stabilizarea heterocromatinei prin ceas promovează întinerirea celulelor stem și regenerarea cartilajului

anticorpi

pentru western blotting: anti-ceas (#5157, 1:1.000), anti-HP1a (#2616s, 1:1.000) și anti-HP1y (#2619, 1:3.000) de la tehnologia de semnalizare celulară; anti-kap1 (Ab22553, 1:2.000), anti-Lamin B1 (ab16048, 1:1.000) și anti-LBR (Ab32535, 1:1.000) de la abcam; anti-actină (SC-69879, 1:3.000) de la Santa Cruz biotechnology.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) din sistemele R&D.

pentru citometrie în flux: anti-CD73 (550257, 1:200), anti-CD90 (555595, 1:200), anti-CD44 (550989, 1:200), anti-HLA-ABC (560168, 1:100), anti-CD34 (555822, 1:200), anti-CD43 (560198, 1:200), anti-CD45 (555482, 1:200), anti-cd14 (555398, 1:200) și anti-CD19 (555415, 1:200) din bd Biosciences; anti-CD105 (17-1057-41, 1:200) și anti-pDPN (17-9381-42, 1:200) din ebioscience (San Diego, CA, SUA); anti-cd29 (303004, 1:200) și anti-cd13 (301705, 1:200), anti-cd166 (343903, 1:200) și anti-CD164 (324805, 1:200) din BioLegend (San Diego, CA, SUA).

culturi celulare

ceas+/+ hESCs (hESCs, linia H9, Institutul de cercetare WiCell) și ceas−/− hESCs au fost menținute pe straturi de alimentare care au constat din fibroblaste embrionare de șoarece inactivate cu mitomicină c (MEF) în mediu de cultură hESC. Mediul de cultură hESC conținea DMEM / F12( Thermo Fisher Scientific), înlocuirea serului KnockOut 20% (Thermo Fisher Scientific), 0.1 mm aminoacizi neesențiali (NEAAs, Thermo Fisher Scientific), 2 mm GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 55 unktoetanol (Thermo Fisher Scientific), 1% penicilină/streptomicină (Thermo Fisher Scientific) și 10 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Coreea). Alternativ, hesc-urile au fost cultivate pe Matrigel (bd Biosciences, San Jose, CA, SUA) – plăci acoperite în mediu mTeSR (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada).

atât hmsc-urile derivate din hESC, cât și hmsc-urile primare au fost menținute în mediu MSC care conține MEMa (Thermo Fisher Scientific) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) (Cat# 10099-141, Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM NEAAs (Thermo Fisher Scientific), 1% penicilină/streptomicină (Thermo Fisher Scientific) și 1 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Coreea).

editarea genei mediată de CRISPR/Cas9 în hESCs

editarea genei mediată de CRISPR/Cas9 a fost efectuată prin metode descrise anterior, cu unele modificări.33,34,65 pe scurt, un ghid ARN care vizează exonul 5 al ceasului (CLOCK-gRNA) a fost clonat într-un vector de clonare gRNA (#41824, Addgene) (informații suplimentare, tabelul S1). În urma tratamentului cu un inhibitor de rocă Y-27632 (S1049, Selleck) timp de 24 de ore, hESCs (5 ilft 106) au fost omogenizate în 100 ilft de Opti-mem (Thermo Fisher Scientific) conținând cocteilul plasmidic, care a constat din plasmida donatoare conținând brațele omologice, CLOCK-gRNA și hCas9 (#41815, Addgene) și electroporate într-un sistem Nucleofector 4D (LONZA). Celulele au fost apoi însămânțate pe celule de alimentare MEF. S-a adăugat G418 (100 centig/mL, 11811023, Thermo Fisher Scientific) pentru inițierea selecției pozitive la 2-4 zile după electroporare. După 2 săptămâni de selecție, clonele rezistente la G418 au fost culese și transferate pe o placă cu 96 de puțuri pentru caracterizare și extindere ulterioară. PCR Genomic și western blotting au fost utilizate pentru identificarea editării genomice. În plus, am eliminat caseta de rezistență la neomicină în ceas- / -hESCs prin electroporație cu vectorul pCAG-FLpo-2A-puro. La trei zile de la transfecție, s-a utilizat 1 hectar/ml puromicină (Thermo Fisher Scientific) pentru îmbogățirea celulelor rezistente la puromicină timp de 48 de ore. după 8-12 zile de selecție, coloniile emergente au fost culese și extinse pentru studiul ulterior.

generarea și caracterizarea hMSC

hmsc-urile au fost diferențiate de hesc-urile în urma unui protocol publicat anterior.25,86,87 pe scurt, hESCs au fost disociate în corpuri embrioide (EBs) și tratate cu mediu de diferențiere (mema (Invitrogen) suplimentat cu 10% FBS (Cat# 10099-141,Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1mm NEAAs (ThermoFisher Scientific), 10 ng/mL bFGF, 5 ng/mL TGF XV și 1% penicilină/streptomicină (Gibco)) pe plăci acoperite cu Matrigel timp de 10 zile până la 95% confluență. Apoi, celulele asemănătoare MSC confluente au fost digerate și placate pe plăci acoperite cu Matrigel tratate cu mediu de cultură MSC conținând mema (Invitrogen) suplimentat cu 10% FBS, 0,1 mm NEAAs, 1 ng/mL bFGF și 1% penicilină/streptomicină (Gibco). Apoi, celulele asemănătoare MSC confluente au fost trecute pe plăci acoperite cu gelatină. Hmsc – urile au fost purificate cu diferiți anticorpi corespunzători markerilor specifici hMSC (CD73, CD90 și CD105) de către FACS. Celulele triple-pozitive CD73, CD90 și CD105 au fost caracterizate în continuare de markeri de antigen de suprafață, inclusiv markeri pozitivi, cum ar fi CD44, CD166, CD29, HLA-ABC și CD13 și markeri negativi, cum ar fi CD34, CD43, CD45, CD164, CD14, CD19 și PDPN. Funcționalitatea hMSCs a fost verificată în continuare prin diferențierea față de condrocite, adipocite și osteoblaste. Osteoblastele, condrocitele și adipocitele derivate din hMSCs au fost caracterizate prin colorarea von Kossa (GMS 80045.3, GenMed Scientific Inc., SUA) și colorarea osteocalcinei (indicând osteogeneza), albastru de toluidină (T3260, Sigma) și colorarea aggrecan (indicând condrogeneza) și colorarea cu ulei roșu O (o1391, Sigma) (indicând adipogeneza) urmând instrucțiunile producătorului.

izolarea și cultura hmsc-urilor primare

hmsc-urile primare au fost izolate de gingia diferiților indivizi.23,33,34,65 țesuturile separate de gingie au fost tăiate în bucăți mici (1 mm2) cu ajutorul foarfecelor în TrypLE enzima expresă (1%) Plus Dispase IV și incubate ulterior la 37% C timp de 30 min. Suspensiile tisulare digerate au fost neutralizate cu mediu de cultură MSC și centrifugate la 200 de grame pentru 5 min la temperatura camerei. Peletele rezultate au fost omogenizate în mediu de cultură MSC conținând MEMa (Invitrogen) suplimentat cu 10% FBS (Gibco), 1 ng/mL bFGF și 1% penicilină/streptomicină (Gibco) și placate pe plăci acoperite cu gelatină pentru creșterea hmsc-urilor primare.

luciferase reporter test

plasmida PER2-dLuc a fost un fel de cadou de la E. E. Zhang.88 de celule care adăpostesc PER2-dLuc au fost cultivate până la confluență în plăci de cultură cu 24 de puțuri și sincronizate cu 20 de Forskolin de la 2449 (S2449, Selleck) timp de 2 ore. mediul a fost apoi înlocuit cu mediu de cultură MSC care conține 0,25 mm luciferin (LUCK-1g, GoldBio). Celulele au fost monitorizate într-un luminometru LumiCycle la 37 centiciclu C timp de 5-7 zile; datele generate au fost analizate cu ajutorul software-ului de analiză LumiCycle (Actimetrics). Datele din primul ciclu 24-h au fost excluse din analiza noastră statistică.

sincronizarea hMSC in vitro și analiza circadiană

hmsc-urile au fost placate pe plăci acoperite cu gelatină cu mediu MSC până la confluența a 95%. Pentru sincronizare, celulele au fost apoi tratate cu 20 Forskolin de 2 ore și re-stocate în mediu MSC după spălarea de două ori cu PBS. Celulele au fost colectate începând de la 24 h post-sincronizare la intervale de 3-h pentru 9 puncte de timp, urmate de extracția ARN și detectarea RT-qPCR. Testul neparametric JTK_CYCLE a fost utilizat pentru verificarea oscilațiilor circadiene așa cum s-a descris anterior.89 de fire de timp ale hmsc-urilor cu valori P și q < 0,05 au fost considerate ritmice.

Western blotting

celulele au fost lizate în tampon SDS conținând 4% SDS și 100mm Tris-HCl. Concentrația proteică a fost cuantificată folosind un kit de cuantificare BCA (Thermo Fisher Scientific), iar ~20 de centigg de proteină per probă a fost supusă SDS-PAGE și electrotransferată în membrane PVDF (Millipore). Apoi, membranele au fost blocate cu 5% lapte și incubate cu anticorpi primari și apoi cu peroxidază de hrean (HRP)-anticorpi secundari conjugați. Benzile imunoreactive au fost vizualizate într-un sistem ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). Analizele statistice au fost cuantificate de Image J software (NIH). Fiecare grup a avut trei experimente independente. Semnificațiile statistice au fost evaluate printr-un test T al unui Student nepereche cu două cozi.

microscopie electronică de transmisie

ceasul cu trecere târzie (P9)+/+ și ceasul-/− hMSCs au fost recoltate enzimatic cu TrypLE (Thermo Fisher Scientific) și centrifugate la 500 de grame la 5 min la temperatura camerei. Peletele rezultate au fost fixate cu paraformaldehidă 4% (PFA) în PBS (pH 7,4) pe gheață peste noapte. Celulele au fost ulterior deshidratate într-o serie gradată de etanoli, permeabilizate și încorporate în rășină LOWICRIL HM20. Secțiunile (200 nm) au fost obținute și imaginate cu un microscop electronic cu transmisie Spirit (compania FEI) care funcționează la 100 kV.

colorarea imunofluorescenței

celulele însămânțate pe capace (Thermo Fisher Scientific) au fost spălate de două ori cu PBS. Apoi, celulele au fost fixate cu 4% PFA timp de 30 min, permeabilizate cu 0,4% Triton X-100 în PBS timp de 30 min și blocate cu 10% ser de măgar în PBS (Jackson Immuno Research) timp de 1 h la temperatura camerei. După blocare, celulele au fost incubate cu anticorpi primari la 4 CTC peste noapte. Ulterior, celulele au fost spălate de trei ori cu PBS, incubate cu anticorpi secundari la temperatura camerei timp de 1 oră și spălate de trei ori cu PBS. Nucleele au fost colorate cu Hoechst 33342 (H3570, Thermo Fisher Scientific). Imagistica a fost realizată cu un sistem confocal Leica SP5. Analiza statistică a numărului, intensității și ariei semnalelor de fluorescență a fost cuantificată de Image J software (NIH). Celulele au fost colectate din trei replici biologice. Semnificațiile statistice au fost evaluate printr-un test T al unui Student nepereche cu două cozi. Reconstrucția 3D a colorării H3K9me3 așa cum se arată în Fig. 2f a fost realizat prin secționarea serială a stivei Z la intervale de 50 nm într-un mod convențional pentru până la 50 de imagini cu un sistem confocal Leica SP5 și prelucrat ulterior pentru reconstrucția 3D de către software-ul Imaris (versiunea 7.4.2) așa cum a fost descris anterior.90

testul de colorare SA-colosx-gal

colorarea SA-colosx-gal a fost efectuată conform descrierii din studiile anterioare.33,34 pe scurt, celulele au fost fixate cu tampon de fixare (2% formaldehidă și 0.2% glutaraldehidă) timp de 5 min la temperatura camerei. Apoi, celulele fixe au fost colorate cu soluție de colorare proaspătă la 37 centimetric C peste noapte. Câmpurile de vedere au fost selectate aleatoriu în fiecare godeu, iar procentul de celule SA-XV-gal-pozitive a fost determinat folosind software-ul ImageJ. Fiecare grup a avut trei replici biologice. Semnificațiile statistice au fost evaluate printr-un test T al unui Student nepereche cu două cozi.

test de expansiune clonală

s-a efectuat un test de expansiune clonală așa cum s-a raportat anterior.34,65 pe scurt, 6000 de celule pe godeu au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri și cultivate timp de 9-12 zile. Celulele au fost spălate de două ori cu PBS, fixate cu 4% PFA și colorate cu 0,2% violet cristal timp de 1 oră la temperatura camerei. Câmpurile de vedere au fost scanate de un scaner și măsurate în continuare de ImageJ software (NIH). Fiecare grup a avut trei replici biologice. Semnificațiile statistice au fost evaluate printr-un test T al unui Student nepereche cu două cozi.

Co-IP

celulele HEK293T transfectate cu plasmide care exprimă Flag-Luc sau Flag-CLOCK și hMSCs au fost lizate în tampon de liză de tip gușă (120 mM Naci, 0.3% CHAPS, EDTA de 1 mM, HEPES de 40 mM (pH 7,5) și cocktail complet de inhibitor de protează (Roche)) la 4 centimetric C timp de 4 ore și apoi au fost centrifugate la 14.500 centimetric g la 4 centimetric C timp de 40 min. Pentru Co-IP cu proteine exogene, supernatanții au fost amestecați cu bile cuplate cu anticorpi anti-Flag (A2220, Sigma) și rotite peste noapte la 4% C. Pentru Co-IP cu proteine endogene, supernatanții au fost amestecați cu anticorpii indicați peste noapte la 4% C cu rotație și apoi au fost incubați cu bile de agaroză proteică a/G PLUS (sc-2003, Santa Cruz) pentru încă 4% C cu rotație. Perlele au fost spălate de șase ori cu tampon de CHAPS și apoi eluate cu peptide de pavilion sau prin fierbere în 1 tampon de încărcare SDS pentru 10 minute pentru Western blotting.

analiza LC-MS/MS și identificarea proteinelor

proteinele eluate obținute prin imunoprecipitare au fost supuse la 10% SDS-PAGE și colorate cu coomassie albastru strălucitor (WB-0101, Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd). Benzile de gel care conțineau probele proteice au fost excizate, tăiate în dopuri mici, deshidratate (100% acetonitril), reduse (10 mm DTT în 25 mM NH4HCO3 timp de 45 min la 56 C) și alchilate (40 mM iodoacetamidă în 25 mM NH4HCO3 timp de 45 min la temperatura camerei în întuneric). Apoi, dopurile de gel au fost uscate și digerate cu tripsină modificată de grad secvențial (40 ng pe bandă) în 25 mM NH4HCO3 peste noapte la 37 C. În cele din urmă, acidul formic la o concentrație finală de 1% a fost utilizat pentru a termina reacția enzimatică. Soluția rezultată a fost apoi transferată într-un flacon de probă pentru analiza LC-MS/MS.

experimentele nanoLC-MS/MS au fost efectuate pe un spectrometru de masă exact Q (Thermo Scientific) în modul dependent de date, ceea ce a permis achiziția de date MS la o rezoluție înaltă de 70.000 (m/z 200) într-un interval m/z de 300-1,600. Datele brute din analiza exactă Q au fost analizate cu Proteome Discovery (versiunea 1.4) folosind motorul de căutare Sequest HT pentru identificarea proteinelor și Percolator pentru analiza ratei de descoperire falsă (FDR). Datele au fost căutate în baza de date UniProt human protein database (actualizată la 06-2013). Analiza FDR a fost efectuată cu Percolator, iar FDR < 1% a fost stabilit ca prag pentru identificarea proteinelor. Încrederea peptidelor a fost setată la mare pentru filtrarea peptidelor.

RT-qPCR și ARN-Seq

ARN-ul Total a fost extras din celule umane cultivate sau articulații de șoarece folosind TRIzol (Thermo Fisher Scientific), iar ADN-ul genomic a fost îndepărtat folosind un kit fără ADN (Thermo Fisher Scientific). ADNc a fost generat cu sistemul de transcriere inversă a scriptului Go (Promega). RT-qPCR a fost realizat folosind qPCR Mix (Toyobo) într-un sistem CFX384 în timp real (Bio-Rad). Fiecare grup a avut patru replici bine. Semnificațiile statistice au fost evaluate printr-un test T al unui Student nepereche cu două cozi. Toate experimentele RT-qPCR au fost efectuate cu cel puțin trei replici experimentale și repetate independent de cel puțin două ori. Pentru ARN-seq articular de șoarece, probele de ARN articular de genunchi din același grup de tratament de șoareci în vârstă injectați cu lentivirusuri care exprimă Luc (n = 12 șoareci) sau CLOCK (n = 12 șoareci) au fost amestecate în mod egal în masă, iar ARN-seq a fost efectuat cu două replici tehnice. Pentru hMSC ARN-seq, au fost examinate două replici biologice. O bibliotecă de secvențiere a fost construită folosind un NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit pentru Illumina urmând protocolul producătorului. Bibliotecile generate au fost secvențiate pe platformele Illumina HiSeq X-Ten cu secvențiere pereche cu lungimi de citire de 150 bp. Controlul calității și secvențierea au fost efectuate prin tehnologia novo gene Bioinformatics. Primerii utilizați pentru qPCR au fost prezentați în informații suplimentare, tabelul S2.

prelucrarea datelor ARN-seq

conducta de prelucrare a datelor ARN-seq a fost raportată anterior.34 de citiri brute în pereche au fost tăiate în software-ul Trim Galore (versiunea 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Citirile curate au fost mapate la genomul UCSC human hg19 sau genomul mouse-ului mm10 folosind hisat2 (versiunea 2.0.4).91 fișierele sam au fost convertite în fișiere bam de către SAMtools cu parametrul”- S-b-q 10″.92 apoi, numărul de citire a fost calculat de HTSeq (versiunea 0.11.0) și au fost păstrate numai citiri mapate de înaltă calitate (Calitatea mapării > 20).93 valoarea fragmentelor per Kilobază per milion (FPKM) pentru fiecare genă a fost calculată folosind StringTie (versiunea 1.2.3).94 de gene exprimate diferențiat (DEGs) au fost calculate folosind Pachetul DESeq2 (versiunea 1.22.2) cu limita “valoarea q (valoarea p ajustată, padj) < 0.05 și |log2 (schimbare de pliere)| > 1 pentru hMSCs sau |log2 (schimbare de pliere)| > 0.5 pentru articulațiile mouse-ului”. Gene Ontologie (merge) analiza de îmbogățire a fost realizată cu ToppGene.Analiza îmbogățirii setului de Gene 95 a fost efectuată de GSEA (versiunea 2.2.4). Setul de gene SASP a fost obținut dintr-un studiu anterior.42

DamID-seq

pLgw V5-EcoDam și pLgw EcoDam-V5-EMD au fost Cadouri de la Prof.Bas van Steensel (Institutul Olandez al cancerului (NKI)). DamID-seq a fost efectuat așa cum este descris,58 cu modificări. Pe scurt, lentivirusurile Dam și Dam-EMD generate din celulele HEK293T au fost concentrate prin ultracentrifugare la 19.400 g pentru 2,5 h. peletele de virus au fost omogenizate în PBS. Ceas + / + și ceas− / − hMSCs au fost însămânțate în feluri de mâncare cu șase godeuri la 2 celule 105 pe godeu. Fiecare grup a avut trei replici biologice. A doua zi, mediul de cultură a fost înlocuit cu 2 mL de mediu de cultură proaspăt care conține fie dam, fie dam-EMD lentivirus. La 72 de ore după transducție, celulele au fost recoltate, iar ADN-ul genomic a fost izolat folosind un kit de țesut DNeasy Blood & (69504, Qiagen). Digestia DpnI (R0176S, New England Biolabs), ligarea adaptorului, digestia DpnII (R0543S, New England Biolabs), amplificarea și purificarea PCR au fost efectuate așa cum s-a descris anterior.58 pentru tunderea adaptorului, ADN-ul amplificat a fost sonicat și digerat cu Alwi (R0513s, New England Biolabs). Biblioteca ADN a fost construită folosind un NEBNext Ultra ADN Library Prep Kit pentru Illumina (E7370s, New England Biolabs). Bibliotecile au fost reunite și supuse secvențierii pereche cu lungimi de citire de 150 bp pe secvențele Illumina NovaSeq.

prelucrarea datelor DamID-seq

citirile brute ale datelor Dam și Dam-EMD pentru ceas+/+ și ceas−/− hmsc-urile au fost tăiate în software-ul Trim Galore (versiunea 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Citirile tăiate au fost mapate la genomul uman UCSC hg19 folosind Bowtie 2 (versiunea 2.2.9).96 duplicate PCR au fost eliminate cu Marcaduplicate.programul jar în instrumente Picard. Apoi, citirile au fost sortate cu SAMtools (versiunea 1.6). Pentru a minimiza efectul polarizării și adâncimii secvențierii, citirile procesate din trei replici pentru fiecare eșantion au fost îmbinate. Apoi, același număr (110 milioane) de citiri de înaltă calitate pentru fiecare tip de celulă au fost selectate aleatoriu pentru analiza din aval. Pentru a vizualiza semnalele DamID, am calculat raportul log2 dintre citirile pe Kilobază pe milion de citiri mapate (RPKM) ale semnalelor Dam-EMD și Dam (log2 (Dam-EMD/Dam)) în CLOCK+/+ și CLOCK−/− hMSCs pentru fiecare coș de 10 bp folosind programul bamCompare din software-ul deepTools (versiunea 2.5.4-2-5ee467f).

pentru identificarea regiunilor LAD în CLOCK+/+ și CLOCK−/− hMSCs, am calculat mai întâi semnalele DamID (raportul log2 al RPKM al semnalelor Dam-EMD și Dam (log2 (Dam-EMD/Dam)) în CLOCK+/+ și CLOCK−/− hMSCs pentru fiecare coș de 2 kb folosind programul bamCompare în deepTools (versiunea 2.5.4-2-5ee467f). Apoi, am implementat pachetul R pentru modelele Markov ascunse cu emisii t (HMMt) (versiunea 0.1), pentru a identifica flăcăii (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R).

pentru a compara semnalele DamID în regiunile LAD între CLOCK+/+ și CLOCK−/− hMSCs, am fuzionat regiunile LAD identificate în CLOCK+/+ și clock−/− hMSCs în cele union și am calculat semnalul DamID relativ (semnalul DamID în CLOCK−/− hMSCs minus semnalul DamID în CLOCK+/+ hMSCs) pentru fiecare regiune union LAD. Apoi, semnalele DamID relative pentru regiunile LAD au fost reprezentate grafic folosind Rideograma pachetului R (versiunea 0.2.2), așa cum se arată în informații suplimentare, Fig. S4d.97

ChIP-qPCR și ChIP-seq

pe scurt, 1 ceas 106+/+ și ceas−/− hMSCs au fost reticulate în formaldehidă de 1% (vol/vol) în PBS timp de 8 minute la temperatura camerei, iar reacția a fost încheiată prin incubare cu glicină de 125 mM timp de 5 minute la temperatura camerei. Probele au fost apoi lizate pe gheață pentru încă 10 minute. După Sonicare în Covaris S220 concentrat-ultrasonicator (Covaris) și centrifugare timp de 10 min la 12.000 g la 4 centimetrii c, supernatanți au fost incubate peste noapte la 4 centimetrii C cu proteina a Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, 10004d) conjugat cu un anticorp anti-ceas, un anticorp anti-H3K9me3 sau IgG iepure. Ulterior, eluția și reticularea inversă s-au efectuat la 68 C pentru 2 ore într-un termomixer. Apoi, ADN-ul a fost izolat prin extracția alcoolului fenol-cloroform-izoamilic și precipitarea etanolului. ADN-ul purificat a fost supus qPCR pentru evaluarea ocupației ceasului sau H3K9me3 la secvențe repetitive. Fragmentele îmbogățite au fost construite în biblioteci fără încorporarea comenzilor spike-in prin kituri Kapa Hyper Prep cu PCR Library Amplification/Illumina Series (Kk8504, New England Biolabs) urmând instrucțiunile producătorului. Toate experimentele au fost efectuate de cel puțin două ori cu rezultate similare. Semnificațiile statistice au fost evaluate printr-un test T al unui Student nepereche cu două cozi.

procesare date ChIP-seq

pentru prelucrarea datelor ChIP-seq H3K9me3, citirile brute au fost tăiate cu software-ul Trim Galore (versiunea 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Citirile tăiate au fost mapate la genomul uman UCSC hg19 folosind Bowtie 2 (versiunea 2.2.9).96 de citiri duplicate au fost eliminate cu MarkDuplicates.programul jar în instrumente Picard. Apoi, citirile au fost sortate cu SAMtools (versiunea 1.6). Pentru a minimiza efectul polarizării și adâncimii secvențierii, citirile procesate din trei replici pentru fiecare eșantion au fost îmbinate. Apoi, același număr (130 milioane) de citiri de înaltă calitate pentru fiecare tip de celulă au fost selectate aleatoriu pentru analiza din aval. Pentru a vizualiza semnalele ChIP-seq, am calculat numărul de citire normalizat determinând valorile RPKM pentru fiecare coș de 10 bp. Pentru apelurile de vârf H3K9me3, SICER (versiunea V1.1) a fost utilizat cu parametrul “-w 200-g 3”.98 au fost reținute doar vârfurile h3k9me3 cu o limită FDR de 1% sau mai mare.

pentru identificarea “Munților H3K9me3”, a fost calculat semnalul H3K9me3 în numărări pe milion (CPM) în fiecare vârf H3K9me3. Apoi am clasat vârfurile H3K9me3 în ordinea creșterii semnalului H3K9me3 și am trasat ocuparea ChIP-seq H3K9me3 în Clock+/+ și CLOCK−/− hMSCs, așa cum se arată în informații suplimentare, Fig. S4F. aceste parcele au arătat un punct clar în care semnalul de ocupare H3K9me3 a început să crească rapid. Apoi, au fost determinate punctele de inflexiune ale acestor curbe. Am definit în continuare vârfurile H3K9me3 deasupra punctelor de inflexiune ca “munții H3K9me3” și vârfurile H3K9me3 sub acele puncte ca vârfuri tipice H3K9me3.

ATAC-seq

ATAC-seq a fost efectuat conform descrierii anterioare.99 pe scurt, un total de 50.000 de celule au fost spălate de două ori cu PBS și omogenizate în 50 uqql de tampon de liză (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1% (v/v) nonidet P40 substitut). Suspendarea de nuclee fost apoi centrifugate la 500 × g timp de 10 min la temperatura de 4 °C, urmată de adăugarea de 50 µL de transpunere reacție mix (10 µL de 5 × TTBL-tampon, 4 µL de TTE se amestecă și 36 µL de nuclează-free H2O) dintr-un TruePrep ADN Biblioteca Prep Kit V2 pentru Illuminati (Vazyme Biotech). Probele au fost apoi incubate la 37 centimetric C timp de 30 min. Bibliotecile au fost apoi amplificate și purificate folosind TRUEPREP ADN Library Prep Kit V2 pentru Illumina (Vazyme Biotech). Calitatea bibliotecii a fost evaluată folosind un analizor de fragmente. În cele din urmă, bibliotecile au fost secvențiate pe platformele Illumina HiSeq X-Ten cu secvențiere pereche cu lungimi de citire de 150 bp.

prelucrarea datelor ATAC-seq

pentru prelucrarea datelor ATAC-seq, citirile brute au fost tăiate cu software-ul Trim Galore (versiunea 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Citirile tăiate au fost mapate la genomul uman UCSC hg19 folosind Bowtie 2 (versiunea 2.2.9) cu parametrul “-X 2000-N 1-L 25 –No-mixed –no-discordant-t”.96 duplicat citește au fost eliminate cu MarkDuplicates.programul jar în instrumente Picard. Apoi, citirile au fost sortate cu software-ul SAMtools (versiunea 1.6). Apoi, citirile procesate din trei replici pentru fiecare eșantion au fost îmbinate. Pentru a vizualiza semnalele ATAC, am extins fiecare citire cu 250 bp și am normalizat numărul de citire cu valoarea RPKM pentru fiecare coș de 10 bp. Pentru apelarea vârfului ATAC, MACS2 (versiunea 2.1.1.20160309) a fost utilizat cu parametrul “–nomodel –shift 0 –extsize 250 –call-summits”.100 au fost reținute doar vârfurile ATAC cu valori q < 0,01. Vârfurile ATAC identificate în CLOCK+/+ dar nu în Clock−/− hmsc− urile au fost definite ca vârfuri ATAC “închise”; vârfurile ATAC identificate în CLOCK−/ – dar nu în CLOCK + / + hmsc-urile au fost definite ca vârfuri ATAC “deschise”. Estimarea distribuției genomice a vârfurilor ATAC utilizate annotatePeaks.pl programul în homer software.101

evaluarea reproductibilității datelor de secvențiere

pentru a evalua reproductibilitatea datelor ChIP-SEQ H3k9me3 și ATAC-SEQ, distanța euclidiană dintre duplicate a fost calculată după cum urmează: citirile au fost numărate și normalizate de RPKM la o dimensiune a coșului de 2 kb. Apoi, distanța euclidiană a fost calculată în R (versiunea 3.5.1) pentru a evalua reproductibilitatea. Distanțele euclidiene inferioare înseamnă corelații mai mari. Pentru a evalua reproductibilitatea datelor DamID-seq, analiza componentelor principale (PCA) a fost efectuată în R (versiunea 3.5.1). Pentru a evalua reproductibilitatea datelor ARN-seq, s-au trasat parcele de împrăștiere pe baza numărului de citire normalizat de logaritm (rlog) cu DESeq2 și s-a calculat coeficientul de corelație Pearson între replicate.

experimente pe animale

pentru analiza formării teratomului, șoareci NOD/SCID (6-8 săptămâni, achiziționați de la Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd) au fost injectate cu 3 ceas 106+/+ sau ceas−/− hESCs într-o soluție Matrigel: mTeSR (1:4). Teratoamele au fost recoltate la 8-12 săptămâni după injectare pentru analize suplimentare.

pentru testele de transplant hMSC, 1 ceas 106+/+ sau ceas−/− hMSCs transduse cu lentivirusuri care exprimă Luc au fost injectate în mușchiul TA al șoarecilor goi (6-8 săptămâni). Șoarecii au fost apoi tratați cu D-luciferin (LUCK-1G, GoldBio) și fotografiați cu un sistem de imagistică IVIS Spectrum (Xenogen, Caliper, Waltham, MA, SUA). Imaginile bioluminescenței au fost achiziționate în modul” auto”. Fiecare grup a avut șase replici biologice. Semnificațiile statistice au fost evaluate printr-un test T al unui Student nepereche cu două cozi.

pentru detectarea nivelului de ceas asociat îmbătrânirii, șoarecii de diferite vârste (Tineri, 1 lună, n = 5 șoareci; bătrâni, 15 luni, N = 10 șoareci) au fost eutanasiați și articulațiile au fost colectate pentru analiza RT-qPCR. Semnificațiile statistice au fost evaluate printr-un test T al unui Student nepereche cu două cozi.

pentru a evalua dacă administrarea lentivirală a ceasului ar putea atenua sindroamele legate de îmbătrânire, lentivirusurile care exprimă Luc (n = 14 șoareci) sau CLOCK (n = 13 șoareci) au fost injectate în cavitățile articulare ale șoarecilor în vârstă de 18 luni (achiziționate de la SPF (Beijing) Biotehnologie) și completate după 8 săptămâni de injecție. Experimentul Treadmill a fost efectuat la 15 săptămâni după prima injecție de lentivirusuri care exprimă Luc sau ceas. În detaliu, șoarecii au fost antrenați pe o banda de alergare (SA101, SANS) la o înclinație de 5 centi pe parcursul a 3 zile timp de 20 de minute în fiecare zi, cu viteza accelerată de la 0 la 20 m/min. În ziua testului, șoarecii au alergat pe banda de alergare cu o viteză inițială de 0 m/min, iar apoi viteza a fost mărită cu 2 m/min până la 20 m/min. Întregul timp de funcționare a fost stabilit la 20 de minute. Frecvența stimulului ușor de șoc electric a fost înregistrată și analizată (Luc, N = 14 șoareci; ceas, n = 13 șoareci). Scanarea Micro-CT a fost efectuată la 16 săptămâni după prima injecție (Luc, N = 14 șoareci; ceas, N = 13 șoareci). Șoarecii au fost apoi eutanasiați, iar articulațiile au fost colectate pentru evaluare histologică (Luc, n = 14 șoareci; ceas, N = 13 șoareci) și cuantificarea ARNm (Luc, N = 12 șoareci; ceas, n = 12 șoareci). Semnificațiile statistice au fost evaluate printr-un test T al unui Student nepereche cu două cozi.

Histologie și imunohistochimie

pentru analiza histologică, articulațiile recoltate de șoarece au fost fixate cu 4% PFA timp de 2 zile și încorporate în parafină după decalcifiere timp de 14-21 zile. Secțiunile (5 centimetri) au fost colorate cu fast green FCF (0,02%) și safranin O (0.1%) conform instrucțiunilor producătorului.

colorarea imunohistochimică a fost efectuată utilizând metoda de colorare DAB așa cum a fost descrisă anterior, cu unele modificări.33,34,102 în primul rând, diapozitivele au fost deparafinizate și rehidratate folosind xilen și diferite concentrații de alcool. Recuperarea antigenului a fost efectuată utilizând digestia tripsinei (ZLI-9010, ZSGB-BIO) timp de 20 de minute la temperatura camerei. Peroxidul de hidrogen (3%) a fost utilizat pentru a bloca activitatea peroxidazei endogene prin incubare timp de 10 minute la temperatura camerei. Diapozitivele au fost apoi blocate cu 10% ser de măgar timp de 1 oră la temperatura camerei și incubate cu un anticorp anti-P16 (Ab54210, Abcam, 1:200) la 4 CTC peste noapte și cu un anticorp secundar (PV-6002, ZSGB-BIO) timp de 1 oră la temperatura camerei înainte de colorarea DAB (ZLI-9017, ZSGB-BIO).

declarații etice

experimentele implicate în acest studiu au urmat principiile formatului de cerere pentru aprobarea etică pentru cercetarea care implică animale și au fost aprobate în prealabil de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor al Institutului de Zoologie (Academia Chineză de științe). Anestezia șoarecilor a fost efectuată cu izofluran și eutanasierea a fost efectuată cu CO2 urmată de dislocarea cervicală.

analiza statistică

analizele statistice au fost efectuate cu ajutorul programului Grafic-Pad Prism. Datele sunt prezentate ca mijloace sem sau SD. Comparațiile au fost efectuate cu testul T al elevului nepereche cu două cozi. Valoarea P (p) < 0,05 a fost definită ca fiind semnificativă statistic.