tratamentul semințelor de Clotianidină nu are un impact negativ detectabil asupra coloniilor de albine și a agenților patogeni ai acestora

proiectarea studiului

în 2013, un total de 16 câmpuri (8,9 5,4 ha, valoarea medie a S.D.) din sudul Suediei, destinate rapiței oleaginoase semănate cu primăvară (Brassica napus L.) au fost împerecheate în funcție de proximitatea geografică (dar separate de >4 km) și de utilizarea terenului (Fig. 1, vezi mai sus). Peisajul înconjurător a fost inspectat pentru absența culturilor înflorite. Cu toate acestea, în 2013, două câmpuri au rămas în studiu, chiar dacă un alt câmp de rapiță a fost prezent în apropiere, astfel încât să se păstreze cât mai multe perechi de ferme34. În fiecare pereche de ferme, un câmp a fost repartizat aleatoriu pentru a fi semănat cu semințe de rapiță tratate cu clotianidină, în timp ce celălalt câmp a fost semănat cu semințe netratate cu clotianidină (tratate: 8; control: 8). Aceleași ferme împerecheate au fost utilizate în 2014, dar cu tratamentele inversate, adică locațiile cu câmpuri tratate în 2013 au avut câmpuri de control în 2014 și invers (tratate: 6; control: 4). Datorită rotației culturilor, în 2013 și 2014 au fost utilizate diferite câmpuri în cadrul fiecărei ferme (Fig. 1, vezi mai sus). Pentru a crea Fig. 1, Am descărcat o hartă din Baza de date World Borders (descărcabilă aici: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

informații privind variabilele peisajului înconjurător pentru diferitele ferme în 2014 sunt prezentate în tabelul suplimentar 7. În 2014, jumătate din câmpurile focale aveau rapiță suplimentară însămânțată cu primăvară (1-13 ha) pe o rază de 2 km. Semințele tratate cu clotianidină pentru câmpurile focale au fost acoperite cu Elado, un amestec de două ingrediente active: clotianidină (400 g l−1) și ciflutrină (+80 g l-1), aleasă pentru acest studiu deoarece a fost tratamentul predominant cu insecticide pentru semințe în rapița oleaginoasă din Suedia și din alte părți ale Europei63. Clotianidina este preluată de plantă și distribuită sistemic în toate părțile sale pentru protecția împotriva insectelor64. nu se consideră că Ciflutrina este sistemică și nu au fost detectate reziduuri în probele colectate în cadrul acestui studiu34. Atât semințele tratate cu clotianidină, cât și cele de control au fost acoperite cu fungicidul thiram în 2013.

fermierii participanți au fost instruiți să nu utilizeze alte neonicotinoide pe câmp în timpul studiului, deși alte spray-uri foliare insecticide; în principal Plenum (pymetrozine), Avaunt/Steward (indoxacarb) și Mavrik (tau-fluvalinat; folosit și ca varroacid în apicultură) au fost utilizate pentru combaterea dăunătorilor (tabelul suplimentar 8). Cu toate acestea, Biscaya, denumirea comercială pentru o formulare de pulverizare care conține tiaclopridul neonicotinoid, a fost aplicată pe un câmp de control în 2013, urmată de un spray Mavrik 1 săptămână mai târziu și pe un câmp tratat în 2014, în ambele ocazii la 0,3 l ha−1. Tiaclopridul are o toxicitate acută considerabil mai scăzută pentru albine decât clotianidina65 și numai urme de tiacloprid au fost detectate în probele de polen, nectar și albine în 2013 și niciuna în 2014. În timp ce Rundl Xvif și colab.34 nu s-a observat nicio modificare a rezultatelor când câmpurile în care a fost aplicată Biscaya au fost excluse din analize, am detectat unele modificări calitative (tabelul suplimentar 9). Aceste modificări s-ar putea datora reziduurilor mai mari de tiacloprid detectate în 2014, dar ar putea la fel de bine să nu se refere la Biscaya, ci mai degrabă la diferența dintre Biscaya/Mavrik și combinațiile alternative de pulverizare cu insecticide utilizate34 sau să se datoreze puterii statistice reduse.

colonii de albine

o sută șaisprezece colonii de albine au fost pregătite la sfârșitul lunii mai 2013 de către un apicultor profesionist în stupi Langstroth de dimensiuni unice, conținând doi piepteni cu puiet sigilat în principal (cu albine), doi faguri plini (cu albine), un pieptene gol extras, cinci piepteni cu fundație de ceară, albine scuturate din doi Piepteni și fie un copil de 1 an (84 de colonii experimentale), fie de 2 ani (12 colonii experimentale plus 20 de colonii de rezervă) regină de origine cunoscută pentru a produce relativ mici, de dimensiuni egale (3418 XTX 123 albine adulte; medie XTX s.a.m.; N = 96 colonii) colonii cu mult spațiu pentru creștere care ar putea deveni suficient de puternice pentru a supraviețui iernii viitoare, dar nu și-au depășit spațiul în timpul verii. Șase colonii experimentale au fost plasate de-a lungul marginii câmpului în fiecare dintre cele 16 câmpuri de rapiță oleaginoasă (96 de colonii în total) între 14 și 28 iunie 2013 la debutul înfloririi rapiței oleaginoase (suplimentar Fig. 1). Descendența și vârsta reginei au fost potrivite între perechi de ferme, dar coloniile au fost altfel distribuite aleatoriu. Coloniile au fost ținute la un câmp de rapiță de iarnă de 60 ha gestionat organic în plină floare înainte de plasarea la cele 16 câmpuri experimentale (suplimentar Fig. 1) pentru a se asigura că creșterea coloniilor pre-experiment a fost bazată pe cât posibil pe hrănirea fără pesticide.

când înflorirea rapiței oleaginoase în câmpul experimental a încetat, coloniile au fost mutate între 2 și 31 iulie (suplimentar Fig. 1) la o stupină comună pentru a ierni. La 10 August, coloniilor li s-a administrat un tratament cu vapori de acid formic împotriva acarienilor Varroa, constând din 20 ml 60% acid formic înmuiat într-un burete de uz casnic plat plasat sub capacul interior deasupra ramelor. Coloniile au fost hrănite cu un total de 20 kg de zahăr pe colonie sub forma unei soluții de zaharoză de 55-60% v/v, furnizate într–o cutie de hrănire de trei ori în perioada August-septembrie 2013. Un tratament suplimentar cu Varroa ușor a fost efectuat la 4 decembrie prin stropirea a 30 ml acid oxalic 2,6% în zaharoză 60% între cadre, direct pe grupul de albine. În primăvara anului 2014, coloniile au fost mutate într-un câmp de rapiță cu semințe oleaginoase gestionate organic înainte de plasarea la cele 10 câmpuri de rapiță cu semințe oleaginoase semănate cu primăvară (Fig suplimentar. 1). Coloniile au fost luate în considerare pentru a fi incluse în partea din 2014 a studiului dacă au avut o regină de ouă în vârstă de 2 ani în aprilie 2014 (cu excepția coloniilor care au murit, au reapărut sau au avut regine în vârstă de 3 ani în aprilie 2014) și nu au mișunat până la începutul lunii iunie 2014. Aceste restricții, pe lângă cerința ca coloniile să fie expuse/neexpuse la clotianidină pentru ambii ani ai experimentului, au însemnat că în 2014 doar patru colonii ar putea fi alocate fiecărui domeniu. Coloniile plasate pe câmpuri tratate în 2013 au fost din nou plasate pe câmpuri tratate în 2014, astfel încât să se evalueze efectele cumulative ale expunerii la clotianidină pe mai mulți ani, dar altfel au fost Re-randomizate înainte de plasare pentru a minimiza prejudecățile neintenționate. Chiar și așa, două colonii de control din 2013 au trebuit să fie plasate de un câmp tratat cu clotianidină în 2014, din cauza coloniilor expuse insuficiente pentru cele șase câmpuri tratate cu clotianidină. Au fost disponibile suficiente colonii pentru cele patru câmpuri de control. Puterea coloniilor a fost egalizată așa cum este descris pentru 2013, dar numai în cadrul fiecărui grup de tratament. Coloniile au fost reduse și egalizate a doua oară (8 iunie 2014), după ce unele dintre ele au crescut prea mari și au încercat să roiască (Fig suplimentar. 1). Fiecare colonie redusă a inclus 1 pieptene complet de miere (cu albine), 3 piepteni cu puiet sigilat în principal (cu albine) și regina originală din 2013 și 6 piepteni cu fond de ceară. Coloniile au fost mutate în câmpurile de rapiță de primăvară între 16 și 25 iunie 2014 și readuse în locul comun de iernare între 14 și 22 iulie 2014 (Fig suplimentar. 1).

analize de reziduuri

pentru a confirma expunerea la clotianidină, 24 de albine adulte capturate pe câmp la intrarea în stup, pelete de polen colectate de la 5 albine care se hrănesc în câmpurile de rapiță oleaginoasă și nectar îndepărtat din stomacurile a 5 albine care se hrănesc cu nectar în câmpurile de rapiță oleaginoasă au fost analizate din fiecare loc pentru reziduurile de clotianidină. Polenul (> 25 ml) a fost colectat folosind capcane de polen, care au fost instalate timp de 1 zi pe trei colonii pe sit și analizate pentru Originea speciilor de plante. Eșantioanele au fost manipulate și analizate ca în Rundl Xvif și colab.34 și colectate în timpul evaluărilor vârfului de înflorire în ambii ani (suplimentar Fig. 1), cu concentrațiile de clotianidină și alte patru neonicotinoide utilizate în Suedia (tabelul suplimentar 2) cuantificate folosind cromatografia lichidă cuplată cu spectrometria de masă tandem (LC-MS/MS) și polenul identificat la tipul de rapiță oleaginoasă folosind microscopie luminoasă și o bibliotecă de referință pentru polen (a se vedea tabelul suplimentar 2 pentru limitele de detecție și cuantificare). Pentru analize suplimentare ale variației expunerii neonicotinoide a albinelor în diferite situri, am colectat 12 albine pe sit de la intrarea în stup. Această prelevare a fost efectuată în trei situri tratate cu clotianidină în 2013. Nectarul a fost extras din stomacul de miere al albinelor colectate. Concentrațiile de clotianidină au fost ulterior cuantificate atât în nectar, cât și în țesutul albinelor pentru fiecare individ albină. Mai multe detalii despre tratamentul eșantionului pentru diferite matrice, metoda LC-MS/MS și controalele de calitate sunt prezentate în metode suplimentare.

dezvoltarea coloniilor, re-queening și producția de miere

dezvoltarea coloniilor de albine a fost evaluată de același observator instruit și de un asistent. A fost stabilită prezența unei regine ouătoare, precum și prezența celulelor regine. Dacă un eveniment de re-queening a fost însoțit de o pierdere mare de albine adulte, s-a considerat că a mișunat. Dacă nu s-a observat nicio pierdere de albine adulte, s-a considerat că colonia a reapărut prin înlocuire. Producția și dezvoltarea mierii de colonie a fost determinată prin cântărirea coloniilor și prin evaluarea rezistenței coloniilor folosind metoda Liebefeld 66, ca număr total de albine adulte și suprafața puietului acoperit pe toate cadrele. Numărul albinelor adulte a fost estimat prin numărarea albinelor de pe ambele părți ale celor 10 cadre. Numărul de celule de puiet cu capac (cantitatea de puiet) a fost determinat prin înmulțirea proporției de acoperire închisă a puietului cu 2700, care este numărul de celule de pe o parte a cadrelor utilizate. Coloniile au fost cântărite în timpul evaluărilor pre-expunere și post-expunere (folosind o scală Mettler Toledo bench capabilă să cântărească până la 32 kg cu precizie de 1 g), pentru a estima producția de miere. Cadrele complete de miere au fost înlocuite cu cadre goale în timpul înfloririi rapiței oleaginoase, pentru a permite coloniei să crească și să reducă roiul. Atât cadrele pline, cât și cele goale au fost cântărite, pentru a fi incluse în calculul producției de miere. În timpul evaluării post-expunere, au fost îndepărtate cât mai multe cadre de miere (maxim 10% din suprafața acoperită cu puiet acoperit) pentru a simula recolta de miere a Apicultorilor. Evaluările preexpunerii au fost efectuate la câmpul de rapiță însămânțată în condiții de iarnă, gestionat ecologic, în perioada 6-17 iunie 2013 și 9-11 iunie 2014, iar evaluările postexpunere la stupina comună de iernare în perioada 29 iulie-9 August 2013 și 28-31 iulie 2014 (Fig suplimentar. 1). În plus, în aprilie 2014 s-a efectuat o evaluare a rezistenței coloniilor de primăvară prin estimarea numărului total de albine adulte și a numărului de puiet plafonat (Fig suplimentar. 1). Evaluatorul coloniei și asistenții au fost orbiți în timpul colectării datelor cu privire la regimul de tratament al câmpurilor.

colectarea și prelucrarea probelor de agenți patogeni și paraziți

probe de aproximativ 100 de albine adulte au fost prelevate din fiecare colonie în timpul evaluărilor pre – și post-expunere în câmpurile experimentale de rapiță oleaginoasă tratate cu clotianidină și de control atât în 2013, cât și în 2014 (Fig suplimentar. 1). Albinele au fost luate din pieptenele exterioare ale fiecărei colonii și, prin urmare, au constat dintr-un amestec de albine de casă și albine furajere67. Toate probele de albine au fost depozitate la -20 centimetric C până la efectuarea lucrărilor de laborator. V. ratele de infestare cu distrugători pentru fiecare colonie au fost determinate prin spălarea probelor de albine adulte cu apă cu săpun pentru a disloca și număra mites68. Abdomenele a 60 de albine adulte pe colonie (pentru analize individuale de colonii) sau pe stupină (pentru analizele colonizate din 2013, 10 albine pe colonie) au fost îndepărtate și plasate într-o pungă de polietilenă cu o plasă interioară (BioReba). Abdomenele au fost măcinate în pungă folosind un pistil și 30 ml de apă fără nuclează (Milli-Q) (0,5 ml per albină) a fost amestecat bine cu proba pentru a crea o suspensie omogenă. Mai multe alicote de 1 ml din această suspensie au fost îndepărtate și congelate imediat la -80 centi C pentru extracția ADN și ARN și ca material de referință viitor.

paraziți, agenți patogeni, microbi simbiotici și gene imune

probele de albine colectate au fost evaluate pentru o varietate de paraziți și microbi patogeni și nepatogeni în scopul studierii impactului plasării coloniilor în câmpurile tratate cu clotianidină asupra prevalenței și abundenței acestora. Organismele au inclus omniprezentul ectoparazit Varroa destructor, 13 viruși: virusul paraliziei acute a albinelor (ABPV), virusul paraliziei letale a afidelor (ALPV), virusul râului Sioux mare (BSRV), virusul celulei reginei negre (bqcv), virusul paraliziei cronice a albinelor (CBPV), virusul aripii deformate tip A (DWV-a), virusul aripii deformate tip B (DWV-B), virusul paraliziei acute israeliene (IAPV), virusul albinelor din Kashmir (KBV), virusul lacului Sinai tulpina 1 (LSV-1) și tulpina 2 (LSV-2), virusul Sacbrood (SBV), virusul paraliziei lente a albinelor (sbpv); doi paraziți intestinali microsporidieni comuni ai albinelor (Nosema apis și Nosema ceranae) și două bacterii intestinale simbiotice (gammaproteobacterium: gilliamella apicola și BETAPROTEOBACTERIUM: Snodgrassella alvi). Pentru probele din 2013 s-au analizat, de asemenea, la nivelul stupinei, nivelurile de ARNm a opt gene de albine (Amel/LRR, Apidaecin, cSP33, Dorsal-1a, Eater-like,NimC2, PGRP-S2 și SPH51) a căror expresie fusese legată anterior de expunerea la pesticide, agenți patogeni și/sau paraziți19, 44 și imunitatea (socială) la albine45.

extracția acidului Nucleic

ADN-ul a fost extras din omogenatele albinelor folosind protocolul de extragere a ADN-ului din Nosema spores69, care este suficient de robust pentru a extrage și ADN din bacterii și alte microorganisme. Un total de 500 de unqql omogenat primar de albine a fost centrifugat timp de 5 min într-un microfug la 13.000 rpm. Peleta a fost înghețată în mod repetat-dezghețată cu azot lichid și măcinată cu un micropestil steril de Teflon până la pulverizare. Peleta pulverizată a fost resuspendată în 400 de țesuturi de plante QIAGEN dneasy AP1 tampon de liză conținând 4 ilft RNAse−a (10 mg ml-1) și incubată și agitată timp de 10 min la 65 oC, după care 130 ilft P3 tampon de neutralizare (3,0 m acetat de potasiu pH 5.5) a fost adăugat, urmat de 5 min de incubare pe gheață și centrifugare timp de 5 min la 14.000 rpm pentru a îndepărta resturile de liză. ADN – ul a fost purificat din 500 unqql de supernatant de către robotul automat de extracție qiacube QIAGEN, urmând protocolul DNeasy al instalației și eluând ADN-ul în 100 unqql apă fără nuclează. ARN-ul a fost extras de robotul Qiacube direct din omogenatul primar de albine de 100 unktil folosind protocolul RNeasy al plantei Qiagen (inclusiv concasorul Qia pentru omogenizare suplimentară70) și ARN-ul a fost eluat în apă fără nuclează de 50 unktil. Concentrația aproximativă de acid nucleic a fost determinată de NanoDrop, după care probele au fost diluate cu apă fără nuclează până la un nivel uniform de 10 ng-1 (ADN și LSV−1(ARN)) sau 20 ng-1 (Pentru toate celelalte probe de ARN) și depozitate la -80 C.

RT−qPCR și qPCR

diferitele microorganisme și ținte de ARNm gazdă au fost detectate și cuantificate PCR cantitativ (RT-qPCR) pentru agenții patogeni cu genom ARN și gena de referință imună și internă ARNm ținte sau prin PCR cantitativ (qPCR) pentru organismele cu genom ADN. Detaliile testelor sunt prezentate în tabelul suplimentar 10, în tabelul suplimentar 11 și în tabelul suplimentar 12. Grundul invers pentru Amel/LRR a fost ușor reproiectat de la Di Prisco și colab.19 deoarece complementaritatea extrem de ridicată dintre primerii originali înainte și invers a dus la niveluri ridicate de artefacte PCR care domină semnalul cantitativ. Reacțiile s-au efectuat în dublu exemplar, în volume de reacție de 20 il (ADN) sau 10 il (ARN) conținând 2 il (ADN) sau 1,5 il (ARN), 0,4 il (ADN) sau 0.2 centimm (ARN) de primer înainte și înapoi și fie amestecul Bio-Rad Eva Green qPCR (ADN), fie amestecul Bio-Rad Itaq RT-qPCR într-un singur pas cu chimia de detectare Verde SYBR (ARN). Reacțiile au fost incubate în plăci qPCR optice cu 96 de puțuri în termociclerul Bio-Rad CFX connect, utilizând următoarele profiluri de amplificare: 10 min la 50 C pentru sinteza complementară de ADN (ADNc) (numai RT-qPCR): 5 min la 95 C (pentru inactivarea revers transcriptazei și activarea polimerazei Taq) urmate de 40 de cicluri de 10 S la 95 C pentru denaturare și 30 s la 58 C pentru recoacerea primerului, extinderea și colectarea datelor. Pentru testele ADN s-au utilizat următoarele profiluri ale ciclului de amplificare: 2 min la 98 XC pentru denaturarea inițială, urmate de 40 cicluri de 5 s la 98 XC pentru denaturare și 10 s la 60 XC pentru recoacerea primerului, extinderea și colectarea datelor. Ciclurile de amplificare au fost urmate de o analiză a curbei de topire pentru a determina specificitatea amplificării prin citirea fluorescenței la incremente de 0,5 centimetrii C de la 65 centimetrii C la 95 centimetrii C. Pe fiecare placă de reacție au fost incluse elemente de control pozitive și negative (non-șablon). Pentru fiecare tip de test (tabelul suplimentar 10, Tabelul suplimentar 11 și tabelul suplimentar 12) S-a pregătit o curbă de calibrare printr-o serie de diluții de 10 ori a unui control pozitiv al concentrației cunoscute care acoperă 6 ordine de mărime, pentru Conversia cantitativă a datelor, stabilind profilul curbei de topire de referință a ampliconului și estimând statisticile privind performanța reacției.

conversia și normalizarea datelor

curbele de topire ale reacțiilor individuale au fost evaluate vizual pentru a separa amplificările nespecifice, care diferă în profilurile de temperatură de topire de adevăratele ampliconi ADNc/ADN țintă. Amplificările nespecifice au fost șterse din setul de date. Toate testele au fost executate în dublu exemplar, valoarea medie a acestor două duplicate fiind utilizată în calcule ulterioare. Ambele duplicate au trebuit să producă o valoare cantitativă pozitivă și să treacă analiza curbei de topire pentru ca datele să fie incluse în setul de date. Datele RT-qPCR brute ale tuturor amplificărilor confirmate au fost ulterior convertite în numere de copie estimate ale fiecărui ARN țintă, utilizând curba de calibrare corespunzătoare pentru test. Aceste date au fost înmulțite cu diferiți factori de diluare pe parcursul procedurii pentru a calcula copiile estimate ale fiecărei ținte pentru fiecare albină69. Deoarece ARN – ul este ușor degradat, există riscul ca diferențele dintre probele individuale în ceea ce privește calitatea ARN-ului (adică degradarea) să afecteze rezultatele70. Pentru a corecta acest lucru, testele RT-qPCR pentru ARNm a unei gene comune de referință internă a albinelor (RP49) au fost efectuate pe toate probele. Datele pentru țintele ARN de interes au fost apoi normalizate la valoarea medie pentru ARNm RP49, corectând astfel datele pentru diferențele specifice eșantionului în calitatea ARN în ceea ce privește performanța RT-qpcr70.

analize statistice

proporțiile polenului colectat de albine provenit de la plantele de rapiță oleaginoasă au fost comparate între tratamente (tratamentul semințelor de clotianidină/netratate) folosind un model liniar generalizat care presupune distribuția binominală și corectarea supradozajului. Concentrațiile de clotianidină din nectar și polen colectate de albine și din țesutul albinelor au fost comparate între tratamente folosind testele Wilcoxon–Mann–Whitney. Pentru a compara concentrațiile de clotianidină din țesutul albinelor și nectarul din albinele individuale între câmpuri, am folosit analize de varianță (ANOVA), cu identitatea câmpului ca predictor. Mai mult, concentrațiile de clotianidină în țesutul și conținutul de stomac nectar al albinelor individuale au fost corelate utilizând o regresie liniară multiplă cu identitatea câmpului și concentrația clotianidinei în nectar ca variabile explicative și concentrația clotianidinei în țesutul albinelor ca variabilă de răspuns.

studiul a urmat, în general, un design Înainte-După-control-Impact (BACI), cu o structură de câmp pereche, repetată timp de doi ani consecutivi la nivel de colonie pentru date privind dezvoltarea coloniilor, precum și prevalența și abundența paraziților, agenților patogeni și bacteriilor intestinale. Anii, 2013 și 2014, au fost analizați împreună într-un singur model complet, cu tratamentul semințelor, înflorirea, anul și interacțiunile lor ca factori fixi. Efectul tratamentului cu clotianidină a fost evaluat prin interacțiunea dintre floare și tratamentul semințelor, deoarece acest termen reflectă diferența de schimbare între tratamente față de floarea(florile) rapiței oleaginoase. În cazul în care interacțiunea cu trei căi (bloom tratamentul semințelor de la suta la suta anul) a fost semnificativă (adică, în cazul în care variabila a răspuns diferit la tratamentul cu clotianidin de la un an la altul), setul de date a fost împărțit în funcție de an și an a fost scăzut ca un factor fix. În plus, setul de date a fost analizat timp de numai 1 an dacă datele au constat într-o dimensiune a eșantionului 10 într-un an, atât pentru prevalența microbiotei, cât și pentru abundență (tabelul suplimentar 1). Coloniile care au mișunat (8 la câmpurile de control și 10 la câmpurile tratate cu clotianidină în 2013; unul la un câmp de control și două la câmpurile tratate cu clotianidină în 2014) au fost excluse din analiză, deoarece roirea are un efect mare asupra dezvoltării coloniilor. De asemenea, este exclusă singura colonie care și-a pierdut Regina în timpul transportului înainte de plasarea pe teren în 2013 (câmp tratat). Excluderea coloniilor care mișunau din analiză a modificat calitativ unele rezultate (a se vedea tabelul suplimentar 13). Modificările nivelului de semnificație s-ar putea datora puterii statistice reduse, șanselor aleatorii sau efectelor biologice.

modele liniare cu efecte mixte (LMM) au fost utilizate pentru a testa efectul tratamentului cu clotianidină asupra dezvoltării coloniilor, măsurat ca număr de celule de puiet limitate (cantitatea de puiet) și numărul de albine adulte. Tratamentul semințelor (clotianidin sau control), înflorirea (înainte sau după înflorirea rapiței oleaginoase), anul (2013 sau 2014) și interacțiunile lor au fost factori fixați. Identitatea perechii de ferme, identitatea fermei și identitatea coloniei au fost incluse ca factori aleatori. Producția de miere a fost comparată între tratamente folosind un LMM cu identitatea perechii agricole și identitatea fermei ca factori aleatori. Modelele mixte liniare generalizate (Glmm) au fost utilizate pentru a testa influența tratamentului cu clotianidină asupra re-queening-ului și mortalității coloniilor cu identitatea fermei ca factor aleatoriu.

influența tratamentului cu clotianidină asupra dezvoltării coloniilor de primăvară, măsurată ca număr de albine adulte și cantitate de puiet, a fost testată folosind un LMM și, respectiv, un GLMM, cu tratamentul semințelor ca factor fix și identitatea perechii de fermă și identitatea fermei ca factori aleatori. Pentru numărul de celule de puiet plafonate am folosit o distribuție negativă a erorilor binomiale și o funcție de legătură logaritmică.

datele despre microbiom și acarianul Varroa au fost analizate atât în funcție de caracterul lor binomial (prezență/absență), cât și cantitativ (abundență), folosind Glmm-uri (cu distribuții de erori binomiale și o funcție de legătură logit) și, respectiv, LMM-uri (cu distribuții normale de erori), cu tratarea semințelor, înflorire, an și interacțiunile lor ca factori fixi. GLMMs asupra prevalenței microorganismului sau acarianului Varroa a inclus doar identitatea coloniei ca factor aleatoriu, deoarece dimensiunea efectivă a eșantionului (adică rezultatul mai puțin frecvent al datelor de prezență/absență) nu a permis includerea mai multor factori aleatori. Numai organismele și anii cu o dimensiune (efectivă) a eșantionului >10 au fost analizați atât pentru datele privind prevalența, cât și pentru cele privind abundența. În plus, coloniile care nu au testat cel puțin o dată pozitiv pentru un anumit microorganism au fost excluse din analiza abundenței. Patogenul albinelor și abundența bacteriană au fost transformate logaritmic (log10), deoarece sunt în general distribuite exponențial. LMM – urile din abundența organismului țintă conțineau identitatea perechii de ferme, identitatea fermei și identitatea coloniei ca factori aleatori. Numărul de acarieni Varroa la 100 de albine și greutatea coloniei au fost transformate în rădăcină pătrată pentru a evita reziduurile distribuite în mod normal. Intervalele de încredere au fost calculate pe baza probabilității profilului. Pentru datele transformate cu rădăcină pătrată, estimările au fost transformate înapoi la scara originală pentru ilustrații grafice.

transcrierile genei imune au fost disponibile doar pentru 2013 și la nivel de stupină, dar au urmat și designul BACI. LMMs pe expresia genelor conținea tratamentul semințelor și înflorirea ca factori fixi și identitatea fermei ca factori aleatori.

analizele de date statistice au fost efectuate folosind R, cu excepția analizelor care vizează verificarea expunerii la clotianidină și utilizarea terenului, pentru care SAS 9.4 Pentru Windows (SAS Institute Inc.) a fost folosit. LMM-urile au fost potrivite folosind funcția lmer a pachetului lme4, iar Glmm-urile au fost potrivite folosind funcția glmmTMB a pachetului glmmTMB în R. valorile P din Glmm-uri au fost calculate prin teste ale raportului de probabilitate. Valorile P din LMMs au fost calculate folosind funcția Anova a pachetului auto, prin care testele F de tip III au fost utilizate pentru modelele care conțin interacțiuni și testele F de tip II pentru modelele fără interacțiuni (adică evaluarea primăverii și producția de miere). Efectele factorilor fixi au fost estimate folosind contraste sumă-zero în toate modelele, cu excepția celor asupra reziduurilor neonicotinoide. Contrastele sumă-zero permit determinarea efectelor/interacțiunilor principale (adică estimarea independentă de alte variabile independente) și arată efectele factorilor ca abateri de la Marea medie (interceptare). Pentru factorii cu două niveluri, magnitudinea abaterii fiecărui nivel de la Marea medie este aceeași, dar direcția diferă. Reprezentăm efectele factorilor (tratamentul semințelor, înflorirea, Anul), ca Devianță a celui de-al doilea nivel (clotianidin, după, 2014) din Marea medie. Acesta a fost, de asemenea, cazul interacțiunilor, astfel încât, de exemplu, tratamentul semințelor interacțiunea cu floarea de floare indică în ce măsură coloniile expuse la clotianidină au diferit în ceea ce privește schimbarea față de floarea rapiței oleaginoase de schimbarea medie a ambelor tratamente.

analiza puterii

am efectuat analize de putere pentru numărul de albine adulte și numărul de celule de puiet limitate și producția de miere pentru a investiga dimensiunea efectului pe care l-am putea detecta, având în vedere designul, replicarea și alegerea modelului. Puterea a fost determinată pentru o gamă de dimensiuni ale efectului la un nivel nominal de încredere de 0,05 x 1000 simulări Monte Carlo pe dimensiunea efectului folosind funcția powerSim a pachetului simr. Puterea a fost calculată pentru o gamă de dimensiuni ale efectului, exprimată ca Modificarea numărului de albine adulte, a numărului de celule de puiet limitate sau a producției de miere. Prin împărțirea mărimii efectului cu numărul mediu de albine, numărul mediu de celule de puiet sau producția de miere a tuturor coloniilor martor, s-a obținut mărimea efectului exprimată ca modificare procentuală a acestor matrice (Fig suplimentar. 3). Această analiză a puterii a făcut posibilă compararea mărimii efectului nostru cu dimensiunea efectului prezentată de Rundl Irakf și colab.34. Folosind modelul complet, am putut detecta o dimensiune a efectului pentru numărul de albine adulte de sub 5% cu o putere de 80% comparativ cu dimensiunea efectului Sub 20% prezentată de Rundl xvf și colab.34. Aceasta este chiar mai mică decât cerințele unei dimensiuni a efectului <7% stabilite de EFSA32. Ca urmare a unei interacțiuni semnificative între tratamentul semințelor, înflorire și an, setul de date pentru numărul de celule de puiet plafonate a fost analizat separat pentru fiecare an. Prin urmare, prezentăm aici analiza puterii pentru fiecare an. Mărimea efectului la care s-a atins 80% a crescut de la Sub 10% în 2013 la puțin sub 11% în 2014 (Fig suplimentar. 3), probabil datorită replicării reduse în 2014. De asemenea, am efectuat o analiză a puterii producției de miere (cantitatea de miere pe colonie în kg) folosind setul de date din ambii ani, arătând că o dimensiune a efectului Sub 20% ar putea fi detectată cu o putere de 80% (Fig suplimentar. 3).

rezumat de raportare

informații suplimentare privind proiectarea experimentală sunt disponibile în Rezumatul de raportare al cercetării naturii legat de acest articol.