(a) Der sexuelle Lebenszyklus von Chlamydomonas reinhardtii besteht… / Download Wissenschaftliches Diagramm

… die Natur der genetischen Substanzen, die Mendels Gesetz widersprachen. Umfangreiche Studien im letzten Jahrhundert mit zahlreichen Techniken, einschließlich Elektronenmikroskopie, Genetik, Molekularbiologie und Biochemie, haben gezeigt, dass die genetischen Substanzen tatsächlich Genome in Chloroplasten und Mitochondrien sind (Kuroiwa 1991; Birky 1995). Es wird angenommen, dass Chloroplasten (cp) und Mitochondrien (mt) aus endosymbiotischen Beziehungen zwischen kernhaltigen Zellen und frei lebenden Bakterien – Cyanobakterien bzw. Sie enthalten ihre eigenen Genome, die vermutlich Überreste ihrer Vorläufer sind (Gray 1992). Heute wissen wir, dass cp- und mt-Gene in den verschiedenen Taxa höherer Pflanzen, Farne, Moose, Algen (Kuroiwa 1991), Pilze (Mitchell und Mitchell 1952; Kawano et al. 1987) und Tiere (Hutchison et al. 1974) , einschließlich Menschen. Die uniparentale Vererbung von cp / mt-Genomen wurde lange Zeit als passives Ergebnis angesehen, da Eier eine Vielzahl von Organellen enthalten, während männliche Gameten bestenfalls nur wenige beitragen (Gyllensten et al. 1991). Der Prozess der uniparentalen Vererbung wird jedoch wahrscheinlich dynamischer sein. Ein klassisches und markantes Beispiel wäre das Auftreten einer nicht-Mendelschen Vererbung in der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii , die Gameten identischer Größe (isogam) produziert (Sager 1954). Der Lebenszyklus von C.reinhardtii ist exquisit einfach. Es gibt zwei Paarungstypen von C. reinhardtii , den Paarungstyp plus (mt +) und den Paarungstyp minus (mt ), die von einem einzigen komplexen Paarungstyport in der Verknüpfungsgruppe VI gesteuert werden (Ferris et al. 2002). C. reinhardtii durchläuft einen sexuellen Lebenszyklus, der definierte Differenzierungsstadien umfasst (Abbildung 1). Vegetative Zellen differenzieren sich unter Stickstoffmangel und Lichtbestrahlung zu Gameten (Pan et al. 1996). Innerhalb von Minuten nach dem Mischen haften Gameten entgegengesetzter Paarungstypen durch ihre Flagellen aneinander und verschmelzen zu Zygoten. Nach einer obligatorischen Ruhephase durchläuft die Zygote Meiose und Keimung, um vier haploide Nachkommen zu produzieren. Mehr als 90% der gebildeten Nachkommen erben Chloroplasten (cp) -Merkmale, vorzugsweise vom mt + -Elternteil, ein Phänomen, das erstmals vor mehr als 50 Jahren beschrieben wurde (Sager 1954). Sager beschrieb die Vererbungsmuster von zwei UV-induzierten Mutationen, sr1 und sr2 . Die sr1-Mutation verleiht Resistenz gegen niedrige Konzentrationen des Antibiotikums Streptomycin, und die sr2-Mutation verleiht Resistenz gegen hohe Streptomycinspiegel. Wenn sr1 mit einem Streptomycin-sensitiven Stamm gekreuzt wurde, wurden geringe Streptomycin-Resistenzen nach dem Mendelschen Gesetz vererbt. Im Gegensatz dazu waren alle meiotischen Nachkommen resistent gegen hohe Streptomycinspiegel, wenn ein mt + -Elternteil, das die sr2-Mutation trug, mit einem sensitiven mt- Elternteil gekreuzt wurde. In der reziproken Kreuzung waren die meiotischen Nachkommen alle streptomycinempfindlich (Sager 1954). Im Jahr 1962 kam der Beweis für die Existenz von cpDNA aus licht- und elektronenmikroskopischen Arbeiten von Ris und Plaut (Ris und Plaut 1962). Nur ein Jahr später beschrieben Sager und Ishida die Isolierung von cpDNA durch Cäsiumchlorid (CsCl) Dichtegradientenzentrifugation (Sager und Ishida 1963). 1989 wurde gezeigt, dass die sr2-Mutation innerhalb des rps12-Gens des cp-Genoms lokalisiert ist (Liu et al. 1989). Im Jahr 1972 zeigte eine biochemische Studie, dass die Menge an mt-cpDNA im Vergleich zu mt + cpDNA 6-24 h nach der Paarung abnahm (Sager und Lane 1972). Die DNA aus mt + – und mt-Gameten wurde entweder mit 14 N- oder 15 NH 4 Cl markiert, und die CsCl-Dichtegradientenzentrifugation wurde verwendet, um das Schicksal von Kern-DNA und cpDNA in 6- und 24-h-Zygoten zu überwachen. Sechs Stunden nach der Zygotenentwicklung war das Signal, das die mt-cpDNA repräsentierte, deutlich niedriger als die mt + cpDNA, was auf eine bevorzugte Reduktion der mt-cpDNA gegenüber der mt + cpDNA hinweist. Im Jahr 1980 wurde der erste molekulare Beweis für die bevorzugte Reduktion von mt-cpDNA von Grant et al. (Grant et al. 1980). Die Autoren überwachten das Verhalten von mt + und mt- cpDNA unter Ausnutzung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs) in einem C. reinhardtii-Mutantenstamm ac-u-g-23, der zwei kleine Deletionen in seiner Chloroplasten-DNA trägt. Die Autoren fanden heraus, dass sowohl die Deletionen in der cpDNA als auch der nicht-photosynthetische Phänotyp uniparent vererbt wurden. Das 203-kb Chloroplastengenom von C. reinhardtii (Maul et al. 2002) liegt bei ~ 80-100 Kopien pro Zelle vor und ist in 5-10 DNA–Protein-Komplexe organisiert, die als Chloroplasten-Nukleoide bezeichnet werden (Kuroiwa et al. 1981). 1982 haben Kuroiwa et al. gefunden, dass DAPI (dsDNA-spezifisches Fluorochrom, 4′, 6-diamidino-2-phenylindol) -gefärbte mt-cp-Nukleoide in jungen Zygoten innerhalb von 50 Minuten nach der Paarung bevorzugt verschwanden (Kuroiwa et al. 1982). 1999 wurde das bevorzugte Verschwinden von mt-cp-Nukleoiden in einer lebenden Zygote unter Verwendung von SYBR Green I (dsDNA-spezifisches Fluorochrom, das in lebende Zellen eindringen kann) beobachtet (Abbildung 1) (Nishimura et al. 1999). Die Interpretation dieses dramatischen Phänomens war jedoch umstritten, da das bevorzugte Verschwinden fluoreszierender mt- cp-Nukleoide lange vor dem Nachweis der DNA-Reduktion durch biochemische oder molekularbiologische Methoden (6-24 h nach der Paarung) auftrat (Sager und Lane 1972). Zwei primäre Möglichkeiten wurden vorgeschlagen, um dies zu erklären. Eine Möglichkeit bestand darin, dass der Zerfall von cp-Nukleoiden zur Dispersion von cpDNA-Molekülen führen könnte, und die zweite Möglichkeit bestand darin, dass der schnelle Aufschluss von cpDNA-Molekülen zum Verschwinden von cpDNA-Nukleoiden führen könnte. Ein Problem bei der Beantwortung dieser Frage ist, dass die Paarungsreaktion unter Verwendung von Millionen von mt + – und mt-Gameten durchgeführt wird (Abbildung 2). Die Zellpopulation ist unweigerlich eine heterogene Mischung von Zellen, wie nicht vermählte mt + – und mt- Gameten, Zygoten mit oder ohne mt- cp-Nukleoide und außergewöhnliche meitotische Zygoten (1 ~ 5%), die keine meitotischen Zygoten bilden (Ebersold 1967). Im Allgemeinen erfordern molekulare und biochemische Methoden große Mengen homogener Proben für präzise Analysen, und jede Heterogenität in den Proben würde die Ergebnisse verwirren. Mit anderen Worten, die “Persönlichkeiten” einzelner Zellen oder Organellen innerhalb einer Population würden verdünnt und höchstwahrscheinlich im Analyseprozess verloren gehen. Andererseits kann die Mikroskopie die “Persönlichkeiten” auf morphologischer Ebene aufdecken, nicht jedoch auf molekularer Ebene. Um den Zustand von cpDNA-Molekülen während des Verschwindens von mt-cp-Nukleoiden zu untersuchen, war es notwendig, Zygoten basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von mt-cp-Nukleoiden zu sammeln und die einzelnen Zygoten unter Verwendung molekularbiologischer Techniken zu analysieren. Um dies zu erreichen, wurden optische Pinzetten verwendet (Abbildung 3). Die Verwendung optischer Pinzetten ist eine neuartige Technik zur Manipulation lebender Zellen oder Organellen unter direkter mikroskopischer Beobachtung (Ashkin et al. 1987). In dieser Studie wurde eine einzelne Zygote mit oder ohne cp-Nukleoide unter Verwendung einer optischen Pinzette gesammelt, und die Anwesenheit oder Abwesenheit von mt-cpDNA-Molekülen wurde durch verschachtelte PCR-Analyse bestimmt. Die Einzelschicksale von mt+ und mt- zygotischer cpDNA wurden getrennt unter Verwendung eines Chloroplasten-Transformanten LO3c verfolgt, der das bakterielle Gen aadA (Aminoglycosidadenyltransferase) beherbergt. Die einzelnen Zygoten, die mit der optischen Pinzette erhalten wurden, wurden einer hochempfindlichen Nested-PCR-Analyse für aadA unterzogen (Abbildung 4) (Nishimura et al. 1999). Bei der Kreuzung von L03c mt+ -Gameten mit Wildtyp-mt-Gameten wurden in allen untersuchten Zygoten aadA-Gensequenzen nachgewiesen. Im Gegenteil, wenn die L03c mt-Gameten mit Wildtyp-Gameten gekreuzt wurden, wurden die aadA-Sequenzen nur in jüngeren Zygoten amplifiziert (10 und 30 min nach Zygotenbildung). Nachdem die fluoreszierenden mt-cp-Nukleoide verschwunden waren, wurden die aadA-Sequenzen in den Zygoten nicht mehr nachgewiesen (90 und 120 min nach Zygotenbildung). Diese Ergebnisse zeigen, dass die mt-cpDNA-Moleküle in 10 min vollständig verdaut sind, während der die mt-cp-Nukleoide verschwinden, und dass auch mindestens eine hochwirksame Nuklease im mt- Chloroplasten kurz nach der Zygotenbildung aktiviert wird. Diese aktive Verdauung von mt- cpDNA ist wahrscheinlich die Grundlage für die mütterliche Vererbung von cpDNA. Das einfachste Modell für die uniparentale Vererbung von cpDNA ist, dass der Prozess aus zwei verschiedenen Ereignissen besteht, die wahrscheinlich in verschiedenen Stadien des Lebenszyklus auftreten: ein “Schutz” von mt + cpDNA, vielleicht während der Gametogenese, und ein “Zerstörer” von ungeschützter mt- cpDNA während der frühen Zygotenentwicklung. A) Restriktions–Methylierungs-Hypothese 1972 schlugen Sager und Kollegen vor, dass mt– cpDNA durch die Wirkung von Restriktionsenzymen verdaut wurde, während die mt + cpDNA durch Methylierung geschützt wurde – ein Modell, das dem bakteriellen Restriktions-Methylierungssystem analog ist (Sager und Lane 1972). Sager und Kollegen sammelten schnell überzeugende Beweise, die einen Anstieg des Methylierungsniveaus von mt + cpDNA zeigen, der 7 h nach der Paarung nachgewiesen wurde (Burton et al. 1979; Royer und Sager 1979; Sano et al. 1980). Weiterhin wurde über die Aufreinigung von mt+ gametenspezifischen DNA-Methyltransferasen mit Molekulargewichten von 60 kDa und 20 kDa berichtet (Sano et al. 1981). Dieses mt + gametenspezifische Methylierungsereignis war offenbar reversibel, wie zum Schutz zu erwarten wäre (Sano et al. 1984). Das Gen für die chloroplastenresidente DNA-Methyltransferase wurde schließlich 2002 identifiziert und seine mt + -gametenspezifische Expression und Chloroplastenlokalisierung bestätigt (Nishiyama et al. 2002). Auf der anderen Seite hat eine Reihe von Arbeiten unabhängiger Gruppen in der Folge argumentiert, dass die Methylierung von mt + cpDNA den Schutz nicht angemessen erklären kann. Bolen et al. isolierte eine Kernmutante me1, die cpDNA sowohl in mt + – als auch in mt-Zellen konstitutiv methyliert (Bolen et al. 1982). Wenn me1-Gameten für Kreuze verwendet wurden, wurden normale uniparentale Vererbungsmuster beobachtet, die mit dem nicht übereinstimmten…