Hepatita necrotică infecțioasă cauzată de Clostridiumnovyi tip B la un cal: raportul de caz și revizuirea literaturii | Jiotower

hepatita necrotică infecțioasă (INH) este cauzată de Clostridium novyitype B. boala afectează de obicei oile, în care este denumită și”boala neagră”, având în vedere decolorarea întunecată a țesutului subcutanat cauzată decongestia venoasă intensă observată în carcasele animalelor care mor din cauza acestei boli.6 deși se consideră că INH apare și la alte specii,inclusiv bovine, caprine și cai, sunt disponibile informații foarte limitate despre această boală la animale, altele decât oile.2,3,19,15 mai mult, datorită naturii sale anaerobe stricte,izolarea și identificarea C. novyi tip B este rareori realizată.15 din acest motiv, rapoartele de INH sunt de obicei limitate la diagnosticul prezumtiv bazat pe histopatologie, testul anticorpilor fluorescenți (FAT) și/orimmunohistochimie (IHC). Tipul de C. novyi este rardeterminată. Aici prezentăm un caz confirmat de Inh ecvină cauzat de C.novyi tip B, precum și revizuirea literaturii privind boala.

a 14-y-vechi, 511 kg Bay Quarter cal castrat a fost prezentat la San Bernardinobranch din California Animal Health and Food Safety Laboratory System forpostmortem examinare și diagnosticare workup. Animalul a avut un istoric 3-d de semne neurologice progresive, temperatura rectală de 38,8-40,5 C și a fost tratat fără succes cu medicamente antiinflamatoare nesteroidiene, înainte de deces.O autopsie completă a fost efectuată la 6 ore după moarte.

la autopsie, calul era în stare nutrițională bună, cu cantități adecvate de grăsimi și în stare moderată de descompunere postmortem. A fost galbendiscolorarea sclerei, a țesutului subcutanat și adipos și a articularuluicartilaje. Hemoragiile multifocale echimotice-sufuzive au fost prezente în majoritateamușchii, seroza tractului intestinal, mezenterul, splina, pleura și mușchii inpapilari ai inimii. Sângele venos era roșu-negru intens. Pericardicac a fost distins cu o cantitate mare de lichid serosanguin și au existat ~5L dintr-un fluid similar care conține toroane fibrinice abundente în cavitatea abdominală.Ficatul a fost mărit semnificativ și a avut margini rotunjite; lobul stâng a fost ferm,Roșu închis până la negru și a avut numeroase bule de gaz subcapsulare și parenchimatoase profunde și fibrină abundentă peste capsulă (Fig. 1A). Pe secțiunea tăiată a acestui Lob, a existat un diametru de ~15 cm, zonă palidă înconjurată de o margine hemoragică subțire (Fig. 1B). Meningele care acoperă creierul și măduva spinării au fost congestionate difuz și au existat hemoragii petechiale în cortexul cerebral. În restul carcasei nu s-au observat alte grossleziuni semnificative.

probele de creier, plămân, inimă, diafragmă, ficat, splină, stomac,intestin, pancreas, glandă suprarenală, mezenter, rinichi și vezică urinară au fost colectate și fixate în 10% formalină tamponată (pH 7,2) timp de 48 de ore și prelucrate în mod curent pentru producerea secțiunilor colorate de hematoxilină și eozină cu grosimea de 4 unqq și eozină (H&E). Secțiunile hepatice și renale au fost,de asemenea, colorate cu pete Gram și, respectiv, Okajima.

probele de ficat au fost recoltate aseptic și supuse culturii aerobe și anaerobe pe plăci de agar de ovine 5% timp de 48 de ore. PCR a fost efectuat pentru virusul West Nile (WNV) pe probe centralizate ale sistemului nervos central și pentru herpesvirusul echid 1 (EHV-1)pe un tampon nazal. Un ecran de metale grele, inclusiv plumb, mangan, fier,mercur, arsenic, molibden, zinc, cupru și cadmiu, a fost efectuat pe probe de ficat.Lichidul cefalorahidian a fost testat pentru anticorpi împotriva Sarcocystisneurona folosind o grăsime indirectă. Frotiurile hepatice au fost procesate de FATfor Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium sordelli și C. novyi folosind conjugate comerciale (VMRD, Pullman, WA). În plus,secțiunile hepatice fixate cu formalină, încorporate cu parafină, au fost prelucrate de o tehnică indirectă de imunoperoxidază pentru C. novyi, folosind un kit comercial (RTU VECTASTAINElite ABC system, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Peroxidaza endogenăactivitatea a fost stinsă cu o soluție de peroxid de hidrogen 3%, urmată de pepsintratament pentru recuperarea antigenului. Probele au fost apoi incubate cu BackgroundPunisher (Biocare Medical, Concord, CA) pentru a bloca legarea nespecifică, înainte de incubare cu anticorp policlonal anti–C. novyi de capră (VMRD) la 37 C pentru 60 min. Vector novared chromogen a fost utilizat pentru vizualizare (Vectorlaboratoare). Secțiuni de ficat incubate cu ser normal de capră în loc deanticorpii primari au fost utilizați ca control negativ. Ficat de la o vacă în carec. novyi a fost identificat prin cultură și PCR a fost folositca un control pozitiv.

probele de ficat au fost prelucrate pentru extragerea ADN-ului (qiaamp ADN FFPE tissue kit, Qiagen,Hilden, Germania) urmând instrucțiunile producătorului. ADN-ul extras a fost folosit ca șablon pentru un test PCR multiplex pentru a amplifica segmente ale flagelingenelor (fliC) de C. septicum, C. novyi tip A, C. novyi tip B, C. chauvoei și Clostridium haemolyticum, așa cum este descris anterior.17 În plus, am dezvoltat un PCR convențional pentru a amplifica un segment al theC. novyi tip B Alfa toxina(TcnA) gena (GenBank aderare JENV01000127.1), principalul factor de virulență al acestui lucrumicroorganism. Au fost proiectate următoarele secvențe de oligonucleotide: 5′-TGATGTTGACCATCCTTGCTCT-3′(CNtBaF) și 5′-CCTTATGCAAAGGGATGGCG-3 ‘ (CNtBaR),care amplifică un fragment de ADN ~342-bp al genei țintă. PCR convențional a fost realizat într-un volum total de 25 zqql conținând 5 zqql de ADN extras, 0.25 unql din fiecare grund (10 unqqm), 7 unql de apă fără nuclează și 12,5 unql de amestec Master PCR(2x, Promega, Madison, WI), conținând ADN polimerază Taq (pH 8,5, 50 U/mL), dNTP(400 unqqm) și MgCl2 (3 mM). Profilele de termociclere au fost următoarele: 94 CTF pentru 5 min, 30 cicluri de 94 CTF pentru 1 min, 55 CTF pentru 1 min și 72 CTF pentru 1,5 min, urmată de o etapă finală de extindere la 72 CTF pentru 7 min. Probele au fost prelevate la 4 unktil Cuntil reacțiile PCR au fost vizualizate sub lumină ultravioletă în geluri de agaroză 1% colorate cu etidiumbromură (Amresco, Solon, OH) (agaroză SFR, Amresco). Dnaextras din C. culturile novyi tip B (ATCC 25758), C. novyi tip A, C. septicum, C. chauvoei și C. haemolyticum au fost utilizate ca controale pozitive. Apa în loc de ADN a fost utilizată în controlul negativreacții.

microscopic, capsula hepatică a fost acoperită de fibrină abundentă amestecată cu celldebris și au existat Bulle emfizematoase parenchimatoase subcapsulare și profunde de diferite dimensiuni. Cea mai izbitoare constatare a fost necroza coagulativă multifocală până la extinsă focal, înconjurată de o margine de un număr mare de neutrofile viabile și degradate, hemoragie, fibrină, resturi celulare și agregate mari de tije bacteriene gram-pozitive, dintre care unele aveau spori subterminali (Fig. 1C,, D).D). În intervențieparenchimul și în ficatul mai puțin afectat, a existat stază biliară, hemoragii multifocale și necroză fibrinoidă segmentară până la difuză a vaselor de sânge, multe dintre elecare conținea și trombi de fibrină. Epiteliul tubular renal a avut vacuolizare citoplasmatică ușoară, iar în lumenul tubulilor renali au fost prezente mulaje proteice și granulare. Turnările s-au colorat pozitiv cu pata Okajima (Fig. 1E). În creier, a existat congestie difuză, hemoragii perivasculare multifocale și împrăștiate aleatoriu și expansiune moderată până la marcată a spațiului Virchow-Robin cu edem acidofil. Peritoneul visceral a fost acoperit de fibrină abundentă amestecată cu un număr mare de neutrofile viabile și degenerate; majoritatea vaselor de sânge peritoneale erau congestionate și/sau conțineau trombi de fibrină. Câteva artere mici șivenele din cortex și medulla glandei suprarenale au avut, de asemenea, trombi de fibrină. Plenul a avut congestie vasculară și hemoragii parenchimatoase multifocale și capsulare. Plămânii au fost congestionați difuz și au avut hemoragii multifocale și edeme, pe lângă câteva vase de sânge care conțin trombi de fibrină. Au fost observate hemoragii multiplesubendocardice, subepicardiale și subpleurale.

marea majoritate a tijelor gram-pozitive intralezionale observate în ficat au fost pozitive pentru C. novyi IHC (Fig. 1F). Grăsimea a fost pozitivă pentru C.novyi, dar negativ pentru celelalte specii clostridiale testate. Probele hepatice au fost pozitive pentru genele C. novyi tip B flic și TcnA și negative pentru genele fliC ale celorlalte clostridii testate (Fig. 2). Probele de lichid cefalorahidian au fost negative pentru testul anticorpilor imunofluorescenți S. neurona. PCR pentru WNV și EHV-1 a fostnegativ. Nu s-a obținut o creștere semnificativă a bacteriilor prin aerobă sau anaerobăcultură. Ecranul cu metale grele a relevat o concentrație crescută de fier înmosele hepatice (1.500 ppm; interval de referință: 100-300 ppm).

am făcut un diagnostic prezumtiv al INH bazat pe modificări brute și microscopice,împreună cu rezultatele grăsimii și IHC pentru C. novyi. Diagnosticul de INH produs de C. novyi tip B a fost confirmat prin detectarea PCR a genelor fliC și TcnA ale acestui microorganism. Din cunoștințele noastre, doar 6 cazuri de suspiciune de NHI au fost raportateanterior la cai. Trei cazuri au avut loc în Australia,8,9,11 și câte unul în Noua Zeelandă,23 Scoția,19 și Statele Unite (Montana).16 în aceste cazuri, un diagnostic prezumtiv s-a bazat pe leziuni brute și microscopice cuplate cu detectarea C. novyi prin grăsime,9,16,19 IHC,23 și/sau cultură.9,19 cu toate acestea, tipul de C. novyiimplicat nu a fost determinat în niciunul dintre aceste cazuri.

C. novyi este un bacil anaerob gram-pozitiv, care formează spori, care se găsește frecvent în sol și fecale de animale.15 este clasificat în tipurile A, B și C pe baza gamei de toxine produse.4C. novyi tip a produce în principal alfatoxina letală, inducătoare de edem (TcnA) și fosfolipaza neletală, toxina gamma; această bacterie esteasociată cu gangrena gazoasă a omului și a animalelor, acționând de obicei împreună cualte clostridii. C. novyi tip B produce, de asemenea, TcnA, în plusla toxina beta necrotizantă și hemolitică, deși prima este consideratăcel mai important factor de virulență pentru patogeneza INH. C. novyi tip C este considerat a fi non-toxigenic șinon-patogen.13,15 C. haemolyticum a fost cunoscut anterior ca C. novyitype D, și este încă menționată de acest nume de către unii autori; prin urmare, noidiscutați și acest microorganism aici. C. haemolyticum produce, de asemenea,toxină beta, dar în cantități mult mai mari decât C. novyitype B; această toxină este considerată principalul factor de virulență al acestui microorganism și este responsabilă pentru hemoglobinuria bacilară (BH), o boală care afecteazăîn principal bovine, care este clinic și patologic foarte asemănătoare cu INH.11,10,14

sporii lui C. novyi sunt foarte rezistenți la condițiile de mediu și, având în vedere că sporii se găsesc frecvent în sol, animalele care pășunează le pot ingera frecvent.6,19 deși nu este pe deplin dovedită, dogma actuală este că,după ingestie, sporii de C. novyi tip B sunt absorbiți din intestin și ajung la ficat prin circulația portalului, după care se răspândesc la alte organe. Sporii sunt fagocitați și rămân latenți în Kupffercelulele ficatului și în macrofagele splinei și măduvei osoase.2,6 INH a fost considerat în mod obișnuit ca fiind omologul BH, deoarece ambele boli sunt considerate a apărea după leziuni hepatice, provocând necroză și Condițiile asociate anaerobe care sunt necesare pentru germinarea sporilor latenți și producția de toxine.14 migrarea formelor imature de Fasciola hepatica prinficatul este considerat cel mai important factor predispozant atât pentru BH, cât și pentru rumegătoarele mici și ambele boli sunt mai frecvente în zonele cu prevalență ridicată a fascioliozelor.1 INH de rumegătoare a fost, de asemenea, asociat cu Cysticercustenuicollis și alți paraziți, inclusiv Fascioloidesmagna,Dicrocoelium dendriticum și thysanosoma actinoides,2,6,15, 21 deși rolul acestor paraziți în patogeneza bolii nu a fost demonstrat.Cu toate acestea, orice leziune hepatică care duce la generarea de condiții anaerobe poate fi un factor de reducere a INH. Acestea includ, dar nu se limitează la, hepaticeabscese, biopsii, modificări grase, telangiectasie și agenți toxici. Odată ce TcnA esteprodus și eliberat de formele vegetative ale C. novyi tip B, activitatea sa de monoglicozil transferază inactivează mai multe proteine care leagă guanosine5′-trifosfat (GTP) în celulele gazdei, rezultând înalterarea și redistribuirea citoscheletului actinei.3 TcnA perturbă, de asemenea, sistemul de vimentină și tubulină.7,18 aceste modificări par a fi mai dramatice în endoteliul capilar, ducând la extravazarea fluidelor pe scară largă observată în INH15 și probabil la tromboza multisistemică observată la calul raportului nostru. La oi, natura foarte acută a bolii face ca detectareasemnele clinice să fie dificile, animalele fiind de obicei găsite moarte. În cazurile în care semnesunt observate, ele sunt nespecifice și includ slăbiciune, letargie, anorexie, hipertermie,tahipnee, hiperpnee și, în final, recumbență. Clinicopatologicmodificările pot include neutrofilia cu schimbare stângă, azotemie,acidoză metabolică și activități crescute ale enzimelor hepatice și musculare.15,19

având în vedere că doar 6 cazuri de INH prezumtivă au fost descrise anterior la cai,informațiile epidemiologice, clinice și patologice disponibile sunt puține. Pe baza acestui număr limitat de cazuri, nu există o predispoziție aparentă la sex sau rasă în cazul INH ecvină și pot fi afectate atât animalele tinere, cât și cele adulte. Cursul clinic este de obicei mai lung la cai decât la rumegătoare, cu o durată de 12-72 ore,iar rezultatul a fost întotdeauna fatal. Semnele clinice variază de la ușoară până la severădepresie și reticență la mișcare, semne neurologice incluzând ataxie și headtilt, membrane mucoase hiperemice și/sau icterice și sclera oculară, dureri abdominale și recumbență.20,23 într-un caz în care s-a efectuat abdominocenteza,s-a obținut o cantitate crescută de lichid turbid cu concentrație crescută de proteine șigravitate specifică.9

profilurile Clinicopatologice ale cailor cu INH sunt foarte variabile și pot reprezenta diferite stadii de toxemie și leziuni hepatice. Aceste modificări potinclude neutrofilia cu deplasare la stânga, activitate crescută a enzimelor hepatice,trombocitopenie, hiperfibrinogenemie, hiperbilirubinemie și concentrație scăzută de electroliți.9,16,19 în plus, au fost raportate timpi de tromboplastină parțială activată, protrombină și trombină.23 aceste modificări, în combinație cu microtrombii capilari observați, suntsugestive ale coagulării intravasculare diseminate, un proces probabil să apară în cursul toxemiei și hemolizei la animalele mari.22,23 consumul factorilor de coagulare, scăderea sintezei acestora din cauza insuficienței hepatice și acțiunea sinergică a TcnA asupra endoteliului vascular sunt presupuse responsabile pentru hemoragiile răspândite observate în cazurile de inh.

deși icterul nu este descris la rumegătoare, caii pot prezenta uneori acest semn asociat cu INH.19,23 icterul pare să fie legat de gravitatea afectării hepatice și, într-o oarecare măsură, de hemoliză, ca în cazul nostru, în carehemoglobina a fost vizualizată în tubulii renali prin pata Okajima. Calul din studiul nostru a avut o concentrație moderată de fier crescută în ficat, sugerând procesul ahemolitic.5 acest nivel de fier în ficat este, totuși, o constatare comună la caii care mor dintr-o varietate de cauze și este adesea considerată o constatare incidentală asociată cu congestia și autoliza postmortem (conservarea nepublicată a autorilor).

deși se poate presupune că caii sunt mai susceptibili decât alte speciila acțiunea toxinei beta hemolitice produse de C. novyitype B, modificările hemoglobinurice nu au fost descrise în cazurile prezumtive de inh.16,23 comparativ cu C. haemolyticum, C. novyi tip B produce niveluri mai scăzute de toxină beta;15 prin urmare, se presupune că contribuția sa la patogeneza INH este minor, provocând un anumit grad de hemoliză la cai, dar nu suficient pentru a induce modificări semnificative asociate hemoglobinuriei. În plus, niciuna dintre cazurile anterioare nu a exclus rolul C. haemolyticum ca agent cauzator al bolii, astfel încât nu se pot trage concluzii finale din aceste cazuri. C. haemolyticum a fost implicat într-un caz de peritonită septică ina mare prin identificarea cu MALDI-TOF; cu toate acestea, identificarea PCR sau toxină nu a fost încercată în acel caz particular.11

factorul predispozant pentru INH la cai nu a fost întotdeauna determinat, deși au fost sugerate migrațiile hepatice ale F. hepatica și trematodele înrudite, precum și membrii familiei Strongylidae.9,12,19 în plus, tratamentul antihelmintic înainte de apariția semnelor clinice a fost sugerat ca un potențial declanșator al bolii,9,16,23 probabil prin provocarea unui anumit grad de necroză hepatică asociată cu distrugerea paraziților migratori. Cu toate acestea, nu există dovezi științifice care să susțină această ipoteză. Din păcate, nu este cunoscutfactorii propovăduitori au fost determinați în cazul nostru.

ca și în cazul nostru, majoritatea rapoartelor anterioare au descris un singur focar (multiplu într-un singur caz19) de necroză care afectează ficatul, localizat în mod constant în lobul stâng. Acest lucru contrastează cu INH de oi în care focarele distribuite aleatoriu, mici, necrotice sunt mai frecvente.6,15 motivul pentru aceastavariația în distribuție este necunoscută. Este posibil ca predominanțaleziunile de pe lobul stâng să fie legate de așa-numitul flux portal, care esteresponsabil pentru fluxul diferențial al sângelui portal către anumiți lobi ai ficatului. Deoarece C. novyi este probabil absorbit din intestinul mic, iar sângele din acest organ urmează transmiterea portalului către lobul stâng, acest lucru poate duce la afectarea predominantă a acestui lob.6 absența modificărilor asociate encefalopatiei hepatice (de ex., Astrocitoza Alzheimer de tip II asociată cu hiperamonemia) 6 poate sugera că semnele neurologice în acest caz și în cazurile anterioare au fostconsecință a hemoragiilor, congestiei și edemului perivascular observat în creier, legat de toxemia și acțiunea TcnA asupra endoteliului capilar.

INH ar trebui să fie în lista de diagnostice diferențiale ale cailor cu neurologicesemne clinice, toxemie, insuficiență hepatică acută și peritonită. Chiar dacătratamentul cu doze mari de penicilină și tetracicline poate fi eficient împotrivac. novyi, producția avansată de toxine rezultă de obiceiîntr-un prognostic slab.19 în zonele în care boala este în mod clar asociată cu fluturi hepaticeși/sau alți paraziți, reducerea sarcinii parazitare și limitarea accesului animalelor la pășuni slab drenate pot fi încercate ca măsuri preventive.15

având în vedere că se presupune că mai multe boli clostridiale sunt asociate cu descompunerea postmortem accelerată, un aspect important pentru diagnosticul corect alinh este necesitatea evaluării și conservării rapide a țesuturilor după moartea animalului.6,23 istoricul clinic, autopsia de rutină,histopatologia și imunosupresarea C. novyi în leziunile hepatice sunt esențiale pentru a oferi un diagnostic prezumtiv de INH. Deoarece izolarea nu este întotdeaunasucces, având în vedere cerințele anaerobe stricte ale microorganismului,identificarea moleculară prin PCR este un instrument valoros pentru a oferi un diagnostic etiologic și pentru a diferenția C. novyi tip B de alți agenți patogeni clostridiali.