sinteza colagenului

reglarea sintezei colagenului osos

sinteza colagenului în culturile de organe ale calvariilor rozătoarelor și culturilor celulare a fost evaluată folosind mai multe teste diferite . În testul cel mai utilizat, calvariile și celulele sunt incubate cu prolină marcată radioactiv timp de câteva ore înainte de sfârșitul culturii. Încorporarea prolinei marcate radioactiv în proteina digerabilă de colagenază (etichetarea CDP) și proteina necolagenă (etichetarea NCP) este măsurată în extracte din culturi folosind colagenază bacteriană foarte purificată . Sinteza procentuală de colagen este calculată din valorile CDP și NCP după corectarea abundenței mai mari a prolinei în colagen în raport cu proteinele necolagene . Producția de colagen poate fi determinată și prin măsurarea conținutului de hidroxiprolină din culturile de celule sau organe, deoarece hidroxiprolina este practic unică pentru colageni. Aceste metode nu fac distincție între diferite tipuri de colagen fibrilar. Cu toate acestea, colagenul sintetizat de culturile de organe osoase și majoritatea culturilor de celule osteoblastice este în mare parte de tip I (>95%), astfel încât valoarea etichetării CDP reflectă de obicei sinteza colagenului de tip I. Dacă se dorește, producția de diferite tipuri de colagen se poate distinge prin cromatografie cu schimb de ioni și electroforeză în gel de poliacrilamidă a extractelor radiomarcate din culturi de celule sau organe . Expresia colagenului de tip I în culturile de celule umane a fost, de asemenea, evaluată prin măsurarea secreției procolagenului I C-terminal propeptidă . În cele din urmă, sonde specifice ADNc în Northern blotting și primeri specifici alelei în testele de reacție în lanț reverstranscriptază-polimerază au fost utilizate pentru a evalua expresia ARNm de colagen în modelele osoase. Măsurarea efectului 1,25 (OH)2D3 asupra sintezei colagenului și a nivelurilor de ARNm a dat rezultate comparabile folosind aceste teste diferite.

1,25(OH)2D3 inhibă sinteza colagenului în culturile de organe ale calvariilor de șobolan fetal de 21 de zile și calvariilor de șoarece neonatale, cu efect redus sau deloc asupra sintezei proteinelor necolagene. Inhibarea maximă a sintezei colagenului cu 1,25(OH)2D3 la calvariae de șobolan (aproximativ 50%) are loc la 10 nM . 1,24 R, 25 – (OH)3D3 inhibă, de asemenea, sinteza colagenului, dar este mai puțin puternic decât 1,25(OH)2D3 . 25 – (OH)D3 și 24R,25 (OH)2D3 nu modifică sinteza colagenului sub 100 nM . Metaboliții vitaminei D inhibă sinteza colagenului și stimulează resorbția oaselor lungi de șobolan fetal cu potențe relative similare care se corelează cu afinitatea metaboliților pentru VDR-urile scheletice . Pentru a determina selectivitatea celulară a inhibării 1,25(OH)2D3 a sintezei de colagen, culturile de organe ale calvariilor de șobolan fetal au fost tratate cu 1,25 (OH)2D3 timp de 22 ore și apoi incubate cu prolină tritiată pentru ultimele 2 ore de cultură. Osul central (osteoblastele mature) a fost disecat liber de periost (osteoprogenitori mai puțin maturi și fibroblaste) și ambele compartimente au fost analizate separat pentru încorporarea prolinei tritiate. 1,25(OH)2D3 scade sinteza colagenului în osul central, dar nu și în periost, indicând selectivitatea efectului 1,25 (OH)2D3 pentru osteoblastele mature . Folosind un protocol in vivo în care șobolanilor neonatali li s-au administrat injecții multiple de prolină tritiată pentru a marca Radio matricea osoasă nou sintetizată, 25 ng de 1,25(OH)2D3 administrat în zilele 1, 3 și 5 a inhibat sinteza matricei osoase, evaluată prin histomorfometria autoradiografelor tibiei și calvariilor .

1,25(OH)2D3 inhibă , de asemenea , producția de colagen în celulele osteosarcomului osteoblastic de șobolan ROS 17/2.8, celulele osteoblastice primare de șobolan și șoarece și o linie celulară de osteoblast murin imortalizată (MMB-1) . 1,25 (OH)2D3 are un efect inhibitor mai mare asupra sintezei colagenului de tip I în timpul creșterii fazei log a celulelor osteoblastice murine primare decât la confluență, poate pentru că celulele proliferante conțineau mai multe VDR-uri . De asemenea, inhibarea 1,25 (OH)2D3 a sintezei colagenului este mai mare în culturile rare de celule MMB-1 care au niveluri VDR mai mari decât celulele MMB-1 confluente . 1,25 (OH)2D3 inhibarea sintezei de colagen este echivalentă în celulele osteoblastice primare de șobolan rare și confluente , dar numărul VDR nu s-a modificat în timpul creșterii celulelor . Luate împreună, aceste date arată că gradul de inhibare a sintezei de colagen cu 1,25(OH)2D3 este în mare măsură determinat de cantitatea celulară de VDR. 1,25 (OH)2D3 inhibă nivelurile de ARNm de colagen în timpul fazei proliferative a culturilor pe termen lung ale celulelor osteoblastice primare de șobolan și previne formarea nodulilor osoși mineralizați de către aceste culturi . Aceste studii arată că 1,25(OH)2D3 inhibă diferențierea osteoprogenitorilor care formează noduli mineralizați în culturile celulare osteoblastice primare de șobolan . Cu toate acestea, inhibarea formării nodulilor prin 1,25(OH)2D3 poate fi secundară suprimării sintezei de colagen de tip I în culturi.

spre deosebire de efectele inhibitoare descrise mai sus, 1,25(OH)2D3 stimulează tranzitoriu sinteza proteinelor de colagen și necolagen (aproximativ dublă), care atinge vârfuri între 12 și 24 de ore, în linia celulară osteoblastică murină imortalizată MC3T3-E1 . În acest studiu, procentul de colagen sintetizat de culturi (colagen în raport cu sinteza proteinelor totale) nu a fost raportat; ca urmare, nu a fost posibilă determinarea selectivității efectului 1,25(OH)2D3 pentru sinteza colagenului. 1,25 (OH)2D3 crește, de asemenea, expresia colagenului în linia celulară osteosarcom osteoblastică umană MG-63 și culturile primare ale celulelor osteoblastice umane . Interesant este că creșterea sintezei de colagen cu 1,25 (OH)2D3 în celulele MG63 este blocată de proteina 5 care leagă factorul de creștere asemănător insulinei, care interacționează direct cu VDR și previne heterodimerizarea cu receptorul retinoid X RXR . Cu toate acestea, în alte studii, s-a demonstrat că 1,25(OH)2D3 scade sinteza procentuală de colagen în celulele MC3T3-E1 . MC3T3-E1 și MG-63 reprezintă celule preosteoblastice care suferă diferențiere osteogenă in vitro cu acid ascorbic; 1,25(OH)2D3 inhibă creșterea celulară și crește expresia osteocalcinei și activitatea fosfatazei alcaline în ambele linii celulare. Celulele MC3T3E1, la fel ca majoritatea liniilor celulare osteoblastice imortalizate, prezintă variații fenotipice semnificative . Prin urmare, unele dintre aceste rezultate discrepante se pot datora variațiilor celulelor utilizate pentru experimente. În mod colectiv, aceste date sugerează că 1,25(OH)2D3 poate acționa ca un hormon diferențiator în celulele timpurii ale liniei osteoblaste, ceea ce duce la creșterea expresiei colagenului de tip I. În schimb, 1,25 (OH)2D3 inhibă expresia colagenului de tip I în osteoblastele mature.