Arabidopsis cmt3 mutațiile cromometilazei blochează metilarea non-CG și tăcerea unei gene endogene | Jiotower

rezultate și discuții

pentru a identifica factorii care controlează metilarea și tăcerea genelor ws PAI, am izolat o variantă mutantă a ws, pai1C251Y, în care tăcerea genei metilate singlet PAI2 poate fi vizualizată prin intensitatea unui fenotip de plantă fluorescentă albastră sub-lumina violet (UV) (bartee și Bender 2001). În tulpina pai1C251Y, singurele surse potențiale de activitate a enzimei PAI sunt gena PAI1, care este paralizată de o mutație missense și gena PAI2, care este redusă la tăcere. Din cauza acestei deficiențe PAI, tulpina acumulează intermediari fluorescenți ai căii triptofanului, precum și afișarea pigmentării frunzelor galben-verzi, dimensiuni reduse, tufă crescută și fertilitate redusă. Cu toate acestea, mutațiile la locul doi care ameliorează tăcerea PAI2 vor suprima fenotipurile cu deficit de PAI (Bartee și Bender 2001). Astfel, am mutagenizat tulpina pai1C251Y și am analizat răsadurile cu fenotipuri fluorescente slabe suprimate. Ca un ecran secundar, am testat metilarea PAI prin analiza Southern blot cu enzime de restricție sensibile la metilare. Mai exact, am testat metilarea cu izoschizomerii HpaII și MspI, care recunosc secvența 5′-CCGG-3′. HpaII este sensibil la metilarea atât a citozinelor interioare (CG), cât și a celor exterioare (GNC), în timp ce MspI este sensibil doar la metilarea citozinelor exterioare. Aceste enzime se scindează o dată în fiecare locus ws PAI și dezvăluie atât densitatea, cât și modelul de metilare pentru fiecare genă (Bender și Fink 1995; Luff și colab. 1999; Melquist și colab. 1999).

din această strategie de screening am izolat 11 alele de pierdere a funcției în gena CMT3 (vezi mai jos și materiale și metode). Mutanții cmt3 din fundalul pai1C251Y au prezentat o fluorescență puternic redusă în dezvoltarea timpurie a răsadurilor și o fluorescență parțial redusă la plantele adulte, cu dimensiuni crescute, tufă scăzută și fertilitate crescută (Fig. (Fig.1).1). Aceste izolate cmt3 fluorescente intermediare nu au revenit la nonfluorescență, care este diagnosticul pierderii metilării PAI2 reziduale (Bender și Fink 1995), la o frecvență detectabilă. Au prezentat clivaj parțial crescut cu HpaII și clivaj puternic crescut cu MspI pentru genele PAI în raport cu pai1c251y parental (Fig. (Fig.2A).2A). Modelul de clivaj a sugerat că mutanții cmt3 au fost cei mai afectați în menținerea metilării GNC a genelor PAI. Pentru a determina dacă mutanții cmt3 au afectat și metilarea unei secvențe genomice foarte repetate, am reprobat hpaii/MspI Southern blot cu o sondă la secvențele repetate asociate centromerilor (cen) de 180 bp (Vongs și colab. 1993). Această sondă a evidențiat un efect redus asupra clivajului HpaII, dar a crescut clivajul MspI, în concordanță cu modelul observat pentru genele PAI (Fig. (Fig.2B).2B). Un model similar de scindare crescută a MspI a fost observat și la ADNR repetate (datele nu sunt prezentate). Toate alelele 11 cmt3 testate au avut modele de metilare identice în aceste teste. Mai mult, atunci când alelele cmt3 au fost separate departe de alela pai1C251Y într-un fundal ws de tip sălbatic, au afișat, de asemenea, modele de metilare identice în aceste teste (Fig. (Fig.2).2). Modelele de metilare PAI și CEN au fost distincte de modelele induse de mutațiile caracterizate cu deficit de metilare ddm1 și met1 (Fig. (Fig.2; 2; Bartee și Bender 2001).

pentru a determina mai precis modelele de metilare în fundalul mutant cmt3, am efectuat secvențierea genomică a modelelor de metilare în regiunile promotor PAI1 și PAI2 ale unei alele reprezentative cmt3 folosind bisulfit de sodiu mutageneză (Frommer și colab. 1992). Această analiză a arătat că majoritatea citozinelor metilate (87% în PAI1 și 70% în PAI2) au apărut la reziduurile de CG (Fig. (Fig.3; 3; Tabelul Tabel1).1). Comparativ cu promotorul ws pai1 de tip sălbatic (Luff și colab. 1999; tabelul Tabel1), 1), metilarea CG a fost redusă cu 34%, metilarea CNG a fost eliminată, iar metilarea asimetrică a fost redusă cu 93%; în promotorul PAI2, metilarea CG a fost redusă cu 8%, metilarea CNG a fost redusă cu 92%, iar metilarea non-CG a fost redusă cu 75%. Astfel, pierderea funcției CMT3 are un efect puternic asupra menținerii GNC și metilarea asimetrică și un efect mai slab asupra menținerii metilării CG. Aceste rezultate sunt în concordanță cu rapoartele conform cărora Arabidopsis CMT3 și porumb ZMET2 sunt importante pentru menținerea metilării GNC la diferite situri genomice (Lindroth și colab. 2001; Papa și colab. 2001), dar arată în continuare că CMT3 este important și pentru menținerea metilării asimetrice pentru genele PAI. Acest rezultat implică fie că CMT3 controlează direct metilarea simetrică și asimetrică, fie că reducerea metilării simetrice în fundalul mutant cmt3 determină metilarea asimetrică redusă ca o consecință secundară. Deoarece secvențele metilate din promotorul și primul exon al genei reporter PAI2 (370 BP) conțin doar 16 motive CG dispersate, pierderea metilării non-CG hipometilează semnificativ această regiune a genei (Fig. (Fig.3), 3), reprezentând expresia îmbunătățită PAI2 în mutantul supresor.

locusul mutant cmt3 din izolatele supresoare pai1C251Y cmt3 a fost cartografiat de cruci cu tulpina polimorfă Nd-0, care are un aranjament similar de gene PAI dens metilate așa cum se găsește în WS (Melquist și colab. 1999). Descendenții F2 cu fenotipuri slab fluorescente diagnosticul de homozigozitate atât pentru pai1C251Y, cât și pentru cmt3 au fost identificați prin inspecție vizuală sub lumină UV și confirmați De MspI Southern blot pentru clivaj PAI puternic similar cu cel observat la izolatele supresoare parentale. O populație de cartografiere a plantelor F2 care îndeplineau aceste criterii a fost apoi utilizată pentru a înscrie loci genomici legați de fenotipul suprimat. Analiza de cartografiere a relevat legătura cu un singur locus pe brațul inferior al cromozomului 1. Deoarece gena citozin metiltransferazei presupuse CMT3 se mapează la acest locus, ne-am concentrat pe această genă ca candidat. În cadrul fiecărei populații de cartografiere, am găsit o legătură completă cu un marker polimorf care se află la 100 kb de gena CMT3. Pentru a confirma că gena CMT3 a fost de fapt locul mutațiilor supresoare de metilare, am clonat și secvențiat gena din cele 11 izolate mutante. Secvențierea a relevat o singură schimbare de bază în secvența de codare CMT3 în fiecare izolat. Trei dintre alelele mutante au afectat aminoacizii absolut conservați în domeniul catalitic al metiltransferazei, inclusiv alela reprezentativă cmt3G456D utilizată pentru secvențierea bisulfitului. S-a prezis că o altă alelă va termina prematur proteina. Două alele au creat mutații ale joncțiunii de îmbinare. Restul de cinci alele au afectat aminoacizii dintre motivul metiltransferazei IV și capătul C al proteinei care sunt foarte conservate printre genele CMT (Fig. (Fig.4).4).

pentru a confirma în continuare că gena CMT3 a fost locusul mutant, am transformat izolatele pai1C251Y cmt3 cu o clonă genomică ws de tip sălbatic a genei CMT3. Răsadurile transformante au fost puternic fluorescente, similar cu cele ale tulpinii pai1C251Y (Fig. (Fig.1).1). Liniile transformante testate prin analiza Southern blot în generația T2 au arătat remetilarea genei PAI2 la nivelurile observate în tulpina inițială pai1C251Y (datele nu sunt prezentate). Astfel, gena CMT3 clonată ar putea completa defectele de metilare mutante. Ca control, mutantul reprezentativ pai1C251Y cmt3G456D a fost, de asemenea, transformat cu o clonă genomică ws de tip sălbatic a genei CMT2. Răsadurile transformante CMT2 au fost slab fluorescente, similar cu cele ale tulpinii parentale netransformate (Fig. (Fig.1), 1) și nu a prezentat remetilarea detectabilă a PAI2. Această analiză arată că CMT2 nu poate înlocui funcția CMT3. În acest sens, este interesant de observat că CMT2 diferă de CMT3 în primul rând în secvența sa N-terminală (Fig. (Fig.44).

tulpini Arabidopsis caracterizate anterior cu deficit de metilare, cu defecte fie în gena legată de factorul de remodelare a cromatinei SWI2/SNF2 DDM1 (Jeddeloh și colab. 1999) sau gena CITOZIN metiltransferazei Met1 legată de Dnmt1 prezintă anomalii progresive de dezvoltare (Finnegan și colab. 1996; Kakutani și colab. 1996; Ronemus și colab. 1996). Analiza noastră preliminară a tulpinilor consangvinizate de șase generații pai1c251y cmt3 și cmt3 consangvinizate de două generații nu a evidențiat o segregare evidentă a modificărilor morfologice. Această diferență între cmt3 și alți mutanți cu deficit de metilare este probabil să reflecte faptul că metilarea CG este reținută într-un grad mai mare în cmt3 decât în ddm1 sau met1 (Fig. (Fig.2; 2; Bartee și Bender 2001). Deoarece multe dintre siturile metilate endogene din genomul Arabidopsis, cum ar fi repetările CEN (Fig. (Fig.2; 2; Vongs și colab. 1993; Lindroth și colab. 2001) și promotorul genei homeo-domeniu FWA (Soppe și colab. 2000; Lindroth și colab. 2001), transporta în principal metilarea CG, mutațiile cmt3 nu ar fi de așteptat să afecteze puternic aceste loci. În schimb, CMT3 acționează cel mai probabil ca o metilază de întărire care adaugă un strat suplimentar de metilare la anumite regiuni genomice, cum ar fi genele PAI, în care densitatea crescută de metilare duce la creșterea tăcerii. Un model specific este că stratul bazal de metilare CG furnizat de alte funcții, cum ar fi MET1, ar putea servi drept ghid pentru CMT3, care ar decora apoi stratul bazal cu metilare suplimentară CG și non-CG. Recrutarea CMT3 în regiunile vizate ar putea implica interacțiuni ale proteinei cromatinei cu motivul cromodomenului (Henikoff și Comai 1998), împreună cu interacțiuni mediate de secvențele unice n-terminale.

deoarece ciupercile precum Neurospora crassa și Ascobolus immersus pot menține metilarea non-CG (Selker și colab. 1993; Goyon și colab. 1994), aceste organisme ar putea codifica genele CMT. În schimb, deoarece animalelor precum oamenii și șoarecii le lipsește metilarea non-CG, se estimează că acestor organisme le lipsește genele CMT, așa cum este cazul din analizele bazelor de date de secvențe actuale. Lipsa aparentă a metilazelor asemănătoare CMT în genomii animalelor (Finnegan și Kovac 2000) sugerează că animalele au evoluat mecanisme alternative pentru consolidarea stărilor de cromatină.