COLO 205
framgångsrik odling av dina celler:
*läs den viktiga tekniska informationen som följer innan du hanterar ECACC-levererade cellinjer*. Denna information finns även som PDF från vår huvudmeny, under ‘kundsupport’ (klicka här).
förvaring av frysta celler
vid mottagandet ska frysta ampuller överföras direkt till gasfas flytande kväve utan dröjsmål, såvida de inte ska användas direkt. Använd inte en -80 C-Frys som ett alternativ, vilket kommer att leda till förlust av lönsamhet.
hur man hanterar frysta celler vid mottagandet
vid mottagande av en försändelse av frysta ECACC-levererade cellinjer är det viktigt att slutanvändaren uppmärksammar försändelsen utan dröjsmål. De tekniska råd som åtföljer cellinjerna bör konsulteras innan ampuller tas bort från torris. Korrekt hantering omedelbart efter mottagandet är avgörande för att framgångsrikt etablera cellinjen i slutanvändarens laboratorium.
när en cellinje beställs bör slutanvändare också överväga odlingsförhållandena för den nya cellinjen och se till att lämpligt medium kommer att finnas tillgängligt när cellerna anländer.
betydelsen av cellräkning
utför ett livskraftigt cellantal när du återupplivar och skördar cellkulturer. En av de vanligaste orsakerna till misslyckandet med att etablera celler i odling beror på att man använder en felaktig livskraftig cellsådddensitet vid återupplivningstidpunkten, dvs såddceller för låga eller för höga. Detta kan undvikas genom att utföra ett livskraftigt cellantal och följa den rekommenderade såddtätheten.
för den specifika cellinjen du arbetar med, läs informationen under fliken Beskrivning på vår hemsida. Den informationen finns också i databladet Cell Line, som kommer att ges till dig som en papperskopia med din cell line-sändning. Sådddensiteten visas i subkulturens rutininformation. När såddceller omedelbart efter återupplivning, använd mitten till övre änden av det angivna sådddensitetsområdet.
återupplivning av frysta celler
det är viktigt att hantera frysta ampuller med försiktighet; bära en laboratorierock, full skyddande ansiktsmask och handskar. I sällsynta fall kan ampuller explodera vid uppvärmning på grund av expansion av instängd kvarvarande flytande kväve.
1. I ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp håller du en vävnad som blötläggs i 70% alkohol runt locket på den frusna ampullen. Vrid locket ett kvarts varv för att frigöra eventuellt kvarvarande flytande kväve som kan fångas. Dra åt locket igen. Överför ampullen snabbt till ett 37oC vattenbad tills endast en eller två små iskristaller, om några, finns kvar (1-2 minuter). Det är viktigt att tina snabbt för att minimera skador på cellmembranen.
Obs: Sänk inte ner ampullen helt eftersom det kan öka risken för kontaminering.
2. Torka ampullen med en vävnad indränkt i 70% alkohol före öppnandet.
3. Pipettera hela innehållet i ampullen i ett sterilt rör (t.ex. 15 ml kapacitet). Tillsätt sedan långsamt 5 ml förvärmt medium som redan har kompletterats med lämpliga beståndsdelar. Bestäm den livskraftiga celltätheten med trypanblå fläck, en hemocytometer och ett inverterat mikroskop för att räkna cellerna eller motsvarande cellräkningsmetod. Överför lämplig volym cellsuspension för att uppnå den cellsådddensitet som rekommenderas vid datainmatningen av celllinjen.
för vidhäftande cellinjer: justera volymen på mediet och vid behov kolvstorleken för att uppnå den cellsådddensitet som rekommenderas på cellinjedatabladet. Ett förcentrifugeringssteg för att avlägsna kryoprotektant är normalt inte nödvändigt eftersom den första medieförändringen tar bort kvarvarande kryoprotektant. Om det är så kommer detta att anges på databladet. Om cellerna ska användas omedelbart (t.ex. för en cellbaserad analys), snarare än subkulturerad, kan det vara tillrådligt att utföra ett förcentrifugeringssteg för att avlägsna kryoprotektant.
för upphängningscellinjer*: ett förcentrifugeringssteg för att avlägsna kryoskyddande medel rekommenderas, dvs. pellet cellerna genom centrifugering vid 150 x g i 5 minuter och resuspendera cellpelleten i färskt medium med lämplig volym för att uppnå rätt sådddensitet.
1. Inkubera kolvar vid den temperatur och CO2-nivå som rekommenderas på databladet. Om en CO2-matad inkubator används ska kolven ha ett ventilerat lock för att möjliggöra gasutbyte.
Hybridomkulturer från frysta
vid återhämtning av hybridomkulturer från frysta är det inte ovanligt att tillväxten initialt blir långsammare än väntat och det kan observeras en minskad livskraft. Etablering av en aktivt spridande kultur kan ta upp till 2 veckor.
vid återupplivning är ett centrifugeringssteg för att avlägsna kryoprotektanten viktigt. Tina snabbt den frusna ampullen i ett vattenbad vid 37 kcal C i 1-2 minuter. Överför innehållet till ett centrifugrör och tillsätt långsamt 5-10 ml förvärmt tillväxtmedium+. Ta bort ett prov för att räkna. Centrifugera vid 100 x g i 2-3 minuter till pelletsceller och frö vid en relativt hög densitet av 5-7 x 105 celler/ml. Placera kulturkolven platt och observera regelbundet tills livskraftiga prolifererande celler ses.
+ofta kan hybridomkulturer dra nytta av att resuspenderas med media kompletterat med 20% FBS i det tidiga kritiska skedet av kultur etablering omedelbart efter återupplivning.
förfarande för frysning av celler
ECACC rekommenderar att du fryser ett lager av din cellinje (er) strax efter mottagandet (mellan 2 – 4 x 106 celler/ml) som en försiktighetsåtgärd.
följande guide erbjuds för beredning och kryokonservering av cellinjer.
1. Skörda cellerna i loggfasen av tillväxt på samma sätt som används för rutinmässig subkultur. För vidhäftande cellinjer, skörda så nära 80-90% sammanflöde som möjligt.
2. Standardproceduren är att använda 90% serum + 10% kryoprotektant för alla cellinjer om inte annat anges på databladet. Tillåt 1 ml för varje ampull. De flesta cellinjer kan frysas i lämpligt odlingsmedium kompletterat med 20% serum och 10% kryoprotektant. Detta är vanligtvis DMSO men i vissa fall rekommenderas glycerol. Om DMSO inte är lämpligt kommer ett alternativ att anges på Cellinjedatabladet.
3. Pelletsceller genom centrifugering t.ex. 150 x g i 5 minuter. Omsuspendera cellpelletsen i lämpligt frysmedium för att ge en slutlig cellkoncentration mellan 2 – 4 x 106 celler/ml och pipett 1 ml i varje ampull.
4. Frys cellerna med en kylhastighet mellan 1-3oC/min med en programmerbar hastighetsstyrd frys eller lämpligt alternativ1. När temperaturen når minst-130oc, överför ampullen till ett gasfas flytande kväveförvaringskärl.
