Transformarea pesticidului recalcitrant clordeconă de către Desulfovibrio sp.86 cu trecerea de la declorurarea cu deschidere inelară la activitatea de sulfidare reductivă | Rapoarte științifice

izolarea Desulfovibrio sp.86
analiza genomului Desulfovibrio sp.86
Desulfovibrio sp.86 degradează clordecona în produse de transformare cunoscute, precum și un compus neașteptat care conține sulf
sinteza standardului clordectiol și confirmarea faptului că produsul de transformare F1 este identic cu clordectiolul
capacitatea Desulfovibrio sp.86 pentru a degrada produșii de transformare a clordeconei
investigarea condițiilor de incubație care conduc la sulfidarea reductivă bacteriană
relevanța ecologică a sulfidării reductive a clordeconei

izolarea Desulfovibrio sp.86

izolarea Desulfovibrio sp.86 a fost realizat din consorțiul 865 degradant de clordeconă folosind condiții de reducere a sulfatului. Deoarece consorțiul bacterian 86, capabil să transforme clordecona, a fost obținut dintr-un mediu mineral îmbogățit (MM) numit MM + 5, suplimentat cu clordeconă, compoziția chimică principală a fost păstrată, dar donatorii și acceptorii de electroni au fost modificați. Mai multe formulări media utilizate pentru îmbogățirea bacteriilor reducătoare de sulfat utilizează acizi organici, de exemplu lactat,ca surse de carbon și energie (donator de electroni) și sulfat care este utilizat ca eletron-acceptor pentru creștere15,16,17, 18. În acest context, piruvatul în mediul lichid MM + a fost înlocuit cu lactat și s-a adăugat sulfat (mediu lichid MMD, vezi secțiunea “Metode”). Îmbogățirea a fost răspândită pe agar MMD și coloniile bacteriene asemănătoare vibrio-brune (observate la microscop optic) au fost purificate în continuare prin două dungi suplimentare de plăci (Fig. S1). S-a constatat că o tulpină bacteriană izolată este identică cu Desulfovibrio sp.86 din consorțiul 86 pe baza identităților 100% ale genelor lor 16S rRNA (1538 bp fiecare).

analiza genomului Desulfovibrio sp.86

întregul genom constă dintr-un singur cromozom circular de 3.464.070 bp. Analiza checkm19 efectuată cu 61 de genomi și 284 de linii indică faptul că genomul aparține Deltaproteobacteriilor, iar completitudinea CheckM este de 100% (lipsește zero marker esențial). Conținutul mediu de G + C pentru ADN este de 58,06%. Un total de 3.342 secvențe de ADN codificatoare (CDSs) au fost prezise pentru cromozom, 4 pseudogene și 10 ARN-uri diverse (ARN-diverse), 3 operoni ARNr și 54 de gene Arnt.

cele trei gene ARNr 16S ale Desulfovibrio sp.86 sunt identice. Cele mai bune lovituri de explozie (NCBI) au fost de la desulfovibrio SP necultivat. clone din celule de combustie microbiene, cum ar fi MFC63A04 (Numărul de acces Genbank : FJ823865; acoperire 98%; identitate 99,87%)20. Un arbore filogenetic care utilizează ARNr 16S disponibil al bacteriilor cultivabile a confirmat asemănările dintre Desulfovibrio sp.86 și Desulfovibrio simplex DSM4141 (Numărul de aderare Genbank 16S rRNA: NR_117110; acoperire 99%; identitate 99, 22%; secvență genomică indisponibilă) (Fig. S2) 21. La nivel genomic, Desulfovibrio sp.86 ocupă primul loc cu desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27.774 genom (GenBank: NC_011883). Cu toate acestea, Desulfovibrio sp.86 împărtășește doar 1.408 gene (43%) cu D. desulfuricani (peste 80% identitate de aminoacizi și 80% acoperire de aliniere). În plus, identitățile nucleotidice medii (ANI) între Desulfovibrio sp.86 și genomii Desulfovibrio secvențiați sunt mai mici decât valoarea limită de 95% ANI acceptată în general pentru delimitarea speciilor (Fig. S3) 22. Aceste rezultate indică faptul că Desulfovibrio sp.86 este cel mai probabil o nouă specie a filului Desulfovibrio. Prezența a două superoxid dismutaze și o genă catalază reprezintă toleranța relativă la oxigen. Așa cum era de așteptat, Desulfovibrio sp.86 genomul prezintă un complement genetic extins pentru metabolismul sulfului, cuprinzând căile de respirație a sulfului cu surse anorganice precum sulfat, sulfit, bisulfit și tetrationat ca acceptori de electroni. Sursele organice de sulf pot fi furnizate prin produse de fermentare a biomasei de sulf (sulfoquinovoză a lipidelor sulfoquinovosil) sulfoacetat, aminoacidul taurină non-proteogenic de sulf prin sulfoacetaldehidă sau alcansulfonați23.

Desulfovibrio sp.86 degradează clordecona în produse de transformare cunoscute, precum și un compus neașteptat care conține sulf

capacitatea de degradare a clordeconei a desulfovibrio SP izolat.86 tulpina a fost investigată folosind tehnici GC-MS (spectrometrie de masă cu cromatografie în fază gazoasă) și LC-HRMS (spectrometrie de masă de înaltă rezoluție cu cromatografie lichidă) în condiții de creștere aplicate cu succes pentru Desulfovibrio sp.86 izolare (mediu lichid MMD). Na2S a fost utilizat ca reductant și o atmosferă anaerobă N2/H2 (98/2; V/V) a fost aplicată folosind un sistem de torpedou. Aceste condiții de incubație au dus la dispariția completă a semnalului de clordeconă în GC–MS și LC-HRMS și au dus la profiluri TP GC–MS și LC-HRMS similare cu cele obținute cu Citrobacter sp.866: monohidroclordecona A1, pentacloroindena B1, tetracloroindenii B3-B4 și acizii policloroindenecarboxilici C1-C2 și C3-C4 (Fig. 1a, b). În sistemul torpedoului, culturile bacteriene au fost efectuate folosind flacoane de sticlă de 100 mL cu un film poros hidrofob pentru a permite schimbul de gaze și pentru a evita contaminarea. Această condiție de incubație a fost considerată ca fiind” atmosferă reînnoită ” (RA). În acest sistem, atmosfera a fost reînnoită în mod regulat cu N2/H2 (98/2; V/V), iar cutia nu a fost controlată termostatic, astfel încât temperatura a variat între 25 și 33 C. pentru a controla mai bine condițiile de creștere și degradare, Desulfovibrio sp.86 de culturi au fost introduse în mediu MMD folosind flacoane de sticlă de 100 mL, sigilate cu septa de cauciuc butilic, într-un cuptor la 30 C. flacoanele sigilate au fost inițial purjate cu gaz N2/H2 (98/2; V/V) pentru a asigura anaerobioza. Această condiție de incubație a fost considerată ca fiind condiții de “atmosferă limitată” (CA).

după șase săptămâni de incubare cu clordeconă, pesticidul nu mai era detectabil prin aceleași tehnici analitice. Concomitent, a apărut un singur compus clorurat necunoscut numit F1. A fost detectabil numai prin GC-MS (25,6 min) (Fig. 1c). Ca și în culturile de degradare a clordeconei raportate anterior 5, 6, transformarea principală a clordeconei a apărut în faza staționară (Fig. 1e). Deoarece nu s-a putut observa un vârf clorurat vizibil în LC-HRMS (Fig. 1d), am bazat elucidarea structurală a F1 pe interpretarea datelor GC–MS (Fig. 1f). Presupunând că modelul izotopic superior centrat la M / z 507.8 conținea ionul molecular, am emis ipoteza a două posibile formule neutre pentru F1, C10Cl10O2H2 și C10Cl10SH2. Fragmentele din sursă au fost foarte asemănătoare cu cele observate în structurile pe bază de bisomocuban policlorurat, incluzând clordeconă, hidroclordecone,clordecol și mirex5,6, 24. Într-adevăr, modelele izotopice la m/z 201.0, 235.9 și 271.9 probabil a apărut din retrociclodimerizarea bishomocubană cunoscută în sursă și a corespuns fragmentelor C5 încărcate pozitiv. Comparația cu simulările izotopice a limitat posibilitatea la următorii ioni radicali: + · + * și+*, cu n = 0,1. Ultima formulă generică bis-oxigenată s-a dovedit a fi foarte puțin probabilă, deoarece a necesitat prezența unei funcții gem-diol sau a unei părți gem-clorohidrină pe inelul ciclopentenil care a trebuit să reziste condițiilor cromatografice dure ale GC (> 200 C). În schimb, am ajuns la concluzia că o parte de sulf, adică. o funcție tiol, a fost probabil prezentă pe policiclul bishomocubane. Am propus pentru F1 structura descrisă în Fig. 2a și a sugerat numele de clordectiol, analogul de sulf al clordecolului (alcoolul clordeconei).

sinteza standardului clordectiol și confirmarea faptului că produsul de transformare F1 este identic cu clordectiolul

pentru a confirma structura lui F1, clordectiolul standard a fost sintetizat chimic și complet caracterizat. Pentru a realiza sulfidarea chimică reductivă a clordeconei, au fost necesare două etape. Primul a constat în conversia funcției gem-diol a clordeconei în echilibru cu forma cetonică corespunzătoare20,25 în analogul de sulf, adică gem-tiol/tiocarbonil. Pentru a efectua această etapă, se aplică în general reactivi de sulf care conțin fosfor26, 27. Aici am folosit decasulfura de fosfor (P4S10) numită și reactivul Berzeliu27,28 conform protocolului Zaidi și colegilor care au sintetizat cu succes camphorthiol29 (Fig. 2a). A doua etapă a constat în reducerea intermediarului gem-tiol folosind NaBH4. După purificare, s-a obținut un solid alb într-un randament total de 73% (Fig. 2a). Analizele 1D – și 2D-RMN au confirmat structura clordectiolului: (i) două semnale 1H care integrează fiecare pentru un proton și sunt cuplate împreună (3,78 ppm, D, J = 5,5 Hz și 2,01 ppm, D, J = 5,5 Hz), cu cel de la 3,78 ppm corelat cu un semnal 13C deplasat în jos (55,1 ppm) în experimentul HSQC care un total de șase semnale 13C vizibile care reflectă planul de simetrie conservat în structura bishomocubană actuală (fig. 2a, smochine. S19–23). Deși în transformarea microbiană, F1 nu a putut fi detectat folosind instrumentul LC-HRMS în condițiile dezvoltate, o probă concentrată a clordectiolului standard sintetic a furnizat un semnal semnificativ. Prezența unui atom de sulf și formula neutră așteptată C10Cl10SH2 au fost confirmate (Fig. 2C, d), iar formulele brute C10Cl10O2H2 au fost excluse (Fig. 2b). În cele din urmă, analiza GC-MS a demonstrat potrivirea perfectă (adică același timp de retenție de 25,6 min și aceleași spectre de masă în sursă Fig. S6) între standardul sintetic și TP F1, atribuindu-l astfel cu siguranță ca clordectiol. Într-adevăr, F1 reprezintă primul membru al unei noi familii de clordecone TPS care posedă pentru prima dată un atom de sulf.

capacitatea Desulfovibrio sp.86 pentru a degrada produșii de transformare a clordeconei

compușii A1, B1, C1-C2 și F1 reprezentativi pentru cele patru familii de TP posibil formate în prezența Desulfovibrio sp.86 au fost sintetizate conform protocoalelor chimice raportate anterior6 și dezvoltate aici pentru F1. Fiecare dintre ele a fost incubat în prezența Desulfovibrio sp.86 culturi în condiții care s-au dovedit a promova sulfidarea reductivă (flacon sigilat; condiții CA) sau declorurarea cu deschidere inelară (flacon deschis; condiții RA). S–a efectuat monitorizarea duală GC-MS și LC-HRMS a tuturor probelor.

după incubarea de o lună în condiții CA, 10-monohidroclordecona A1 a fost complet transformată în doi compuși clorurați necunoscuți abia separați folosind GC-MS (timpi de retenție: 24,3 min F2 și 24,5 min F3, Fig. 3, smochine. S7–S11). Au arătat un spectru de masă identic în sursă, care era foarte similar cu modelul de fragmentare F1 (Fig. S8). Toate fragmentele detectate în sursă s-au transformat într-un atom de clor mai mic decât analogii lor în spectrul de masă F1. Compușii F2 și F3 s-au presupus astfel a fi diastereoizomeri ai 10-monohidrochlordectiolului (Fig. 3c). Acest lucru a fost confirmat de sinteza chimică a celor două standarde 10-monohidrochlordectiol din 10-monohidrochlordecona A1 folosind procedura aplicată anterior pentru sinteza clordectiolului F1 (Fig. S24–27). Aceste standarde chimice au avut aceleași timpi de retenție (24,3 și 24,5 min) și aceleași spectre de masă comparativ cu cele biologice F2 și F3 (Fig. S8). TPs B1, C1-C2 și F1 au rămas neschimbate chiar și după șase luni de incubație cu Desulfovibrio sp.86 în condiții CA.

după șase luni de incubare în condiții RA, clordectiolul F1 a fost parțial transformat în 10-monohidroclordectioli F2 și F3 și alte două specii clorurate necunoscute detectate folosind GC–MS, denumite F4 (timp de retenție: 17,9 min) și F5 (timp de retenție: 26,6 min) (Fig. 3d, Fig. S12). Niciunul dintre acești doi compuși nu a dat niciun semnal detectabil în LC-HRMS. Analiza GC-MS a permis propunerea C10Cl6SH4 ca formulă brută pentru F4 (Fig. S14) și C11Cl10SH4 pentru F5 (Fig. S15). Clordecsulfura de metil a fost sintetizată chimic și caracterizată complet prin RMN (Fig. S28–31). Corespondența perfectă a timpilor de retenție GC și a spectrelor de masă GC ale clordecsulfurii de metil și F5 biologice (Fig. S13) confirmă identitatea postulată. De remarcat, structura F5 (Fig. 3d) reprezintă o formă s-metilată a F1. Natura exactă a F4 rămâne clară (a se vedea SI-Text suplimentar). Toate celelalte TP au rămas neschimbate în condițiile RA.

în rezumat, A1 (format în condiții RA) a suferit o sulfidare reductivă la fel ca clordecona; în ambele condiții de incubație policloroindenele (B1 și C1-C2) nu păreau degradabile de Desulfovibrio sp.86, în timp ce F1 (produs în condiții CA) ar putea fi transformat în condiții RA (Fig. 3).

investigarea condițiilor de incubație care conduc la sulfidarea reductivă bacteriană

pentru a pune sub semnul întrebării parametrii fizico-chimici sau fiziologici care influențează căile de transformare ale clordeconei în culturile Desulfovibrio sp.86, a fost aleasă monitorizarea GC-MS (prezența B1 și F1 ca dovezi ale condițiilor RA și, respectiv, CA).

doi compuși anorganici care conțin sulf, reductorul Na2S și acceptorul de electroni Na2SO4, au fost prezenți în mediul lichid MMD original. O primă serie de experimente în flacoane sigilate cu înlocuirea Na2S cu alți agenți reducători, sulfurați sau nu, adică cisteină și citrat de titan(III) (TiCi) au condus la un nivel comparabil de clordectiol F1 (Tabelul 1). Urme de TP B1 au fost, de asemenea, observate în toate experimentele, inclusiv Na2S, controlul pozitiv (Tabelul 1).

Tabelul 1 influența agentului reducător asupra profilului clordeconei TP.

un al doilea set de experimente a fost proiectat folosind Na2S ca agent reducător și acceptori alternativi de electroni pe bază de sulf în flacoane sigilate (Tabelul 2). Utilizarea sulfatului anorganic îmbogățit 90% 34S a dus la un produs clordectiol care prezintă un nivel similar de îmbogățire 34S (90% 34S-F1/10% F1, Fig. S16). Analiza GC-MS a spațiului de cultură a relevat, de asemenea, prezența H234S și H3C34SH (Fig. S16), arătând astfel că Desulfovbibrio sp.86 a produs H2S din sulfat. Aceste gaze au fost detectate în spațiul capului de cultură în condiții CA, folosind mediu MMD, în timp ce acestea au fost absente din spațiul capului de cultură în condiții RA care corespundeau atmosferei torpedoului (Fig. S17). Absența sulfatului nu a inhibat Desulfovibrio sp.86 creștere, cu toate acestea, a dus la formarea B1 (Tabelul 2)5. Remplasarea sulfatului cu sulfit, bisulfit sau tiosulfat a condus în toate cazurile la formarea clordectiolului F1.

Tabelul 2 influența acceptorului de electroni pe bază de sulf asupra profilului clordecon TP.

o a treia serie de experimente folosind borcane au investigat efectul naturii fazei gazoase în contact cu cultura. Între starea RA folosind flacoane deschise în torpedou și starea CA folosind flacoane sigilate în cuptor, au fost diferiți mai mulți parametri (natura și volumul atmosferei, temperatura). Folosind un sistem jar care include mai multe flacoane, studiem selectiv efectul reînnoirii atmosferei asupra transformării clordeconei de către Desulfovibrio sp.86 în mediu MMD. În fiecare caz, flacoanele deschise cu filme poroase hidrofobe au fost plasate în borcane curățate inițial cu un gaz selectat. Toate borcanele au fost incubate la 30 C. Unele dintre ele au fost spălate de mai multe ori, pentru a imita sistemul torpedoului, în timp ce altele au fost ținute închise.

borcanele 1-4 conțineau două flacoane deschise identice umplute cu MMD, clordeconă și Desulfovibrio sp.86 inocul, și un control abiotic negativ. Dintre acestea, două borcane au fost spălate de două ori pe săptămână, borcanul 1 cu (N2/H2 (98/2; V/V)), borcanul 2 cu N2 (Fig. 4A), în timp ce borcanele 3 și 4, curățate inițial cu N2 și [N2 / H2 (98/2; V / V)) respectiv au fost lăsate neclintite (Fig. 4b).

ultimele două borcane (borcanele 5 și 6) conțineau trei flacoane deschise umplute cu MMD, clordeconă și Desulfovibrio sp.86, plus o cultură fără sulfat. Aceste borcane au fost inițial spălate cu (N2/H2 (98/2; V/V)) și lăsate nefolosite timp de 2 luni (Fig. 4c).

în paralel cu borcanele, două flacoane sigilate umplute cu MMD fără sulfat, clordeconă și Desulfovibrio sp.86 au fost spălate cu H2S sintetizat extemporar (Fig. S4).

după două luni de incubare la 30 CTC, TP B1 a fost detectat în flacoanele plasate în borcanele spălate 1 și 2 (Tabelul 3A), în timp ce TP F1 a fost găsit doar în flacoanele plasate în borcanele 3 și 4 neacoperite (tabelul 3b). Nu au fost prezente TP în controalele abiotice. În borcanele 5 și 6, F1 a fost prezent atât în Desulfovibrio SP fără sulfat, cât și în sulfat.86 culturi deschise (tabelul 3c). În același mod, Desulfovibrio sp.86 culturi fără sulfat, spălate cu H2S au prezentat niveluri semnificative de F1 TP, în timp ce nu s-a observat nicio transformare în martorul negativ (tabelul 3d).

Tabelul 3 influența atmosferei de gaz asupra profilului clordecone TP.

un experiment chimic suplimentar a fost efectuat pentru a evalua influența H2S asupra transformării clordeconei. S-a aplicat protocolul chimic clasic care permite formarea TPs B și C (clordeconă, citrat de titan, vitamina B12, apă). Sub atmosfera N2, s-au obținut TP-uri B și C, însă sub atmosfera H2S s-a produs doar A1 (Fig. S18).

aceste rezultate arată clar că formarea clordectiolului F1 necesită un sistem de incubație închis cu o atmosferă reducătoare. Cu toate acestea, H2 ca atmosferă inițială de gaz nu este obligatorie, în timp ce prezența H2S este necesară. Din punct de vedere chimic, prezența H2S împiedică procesul de declorurare a deschiderii inelului.

relevanța ecologică a sulfidării reductive a clordeconei

am reinvestigat colecția noastră anterioară de probe de mediu contaminate cu clordeconă din insula Martinica (opt soluri și două sedimente de pat) în care au fost raportate diferite niveluri de Clordeconă tps6. Dintre noile TPs cu conținut de sulf raportate aici, am găsit niveluri apreciabile de F1 în probele de sedimente cu două paturi (927 și 928) la o concentrație estimată în jurul valorii de 50 hectog/kg și, respectiv, 20 hectog/kg de sedimente umede (tabelul S1). În paralel, datele privind diversitatea populației bacteriene emise din analiza metabarcodării acestor probe (Fig. 5, Fig. S5) au fost prelucrate pentru a recupera o grupare ierarhică de probe de mediu în funcție de compoziția lor taxonomică6. S-a observat că bacteriile reducătoare de sulfat erau mult mai prezente în sedimentele de pat decât în celelalte compartimente, așa cum s-a raportat anterior30,31,32.

transformarea pesticidului recalcitrant clordeconă de către Desulfovibrio sp.86 cu trecerea de la declorurarea cu deschidere inelară la activitatea de sulfurare reductivă