseroth. “Claritatea poate fi aplicabilă oricărui sistem biologic și va fi interesant să vedem cum îl pot folosi alte ramuri ale biologiei.”
alți coautori includ Student Jenelle Wallace; studenții absolvenți sung-Yon Kim, Kelly Zalocusky, Joanna Mattis, Aleksandra Denisin și Logan Grosenick; asistenți de cercetare Sandhiya Kalyanasundaram, Julie Mirzabekov, Sally Pak și Charu Ramakrishnan; cercetători postdoctorali Aaron Andalman, PhD și Tom Davidson, PhD; fost student la licență Hannah Bernstein; și fost om de știință al personalului Viviana Gradinaru.
cercetarea a fost susținută de Institutul Național de sănătate mintală (Grant MH099647); Fundația Națională pentru științe; Fundația Simons; președintele și rector al Universității Stanford; fundațiile Wiegers, Snyder, Reeves, Gatsby și Yu; programul de reparații DARPA; și Fondul Burroughs Wellcome.
Departamentul de Bioinginerie din Stanford a susținut, de asemenea, lucrarea. Departamentul este operat în comun de școala de inginerie și școala de Medicină.
