Rafinarea filumului Chlorobi prin rezolvarea filogeniei și potențialului metabolic al reprezentantului unei linii profund ramificate, necultivate

reconstrucția genomică a NICIL-2
analiza filogenetică a NICIL-2
reconstrucția metabolică a NICIL-2
metabolismul carbonului
metabolismul azotului și sulfului
biosinteza aminoacizilor
Electron transport
flagelul și chemotaxia

reconstrucția genomică a NICIL-2

analiza compozițională a comunității microbiene a consorțiilor bacteriene termofile adaptate să crească pe substraturi de biomasă (celuloză, xylan și switchgrass), ca sursă unică de carbon la 60 C, a identificat în mod constant un omniprezent OTU97 care a fost îndepărtat legat de membrii de cultură ai filului Chlorobi (Eichorst și colab., 2013, 2014). Secvențierea metagenomică a unui consorțiu adaptat să crească pe iarbă de comutare pretratată ionic-lichid, în care OTU97 legat de Clorobi a fost abundent, a fost efectuată pentru a înțelege filogenia și potențialul metabolic al populației care a fost reprezentată de acest OTU97. Asamblare (a se vedea materiale și metode) și binning automat (Wu și colab., 2014) din metagenomul acestui consorțiu a dat 20 de coșuri genomice (tabelul suplimentar S3), dintre care cele mai abundente coșuri au fost o populație strâns legată de tulpina Chitinophagaceae NYFB (61,8%), care a fost izolată dintr-o îmbogățire înrudită cultivată pe celuloză (Eichorst și colab., 2013) și coșul legat de Clorobi (23,1%). Containerele prezente la > 1% au inclus mai multe populații necultivate grupate cu Paenibacillaceae (containerele 003 și 006), o populație necultivată grupată cu verrucomicrobia subdiviziunea 3 (bin 004) și o populație strâns legată de Thermobipora bispora (bin 005), un termofil actinobacterian.

coșul legat de Clorobi a fost numit NICIL-2 (pentru lichidul Ionic de Compost Newby Island-al 2-lea din abundență). Analiza proteinelor prezise din genomul NICIL – 2 a fost în concordanță cu identificarea sa ca populație înrudită la distanță cu membrii superfilului FCB, Bacteroidetele (33%) și Ignavibacteriile (15,7%) având cele mai strâns legate secvențe proteice (Figura 1). Genomul de proiect nicil-2 recuperat a fost relativ mic (2,67 Mbps) și aproape complet (95,3%; 102 din 107 gene marker cu o singură copie în 152 schele). Lungimea N50 pentru proiectul genomului NICIL-2 a fost de 168 929 bp, iar cel mai mare contig a fost 1.1 MB, sugerând că majoritatea schelelor au reprezentat un ansamblu de înaltă calitate (Tabelul 1).

Tabelul 1 Caracteristicile genomice ale nicil-2 bin

analiza filogenetică a NICIL-2

o genă ARNr 16S (1451 bp) a fost recuperată din Proiectul genomului NICIL-2. Ribotipul cel mai strâns legat de gena 16S rRNA a NICIL-2 (>99% identic) a fost secvențiat dintr-o clonă fosmidă (JFF029_06) recuperată dintr-un flux termic (70 CTC) într-o secvență de mină de aur Japoneză (Nunoura și colab., 2005). Genele ARNr 16S de la reprezentanții culturali ai Bacteroidetes și Chlorobi au fost < 85% identice cu secvența NICIL-2. Un arbore filogenetic construit prin alinierea secvențelor genei ARNr 16S legate de NICIL-2 a demonstrat că linia care conține NICIL-2 era distinctă de Bacteroidete și Clorobi (Figura 2). Linia NICIL-2 conținea două linii de coborâre bazate pe Temperatura mediului de eșantionare. Clusterul de temperatură înaltă (reprezentat în roșu în Figura 2) a inclus ribotipuri recuperate în principal din medii cu temperaturi ridicate cuprinse între 55 și 80 de Centimetre C, cum ar fi clona OPB56 (Hugenholtz și colab., 1998). Cel de-al doilea grup a inclus ribotipuri recuperate în principal din medii cu temperaturi moderate cuprinse între 20 și 32 de grade c (ilustrate în verde în Figura 2). Deoarece OPB56 a fost prima clonă descoperită care este afiliată cu acest cluster filogenetic, linia care conține NICIL-2 este denumită clada OPB56. O vedere extinsă a arborelui genei ARNr 16S este descrisă în figura suplimentară S1.

pentru a stabili mai complet afilierea filogenetică a NICIL-2 și a cladei OPB56, s-au obținut secvențe suplimentare de proteine ribozomale din datele recuperate din probe naturale. Omologii a 22 de gene ribozomale conservate în NICIL-2 au fost găsiți în două Clone Fosmide cu arc termic Japonez (JFF029_C06 și JFF027_B02). Acest set de 22 de proteine ribozomale a fost utilizat pentru a căuta seturi de date metagenomice din medii cu temperaturi ridicate. Seturi Complete ale acestor gene ribozomale conservate au fost identificate în patru seturi de date metagenomice obținute din medii cu temperaturi ridicate. Legarea automată a acestor seturi de date a recuperat șase proiecte de genomuri aproape complete (>90% complete) care conțineau secvențe pentru cele 22 de proteine ribozomale conservate din genomul NICIL-2 și clonele Fosmide ale minei de aur japoneze (tabelul suplimentar S4). Cinci din cele șase secvențe de proteine concatenate grupate în linia OPB56 cu NICIL-2, în timp ce una dintre secvențele din Yellowstone Fairy Falls grupate cu Ignavibacteria (figura 3a). Acest arbore filogenetic a demonstrat că Clorobea, Ignavibacteria și OPB56 au format o cladă monofiletică cu încredere ridicată (97%). Bacteroidetele au format un cluster distinct, iar familia Rhodothermaceae, a cărei afiliere cu Bacteroidetele a fost pusă la îndoială (Nolan și colab., 2009), au fost afiliate cu Bacteroidetes cu mare încredere (>80%). Un al doilea arbore filogenetic a fost construit prin concatenarea unei alinieri de 86 de gene cu o singură copie împărtășite între Bacteroidete, Clorobi și Fibrobacter (figura 3b). Acest arbore a reprodus topologia observată pentru gena construită din cele 22 de gene ribozomale, susținând în continuare afilierea Clorobeei, Ignavibacteriei și OPB56.

o abordare complementară a înțelegerii relațiilor evolutive dintre Bacteriodete și Clorobi a fost identificarea indels în proteinele conservate (Gupta și Lorenzini, 2007). Inserțiile în ADN polimeraza III (28 aa) și sintetaza alanil-Tarn (12-14 aa) care sunt conservate în rândul GSB și absente în rândul Bacteriodetelor au fost atribuite ca fiind caracteristice filului Chlorobi. Aliniamentele acestor două proteine (figurile suplimentare S2 și S3) indică faptul că inserția ADN polimerazei III în secvențele de proteine GSB nu este prezentă în proteinele prezise din genomii Ignavibacteriae și NICIL-2, în timp ce 2-3 aminoacizi ai inserției în secvențele de sintetază alanil-Tarn GSB sunt conservate în secvențele de proteine Ignavibacteria și NICIL-2.

reconstrucția metabolică a NICIL-2

fiziologia NICIL-2 a fost dedusă prin reconstrucția metabolică și potențialul său metabolic în comparație cu reprezentanții GSB (Chlorobaculum tepidum), Bacteroidetes (Rhodothermus marinus și salinbacter ruber) și Ignavibacteria (Ignavibacterium album și Meliobacter roseus). Genele care codifică proteinele legate de fotosinteză, inclusiv omologii lui C. subunitățile Centrului de reacție fotosintetică a lui tepidum (CT1020, pscB, psC, pscD), proteinele învelișului clorozomului (csmABCDEFHIJX) și proteinele bacterioclorofilei a (fmoA), sunt absente în toate celelalte genomi, distingând GSB în acest set comparativ (Eisen și colab., 2002). Un rezumat vizual al reconstrucției metabolice este prezentat în Figura 4. Pentru informații complete despre gene, numere de cutie și abrevieri, consultați tabelele suplimentare S5 și S6.

metabolismul carbonului

genomul NICIL-2 codifică un set complet de gene pentru glicoliză, ciclul TCA și gluconeogeneza (Figura 4). Genele pentru ciclul rTCA, care sunt prezente și exprimate pentru fixarea autotrofică a carbonului în GSB, sunt absente. Mai mult, prezența genelor care codifică cofactorii care conțin acid lipoic în complexele piruvat dehidrogenază și dehidrogenază de la de-cetoglutarat de la de-cetoglutarat sugerează că ciclul TCA funcționează în direcția oxidativă. Cea mai mare parte a ciclului rTCA a fost reconstruită în R. marinus și I. album, incluzând mai multe oxidoreductaze piruvat-feredoxin și oxidoreductaze-cetoglutarat-feredoxin-oxidoreductaze, două enzime necesare pentru ciclul rTCA. Genomurile I. album și R. marinus nu au citrat lyase dependent de ATP, o enzimă critică pentru a finaliza ciclul rTCA (Buchanan și Arnon, 1990). S-a propus ca I. album să poată utiliza un citrat liază independent de ATP pentru a funcționa în ciclul rTCA, deși această afirmație este netestată experimental și nici I. album, nici R. marinus nu s-au dovedit a crește autotrofic (Liu și colab., 2012a).

în ciuda abundenței relative ridicate în culturile adaptate care cresc pe biomasă vegetală, NICIL-2 a avut o capacitate enzimatică surprinzător de limitată de a deconstrui biomasa complexă. Comparația potențialului metabolic pentru hidroliza polizaharidelor între cele 20 de pubele extrase din metagenom din îmbogățirea pretratată cu iarbă de comutare a demonstrat că NICIL-2 are relativ puține gene pentru deconstrucția celulozei și hemicelulozei în comparație cu alți membri ai comunității microbiene (figura suplimentară S4). În special, tulpina NYFB, populația verrucomicrobiană și Firmicutele Gram-pozitive multiple au repertorii mai extinse de gene pentru hidroliza polizaharidelor. Inspecția suplimentară a genomilor afiliați opb56 reconstruiți din probe naturale la temperaturi ridicate a demonstrat că lipsa genelor pentru hidroliza polizaharidelor a fost comună acestei clade. Printre genomii care se grupează cu Bacteroidetes și Chlorobi, R. marinus, M. roseus și Yellowstone Obsidian Pool Bin 062, care se grupează cu Ignavibacteria, poseda un repertoriu extins de hidrolaze glicozidice pentru a deconstrui biomasa plantelor. Aceste analize sugerează că NICIL-2 și membrii înrudiți ai cladei OPB56 nu sunt probabil implicați în deconstrucția primară a biomasei în comunitatea adaptată și în mediile naturale. Este posibil ca NICIL-2 să crească pe monomeri sau oligomeri de zahăr; cu toate acestea, în genom a fost identificată o singură genă transportoare de dizaharide prezisă.

deși selecția pentru NICIL – 2 a avut loc în condiții aerobe, poate avea capacitatea de fermentare. Genele pentru producerea fermentativă a etanolului sunt prezente (prin alcool dehidrogenază, EC 1.1.1.1), în timp ce genele pentru formiat (prin piruvat formiat liază, EC 2.3.1.54), lactat (prin lactat dehidrogenază, EC 1.1.1.27) și propionat (prin metilmalonil-CoA carboxil transferază, 2.1.3.1) sunt absente. Genomul NICIL-2 codifică o genă pentru fosfotransacetilază (EC 2.3.1.8), dar nu acetat kinază (EC 2.7.2.1), ambele fiind necesare pentru producția de acetat fermentativ. Atât I. album, cât și M. roseus conțin gene pentru producerea de lactat și acetat, în timp ce C. tepidum nu.

metabolismul azotului și sulfului

genele pentru asimilarea amoniului, glutamina sintaza (EC 6.3.1.2) și glutamat sintaza (EC 1.4.1.13) au fost detectate în genomul NICIL-2. Cu toate acestea, nu au fost identificate gene pentru reducerea diferită a nitraților, reducerea asimilării nitraților, denitrificarea, fixarea azotului și nitrificarea. C. tepidum codifică genele NIF necesare pentru fixarea N2, în timp ce M. roseus (Kadnikov și colab., 2013), I. album (Liu și colab., 2012a) și R. marinus (Nolan și colab., 2009)nu. C. tepidum este un oxidant de sulf obligatoriu și, prin urmare, poate oxida sulfura, tiosulfatul, sulfitul și sulful elementar. C. tepidum oxidează preferențial sulfura în sulf elementar, apoi sulful elementar și tiosulfatul în sulfat (Chan și colab., 2008). În plus, sulfitul poate fi oxidat atunci când este furnizat în mediul de creștere, dar nu poate susține C. tepidum ca unic donator de electroni (Rodriguez și colab., 2011). NICIL-2, I. album, M. roseus și R. marinus nu are toate genele necesare pentru oxidarea compușilor cu sulf redus.

biosinteza aminoacizilor

genomului NICIL-2 îi lipsesc multe gene cheie pentru biosinteza aminoacizilor. Căile Complete sunt codificate pentru alanină, arginină, asparagină, aspartat, alanină, glutamat, glicină, lizină și metionină. NICIL – 2 nu are ilvC și leuABCD și, prin urmare, posedă căi incomplete pentru biosinteza valinei, leucinei și izoleucinei. În mod similar, I. genomului albumului îi lipseau toate genele necesare pentru biosinteza valinei, leucinei și izoleucinei din piruvat, cu excepția amino transferazei cu lanț ramificat (ilvE), în timp ce M. roseus și C. tepidum conțin căi complete. Nici NICIL – 2, Nici I. album codifică genele necesare pentru biosinteza prolinei din glutamat (proBAC), în timp ce atât C. tepidum, cât și M. roseus o fac. Gena sârbă pentru biosinteza serinei lipsește în NICIL-2, I. album, M. roseus și se găsește în unele GSB, inclusiv C. tepidum. NICIL – 2 poate utiliza, de asemenea, aminoacizi ca substraturi de creștere. Complete degradation pathways are present for branched-chain amino acids (leucine, isoleucine and valine), similar to pathways observed in ‘Candidatus Thermochlorobacter aerophilum’ (Liu et al., 2012b).

Electron transport

The major electron transport chain components were identified in the NICIL-2 genomes including: NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I, EC 1.6.5.3), membrane-bound succinate dehydrogenase (Complex II, EC 1.3.5.1), quinol-oxidizing alternative Complex III (ACIII) (Yanyushin et al., 2005; Pereira et al., 2007), several cytochrome c oxidases (Complex IV, EC 1.9.3.1) and an F-type H+-transporting ATPase (Complex V, EC 3.6.3.14). NICIL-2 contains one complete set of genes for NADH:ubiquinone oxidoreductase (14 subunits, nuoABCDEFGHIJKLMN), although they are not assembled in one operon (Supplementary Figure S6). În schimb, majoritatea genelor sunt aranjate independent pe cea mai mare schelă NICIL-2 (nuoGHI, nuoJK, nuof, nuoD, nuoE și nuomn), iar genele rămase se găsesc pe trei schele mai mici (nuoAB, nuoL și nuoC), indicând faptul că absența unei structuri operonice nu este un artefact al asamblării. C. tepidum conține un set de gene care codifică NADH:ubichinonă oxidoreductază care nu are nuoEFG (11 subunități). I. album și M. roseus conțin două seturi de nuoABCDHIJKLMN și un set de nuoefg fiecare (figura suplimentară S6). Interesant este că complexul i de la NICIL-2 este cel mai strâns legat de cele ale Rhodothermus marinus și salinibacter ruber ale Bacteroidetelor, ambele conținând un set complet de gene pentru NADH:ubichinon oxidoreductaza (figura 5a). Omologii pentru cele 11 subunități complexe i au fost, de asemenea, identificați în toate cele șase coșuri legate de NICIL-2 recuperate din Yellowstone și Great Boiling Spring și un ansamblu concatenat al acestor secvențe proteice grupate cu secvențele din NICIL-2.

ACIII este o nouă clasă de oxidoreductaze cu membrană bacteriană găsite în organisme cărora le lipsește adesea complexul bc1 (Yanyushin și colab., 2005). ACIII de la R. marinus (Pereira și colab., 2007; Refojo și colab., 2013) și bacteria fototrofă anoxigenică filamentoasă Chloroflexus aurantiacus (Gao și colab., 2009, 2013) a fost purificat și studiat. Recent, un număr mare de grupuri de gene care codifică subunitățile ACIII, cu variații în Constituție și organizare, au fost găsite într-o serie de genomi bacterieni (Refojo și colab., 2013). De exemplu, R. marinus conține genele actABCDEF într-un operon care codifică șase subunități ACIII; omologii acestui grup de gene au fost identificați în mai mulți membri ai Bacteroidetelor (Thiel și colab., 2014). Un arbore filogenetic descrie relația ACIII de la NICIL – 2 cu rudele sale cele mai apropiate (figura 5b). GSB nu posedă ACIII și, prin urmare, nu sunt reprezentați în acest copac. Cu toate acestea, ‘ Candidatus Thermochlorobacter aerophilum, care nu este membru al GSB, codifică un ACIII care funcționează probabil în respirația aerobă (Liu și colab., 2012b). Este important de menționat că atât I. album, cât și M. roseus sunt unice printre acest set de ACIII, deoarece conțin cinci subunități, subunitățile actDE fiind identificate ca o proteină de fuziune. O completare completă a genelor care codifică toate subunitățile ACIII, care au fost recuperate din două coșuri genomice legate de NICIL-2 din metagenomii Yellowstone, s-au dovedit a conține fuziunea actDE și grupate cu I. album și M. roseus. NICIL – 2 nu conține această fuziune, iar genele pentru complexul său ACIII sunt mai strâns legate de R. marinus și S. ruber.

acceptorii de electroni terminali NICIL-2 includ un tip-AA3 citocrom C oxidază (Complex IV) și posibile citocrom C oxidaze alternative, adnotate ca CoxMOP. NICIL – 2 este puțin probabil să fie microaerofil, deoarece oxidazele de tip cbb3 nu au fost detectate în genom. În plus, citocromul bd a fost nedetectat. Pentru comparație, atât genomii I. album, cât și M. roseus conțin gene pentru citocromul c oxidază de tip cbb3 și un complex citocrom bd.

genomul NICIL-2 conține un set incomplet de gene pentru bărbați pentru sinteza menaquinonei. O cale biosintetică completă a menaquinonei conține menFDHCEBAG (Bentley și Meganathan, 1982), iar genomul NICIL-2 include doar menBAG. Pentru comparație, C. tepidum și I. albumul conține căi complete pentru bărbați, în timp ce genomii M. roseus și R. marinus au adnotări pentru toate genele necesare, cu excepția menB și, respectiv, menH. Omologi ai genelor care codifică enzimele căii biosintetice alternative a menaquinonei ,calea futalozinei (Arakawa și colab., 2011), au fost nedetectate în NICIL-2. Genele biosintetice Ubiquinone sunt, de asemenea, absente. Genomul NICIL – 2 poate avea o acoperire incompletă în această zonă și pot fi găsite gene suplimentare pentru bărbați cu un genom complet asamblat. Alternativ, NICIL – 2 se poate angaja în schimbul de chinone cu alți membri ai comunității, așa cum s-a observat pentru consorțiul fototrofic ‘Chlorochromatium aggregatum’ (Liu și colab., 2013).

flagelul și chemotaxia

genele care codifică proteinele pentru corpul bazal, cârligul și ansamblul filamentului sunt prezente în genomul NICIL-2. Cu toate acestea, NICIL-2 nu are gene care codifică mașinile de chemotaxie, în afară de o proteină reglatoare, CheY. GSB sunt considerate a fi non-motile și lipsite de chemotaxie și flagelă, în timp ce I. album, M. roseus și R. marinus au mașini flagelare și chemotaxie.