Alpha CETSA Wissensdatenbank

• CETSA®
• Target / Sample Types
• CETSA® Assay Conditions
• Alpha CETSA® Immunoassays
• CETSA® Datenanalyse und Interpretation

Haftungsausschluss: Nur für Forschungszwecke. CETSA® ist eine eingetragene Marke von Pelago Bioscience AB. Bitte beachten Sie, dass für die Kit-Nutzung ein gültiges CETSA®-Abonnement erforderlich ist.

Die CETSA® Methode selbst

F : Was ist CETSA®?

EIN : Der Cellular Thermal Shift Assay ist eine Methode, die die Quantifizierung des Target Engagements (TE) einer Verbindung in lebenden Zellen oder in gestörten Zellen ermöglicht. Das CETSA®-Assay-Prinzip basiert auf der Änderung des thermischen Denaturierungsprofils des Zielproteins, die nach der Bindung einer Verbindung auftritt. Der CETSA®-Assay wird durch Inkubation der Zellen mit der Testverbindung, anschließendes Erhitzen der mit der Verbindung behandelten Zellen und anschließende Messung des verbleibenden löslichen Zielproteins durchgeführt.

Q: Was ist Thermische Verschiebung

A: Beim Erhitzen trifft ein Protein auf eine Temperatur, bei der es denaturiert (manchmal als Schmelzpunkt bezeichnet). Diese Schmelztemperatur ist eine physikalische Eigenschaft und eine Konstante für jeden gegebenen Satz von Bedingungen (pH-Wert, Druck, Salze). Verbindungen, die mit einem Protein interagieren, verändern die Schmelztemperatur (thermische Verschiebung). Für eine gegebene Bindungsstelle innerhalb eines Proteins kann die Größe der thermischen Verschiebung bei verschiedenen Verbindungskonzentrationen gemessen werden (Dosis-Wirkungs-Verhältnis), und die aus solchen Kurven abgeleiteten EC50-Werte können verwendet werden, um eine Rangfolge der Potenz einer Reihe von Verbindungen zu bestimmen, die direkt mit der Rangfolge der Affinität der Verbindungen korreliert . Es gibt verschiedene Variationen des In-vitro-Thermal-Shift-Assays, Aber die Schlüsseltechnik wurde zuerst von Semisotnov et al. (1991). Bei dieser Methode legt das schmelzende und entfaltende Protein hydrophobe Oberflächen frei, die es SYPRO orange ermöglichen, zu binden. Die Fluoreszenz dieses Proteins wird in Wasser abgeschreckt, so dass die Bindung an diese hydrophoben Oberflächen dies umkehrt und die Fluoreszenz ihren Höhepunkt erreicht, wenn das Protein vollständig entfaltet ist. Diese Art von Thermal Shift Assay kann nur auf hochgereinigte Proteine angewendet werden und für Spezies mit geringer Häufigkeit kann dies bedeuten, dass ein Überexpressionssystem erforderlich ist, um ausreichende Mengen zu erzeugen.

Thermofluor – temperaturempfindliches Farbstoffsystem (unter Verwendung von Sypro Orange)

Differential Scanning Fluorimetry (DSF) – alternative farbstoffbasierte Methoden

Quantitative PCR-Systeme (z. B. Roche Light Cycler) : diese werden verwendet, um das Erhitzungsereignis zu liefern und können Fluoreszenzänderungen messen

Nanotemper – ist ein Unternehmen, das ein spezielles Instrument herstellt, das die Probe erwärmt und die Fluoreszenz misst. Es bietet eine bessere Leistung als die angepassten PCR-Systeme.

F : Warum ist die Messung des Zielengagements wichtig?

A : Wenn nicht bestätigt wird, dass eine Verbindung tatsächlich mit dem gewünschten Ziel interagiert, können Arzneimittelentwickler wertvolle Zeit und Ressourcen verlieren, wenn sie sich in die falsche Richtung bewegen. Aus diesem Grund wurde die Bestätigung des Zielengagements einer Verbindung lange Zeit als wesentlich für die Wirkstoffentdeckung angesehen. Solche Assays ermöglichen direkte Vergleiche der Affinität einer Verbindung zu ihrem Ziel, Als solche ist es eine wesentliche Maßnahme, um auszuwählen, welche Verbindungen in allen Phasen der Lead-Generierung und -Optimierung voranzutreiben sind. Da das Target-Engagement mit der Affinität korreliert werden kann, können Forscher Verbindungen mit den höchsten Affinitätswerten auswählen. Daher ist es eine äußerst nützliche Maßnahme, um die richtige Priorisierung von Verbindungen in jeder Phase des Arzneimittelentdeckungsprozesses sicherzustellen.

F: Wie unterscheidet sich CETSA® von anderen Thermal Shift Assay-Technologien?

A: Neben CETSA ® gibt es zahlreiche Methoden zur Beurteilung des Target-Engagements (z.B. Oberflächenplasmonenresonanz, Fluoreszenzpolarisation und thermische Verschiebung). Alle diese Methoden beruhen jedoch auf der Verfügbarkeit von gereinigtem Protein und können nur in vitro angewendet werden, was bedeutet, dass die abgeleiteten Affinitätswerte möglicherweise keine Vorhersage der tatsächlichen Affinität oder des Bindungspotentials in lebenden Zellen treffen. Die Möglichkeit, Thermal-Shift-Assays in einem relevanten zellulären Kontext durchzuführen, in dem sich das Protein in seiner natürlichen Umgebung befindet, in Gegenwart seiner natürlichen Partnerproteine, mit physiologischen Konzentrationen seiner Cofaktoren und Substrate, liefert viel relevantere Daten, die sich besser in Tiermodelle und klinische Studien umsetzen lassen.

Während der zelluläre Thermal Shift Assay eine Methode ist, die auf dem gleichen biophysikalischen Prinzip wie Standard-Thermal Shift Assays basiert (d. h. dass spezifische Proteine bei einer festgelegten Temperatur denaturieren), misst er nicht direkt die spezifische Temperatur der Entfaltung, sondern beruht stattdessen auf der Tatsache, dass das Vorhandensein einer Verbindung auf dem Protein die Menge an löslichem Protein beeinflusst, die nach dem Erhitzen auf eine festgelegte Temperatur vorhanden ist. Als solches ist CETSA® im Wesentlichen ein Gesamtproteintest, der nach einem bestimmten Erhitzungsereignis durchgeführt wird. Verbindungen mit unterschiedlichen Zieleingriffspotenzen verändern die relativen Proteinmengen, die das Aufheizereignis überleben. Da der Assay dieses Restprotein und nicht das tatsächliche Schmelzereignis misst, kann er auf komplexere In-vivo-Systeme wie Zellen und Lysate (und in einigen CETSA®-Formaten sogar auf festes Gewebe) angewendet werden. Darüber hinaus kann CETSA® Verbindungen identifizieren, die ein Protein destabilisieren (d. H. seine Schmelztemperatur senken), was bei den anderen thermischen Verschiebungsmethoden weniger einfach ist.

Q: Wie unterscheidet sich Alpha CETSA® von anderen zellulären Thermal Shift Assay-Technologien oder anderen zellulären Target Engagement Assays?

A: Wie oben erwähnt, handelt es sich bei CETSA® im Wesentlichen um einen Gesamtproteintest, der nach einem Hitzeschock durchgeführt wird. Alpha CETSA® verwendet ein duales Antikörper-basiertes Detektionssystem. Andere Methoden vermeiden die Verwendung eines antikörperbasierten Systems durch Modifizierung des Zielproteins:

• Promega Nanoluciferase Thermal Shift Assay (NaLTSA) : Nanoluciferase fusioniert mit dem Zielprotein (rekombinant exprimiertes Protein); Wenn das Proteinziel mit dem Nanoluc-Enzym-Tag aggregiert, nimmt das Luciferase-Signal ab.
• Promega NanoBRET Target Engagement Assay : Luciferase Fusion Tag kombiniert mit markierten Tracer-Verbindungen, die in unmittelbarer Nähe zur Luciferase zu Biolumineszenz-Resonanz-Energieübertragung (BRET) führen. Die Bindung von Verbindungen in derselben Tasche verdrängt den Tracer und das BRET-Signal nimmt ab. Dies ist keine Hitzeschockmethode.
• DiscoverX InCELL Pulse : Basierend auf Enzymfragmentkomplementierung (EFC) Technologie : das Zielprotein wird mit einem kleinen Enzymdonorfragment der β-Galactosidase (β-gal) fusioniert. Ein hinzugefügtes Reporterprotein bindet an dieses Fragment, um ein aktives Enzym zu rekonstituieren, das ein Substrat hydrolysiert und ein Chemilumineszenzsignal erzeugt, das eine Quantifizierung der Proteinhäufigkeit ermöglicht. Nach der Hitzedenaturierung aggregiert das Protein und begrenzt den Zugang der größeren Luciferase-Komponente zu seinem Partner auf dem Proteinziel.

Der Hauptunterschied zwischen diesen “rekombinanten CETSA®” – oder “rekombinanten Target Engagement” -Systemen und Alpha CETSA® besteht darin, dass sie nicht auf native und unmodifizierte Zellen angewendet werden können. Dies hat eine Reihe negativer Konsequenzen:

1. Während die Kosten für die Entwicklung eines neuartigen Antikörperpaares und die anschließenden Kosten pro Well höher sein können als die bloße Transfektion einer einzelnen Zelllinie, ist es wahrscheinlich, dass jedes Entdeckungsprogramm mit einer Vielzahl von Modellzelllinien getestet werden möchte.
2. Die Erzeugung eines markierten Proteins hat immer physiologische Konsequenzen für die Zelle und das markierte Protein kann (i) überexprimiert werden (falsche Stöchiometrie vs. partner), (ii) nicht im richtigen zellulären Kompartiment lokalisiert oder (iii) nicht mit wichtigen Partnerproteinen assoziiert sind und (iv) ein anderes Schmelzverhalten aufweisen können als das native Protein. Dies bedeutet, dass die scheinbare Wirkung einer Verbindung möglicherweise nicht ihr tatsächliches Verhalten im Gewebe des Patienten widerspiegelt. Diese Probleme können in jedem temporären Transfektionssystem vergrößert werden.
3. Luciferase-Inhibitoren können zu falsch positiven Ergebnissen führen.
4. In späteren Stadien der Lead-Optimierung, wenn komplexere und physiologisch relevantere zelluläre Modelle (primäre, native Zelllinien und Gewebe) benötigt werden, sind markierte Proteinansätze einfach nicht anwendbar.

F: Welche Informationen liefert ein CETSA® Assay?

A: CETSA® bietet ein einzigartiges Maß für die ‘on Target Presence’ einer Verbindung und kann als Zielbelegung angesehen werden. Diese Belegung wird sowohl von der Fähigkeit der Verbindungen beeinflusst, das Ziel anzugreifen, als auch von der Fähigkeit der Verbindung, an der richtigen Stelle anwesend zu sein (d. h. hat es die richtige Löslichkeit, Permeabilität, metabolische Stabilität und Verfügbarkeit im richtigen zellulären Kompartiment). Nichtzelluläre Target-Engagement-Assays bieten Affinitätsmaße, die nur mit dem Verhalten des Proteins in stark künstlichen Umgebungen korrelieren, wobei häufig gereinigte rekombinant exprimierte Zielproteine verwendet werden.

F: Kann CETSA® für SAR-Analysestudien verwendet werden?

A: Es gibt noch keine veröffentlichten Beispiele, in denen CETSA® zur Compoundoptimierung eingesetzt wurde. Das Potenzial und die Anwendbarkeit von CETSA® für die SAR-Analyse und die Trefferbestätigung wurden jedoch von Shaw et al. durch den Vergleich von Daten aus dem CETSA®-Assay mit gängigen biochemischen und zellbasierten Assay-Daten (Shaw et al. 2018 SLAS Entdeckung 1-12 DOI: 10.1177/2472555218813332). Die Publikation zeigt den Mehrwert von CETSA® für das Screening, die Trefferbestätigung und die SAR-Generierung für zwei Proteinziele: B-Raf und PARP1.

Target-/Probentypen

F: Wie viele Targets wurden bisher in CETSA® validiert?

EIN: In CETSA® HT (die meisten sind Alpha-CETSA®, einige verwenden HTRF) wurden mehr als 30 Ziele erfolgreich validiert, darunter Ziele mit nuklearer, mitochondrialer, zytoplasmatischer und Plasmamembranlokalisation.

Mehr als 100 Targets wurden bisher in CETSA® Classic (Western Blot based Detection) validiert.

CETSA® M/S generiert Informationen für 6000 bis 7000 Targets auf einmal.

F: Können alle Zielproteine in CETSA® getestet werden?

R: Einige Targets sind in CETSA® “blind”, d.h. verbundbindung ändert ihre thermische Stabilität nicht. Dies kann passieren, wenn das Protein mehrere Domänen hat und die Verbindung nur an eine Domäne bindet und wenn die Stabilisierung dieser einzelnen Domäne die thermische Stabilität des gesamten Proteins nicht global beeinflusst. Es gibt einige wenige Proteine, die im typischen Temperaturbereich, der in CETSA®-Experimenten angewendet wird, nicht schmelzen.

Pelago hat Zugriff auf eine große Datenbank mit thermischen Stabilitätsdaten aus Projekten mit massenspektrometrischer Auslesung (CETSA® MS), und diese Informationen werden berücksichtigt, wenn Pelago die “CETSA®-Bilität” eines Proteinziels bewertet, bevor ein Alpha-CETSA®-Assay entwickelt wird. Bitte kontaktieren Sie Pelago, um solche Informationen anzufordern.

F: Sind GPCR für CETSA® geeignet?

A: Einige Beispiele von GPCR wurden in CETSA® getestet. In einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung von Astra Zeneca (Kawatkar et al Chem Biology 2019) wurden CETSA® Classics-Assays für eine Reihe von membrangebundenen Proteinen einschließlich eines GPCR-Proteinziels etabliert. Eine mögliche Herausforderung mit CETSA® auf GPCR kann die begrenzte Verfügbarkeit von Antikörpern zum Nachweis sein. Darüber hinaus kann die integrale Membranlokalisation der GPRCs zu einem unvorhersehbaren Schmelzverhalten führen.

F: Welche Proben können in CETSA® getestet werden?

EIN : Es gibt Beispiele für CETSA®-Assays, die viele verschiedene Arten von Matrices verwenden, darunter immortalisierte Zelllinien, Primärzellen, iPS-Zellen, vom Patienten abgeleitete PBMCs, Sphäroide, Kernfraktionen aus kultivierten Zellen, ex-vivo-behandeltes Gewebe, Gewebe aus In-vivo-Tierstudien, Bakterien, Hefen, Zebrafische und Insekten.

F: Können die Proben nach dem Heizschritt eingefroren werden?

A : Dies ist möglich, erfordert jedoch eine Einzelfallvalidierung, da der Gefrierprozess einige Proteine denaturieren kann.

F: Meine Zellen benötigen eine Kulturplattenbeschichtung mit einigen Proteinen (z. b. Kollagen oder Matrigel); Ist besondere Vorsicht geboten, um eine Probenvorbereitung zu vermeiden?

A: Wir haben keine Probleme mit Zellen festgestellt, die auf beschichteten Platten kultiviert wurden.

CETSA®-Assaybedingungen

F: Was sind die typischen Optimierungspunkte für Alpha-CETSA®-Assays?

A: Wenn man von vorne anfängt, muss der Immunoassay zuerst entwickelt und optimiert werden. Es ist wichtig und lohnenswert, in die Entwicklung eines sehr sensitiven Alpha-Assays zu investieren, da dadurch die im CETSA®-Assay benötigte Zellzahl pro Well reduziert werden kann. Da der CETSA®-Assay einen Teil des Proteins zerstört, das nachgewiesen werden muss, werden in einem CETSA®-Assay im Vergleich zu anderen zellbasierten Assays in der Regel mehr Zellen / Well benötigt. Weitere Informationen und nützliche Hinweise finden Sie in den PerkinElmer-Handbüchern für die Alpha-Assay-Entwicklung sowie in den CETSA® Toolbox-Handbüchern, wenn Sie den Toolbox-Ansatz (Anti-Maus-Ig X Anti-Kaninchen-Ig-Beads) verwenden.

Dann umfassen die Optimierungspunkte des CETSA®-Assays:

• Zelldichtetitration
• Auswahl des Zelllysepuffers
• Inkubationszeit der Zellen mit der Testverbindung
• Temperatur für die Inkubation der Zellen mit der Testverbindung
• Erstellung von Schmelz- und Verschiebekurven
• Auswahl der Temperatur für isotherme Dosis-Wirkungs-Experimente
• Workflow- und Automatisierungseinstellungen

F: Warum werden verschiedene CETSA®-Zelllysepuffer bereitgestellt und welche Auswirkungen hat die Verwendung verschiedener Zelllysepuffer?

EIN: Der Lysepuffer ist in Bezug auf mehrere Aspekte des Assays wichtig. Seine Rolle ist vielfältig: Lysieren der Zellen und potenziell das Zielprotein von Partnerproteinen befreien, die die Antikörpererkennung stören können, um das Ziel für den Nachweis durch die Antikörper verfügbar zu machen; Stabilisierung des Zielproteins, um den Assay stabil zu machen; Vermeidung oder Minimierung eines potenziellen Epiturbance-Effekts; bereitstellung der richtigen physikalisch-chemischen Bedingungen (pH-Wert, Ionenstärke und Art der Salze, Detergenzientyp und -konzentration, …) für den Immunoassay, … Da verschiedene Immunoassays unterschiedliche optimale Bedingungen haben können und unterschiedliche Proteinziele und verschiedene Zelltypen unterschiedliche Anforderungen an eine optimale Assay-Leistung haben können, stellen wir 5 verschiedene Zelllysepuffer zur Verfügung. Diese bieten eine Vielzahl von Zelllysebedingungen. Dies bedeutet jedoch nicht, dass in bestimmten Fällen zusätzliche Komponenten wie zusätzliche Detergensarten hinzugefügt werden können, um die weitere Assay-Leistung zu verbessern.

F: Gibt es Proteaseinhibitoren in den CETSA® Zelllysepuffern?

A: CETSA® Cell Lyse buffers 1, 4 und 5 enthält einige Chelatoren für zweiwertige Kationen, von denen erwartet wird, dass sie Proteasen hemmen, die solche zweiwertigen Kationen für ihre Aktivität benötigen (z. B. Matrixmetalloproteinasen). Darüber hinaus sind keine weiteren Proteaseinhibitoren in den CETSA®-Zelllysepuffern enthalten, da diese im Allgemeinen nicht für die Durchführung von Alpha-CETSA®-Assays benötigt werden. Für bestimmte Zelltypen oder Gewebeproben können Sie jedoch typische Proteinasehemmer wie Leupeptin hinzufügen.

Q: Was sind die typischen Schmelztemperaturen?

A: Die Schmelztemperatur (Tm) ist definiert als die Temperatur, bei der die Hälfte der Zielproteinpopulation denaturiert wurde (d. h. in Alpha CETSA®, bei der die Hälfte des Alpha-Signals verloren gegangen ist). Abhängig vom Ziel liegen die Schmelztemperaturen meistens zwischen 40 ° C und 60 ° C, mit einer durchschnittlichen Schmelztemperatur von 52 ° C. Einige Proteine, wie membranassoziierte Proteine, sind normalerweise stabiler und können eine höhere Schmelztemperatur haben. CETSA®-Assay-Daten für Proteine mit einer Schmelztemperatur über 65 ° C können durch die Tatsache beeinflusst werden, dass die Membranpermeabilität und Zellintegrität gestört wird, wenn Zellen erhitzt werden, wodurch die physiologische Bedeutung des Assays beeinträchtigt wird.

Nach unserer Erfahrung ist die Schmelztemperatur targetspezifisch und abhängig von der Assaymatrix und dem verwendeten Lysepuffer.

F: Wird erwartet, dass das Tm dasselbe ist, wenn mit intakten Zellen und gestörten Zellen gearbeitet wird?

A: Nicht unbedingt, wie bei der Zerstörung von Zellen, können Protein-Protein-Wechselwirkungen, die Proteine stabilisieren, verloren gehen, was zu einer veränderten Schmelztemperatur im Vergleich zu intakten Zellen führen kann. Ein Beispiel finden Sie in den Alpha CETSA® MEK1 Assay-Daten.

Q: Was heizung temperatur sollte ICH wählen für verbindung prüfung?

EIN: Für stabilisierende Verbindungen wird empfohlen, die niedrigste Temperatur mit dem größten Assay-Fenster zu wählen, da erwartet wird, dass es den empfindlichsten Assay ergibt (niedrigere EC50-Werte). Für destabilisierende Verbindungen wird empfohlen, die höchste Temperatur mit dem größten Testfenster zu wählen. Temperaturen über 65°C können die zelluläre Permeabilität beeinträchtigen und die Aussagekraft der Daten mindern.

F: Sollte ich mit der gleichen Schmelztemperatur in CETSA® Classic (Western Blot) und Alpha CETSA® rechnen?

A: Nicht unbedingt: die scheinbare Schmelztemperatur kann zwischen beiden Methoden variieren, da die Nachweismethoden unterschiedlich sind.

Q: Ist es wichtig, eine strenge kontrolle der probe heizung mal?

A: Ja, dies ist äußerst wichtig zu kontrollieren, da längere Aufheizzeiten zu einer Rechtsverschiebung der Dosis-Wirkungs-Kurve führen können (siehe unten die Kommentare zur Verweilzeit). Die Standardheizzeit beträgt 3 Minuten.

Verbindungen mit kurzer Verweilzeit (d.h. hohe Dissoziationsratenkonstante koff; verweilzeit T gleich 1/koff) dissoziiert schneller vom Target, wenn es erhitzt wird, im Vergleich zu Verbindungen mit langer Verweilzeit. Aus diesem Grund wird erwartet, dass der EC50- oder ITDRF50-Wert mit zunehmenden Aufheizzeiten ansteigt. Weitere Erläuterungen zur CETSA®-Theorie finden Sie unter Seashore-Ludlow B., Axelsson H., Almqvist H., Dahlgren B., Jonsson M., Lundbäck T. (2018) Quantitative Interpretation der intrazellulären Wirkstoffbindung und -kinetik unter Verwendung des Cellular Thermal Shift Assay. Biochemie 57: 6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. Theoretisch könnte der Nachweis unterschiedlicher Verweilzeiten von Verbindungen am Target durch unterschiedliche Aufheizzeiten möglich sein, es liegen jedoch noch keine veröffentlichten Berichte darüber vor.

F: Das Handbuch weist an, nach dem Hitzeschock entweder auf Eis oder 3 min bei 25°C abzukühlen. Ist dieser Abkühlschritt wichtig und ist es wichtig, die Abkühlzeit streng zu kontrollieren?

A: Durch schnelles Abkühlen der Probe wird sichergestellt, dass die Hitzeschockphase gut kontrolliert wird. Das einfache Abkühlen der Temperaturen ohne fremde Hilfe würde sicherlich zu unterschiedlichen Kühlraten in verschiedenen Bohrlöchern führen und die Menge des an das System abgegebenen Hitzeschocks beeinflussen. Die Abkühlphase ist nicht so kritisch wie die Heizphase, sollte aber schnell und konsequent durchgeführt werden.

F: Darf ich PerkinElmer “Biomarker” und “SureFire” (Nicht-CETSA®) Kits verwenden, um einen CETSA® Assay durchzuführen?

A: Theoretisch kann jeder Gesamtproteintest für die Verwendung in einem CETSA®-Protokoll geeignet sein, obwohl jedes System optimiert und validiert werden muss. Die CETSA®-Methode ist jedoch patentiert und wird von Pelago Bioscience genehmigt. Darüber hinaus wird nur die Verwendung der angegebenen Zielkits von PerkinElmer unterstützt. Die Verwendung des Tool Box Kits wird von Pelago Bioscience unterstützt und steht nur Lizenzinhabern zur Verfügung.

F: Ist es möglich, das Alpha-Signal direkt von der PCR-Platte abzulesen, die zum Erhitzen der Proben verwendet wird?

R: Dies würde Vorteile hinsichtlich der Anzahl der Pipettierschritte, des Probenverbrauchs und der einfachen Automatisierung bieten, aber die Möglichkeit, PCR–Platten für den gesamten Prozess – von der Probenbehandlung bis zum Nachweis – zu verwenden, ist noch nicht nachgewiesen. PCR-Platten sind oft sehr flexibel, was zu einem ungleichmäßigen Signal über die Platte führt, oder haben nicht die richtigen Abmessungen, damit sie von Plattenlesern gehandhabt werden können. Well-to-Well-Übersprechen kann auch ein Problem in solchen PCR-Platten sein.

F: Kann chemische Denaturierung (z. B. mit Harnstoff oder Guanidin) anstelle von Wärme verwendet werden?

EIN: Der Vorteil der Verwendung der Temperatur zur Abgabe des Hitzeschocks besteht darin, dass sie auf eine stark kontrollierte Weise erfolgt, die wahrscheinlich zwischen den Proben konstant und über einen gut kontrollierten Zeitrahmen begrenzt ist. Ein chemischer Denaturierungsprozess könnte in einem gereinigten Proteinextrakt funktionieren; In der komplexen zellulären Umgebung bedeuten jedoch Variationen des Zellvolumens, der Pufferfähigkeit, des Lipidgehalts usw. wahrscheinlich, dass verschiedene Zelllinien unterschiedliche Denaturierungseigenschaften für ein bestimmtes Protein aufweisen.

Da die Denaturierung (Aufheizzeit) kritisch ist, kann dies bei chemischer Denaturierung recht schwierig zu kontrollieren sein. Darüber hinaus kann Wärme angewendet werden, ohne die Zellen zu stören, sodass Tests im realen zellulären Kontext durchgeführt werden können. Dies wäre bei der chemischen Denaturierung nicht der Fall, da Zellen gestört werden müssten, um den Zielzugang zum Denaturierungsmittel zu ermöglichen, wodurch intrazelluläre Konzentrationen, Proteinassoziationen usw. verloren gehen.. Daher empfehlen wir nicht, den Hitzeschock durch chemische Denaturierung zu ersetzen.

Alpha CETSA® Immunoassay

Q: Benötige ich bei der Entwicklung eines CETSA®-Assays monoklonale Antikörper oder können auch polyklonale Antikörper verwendet werden?

A: Je nach Qualität der Antikörper können sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper eingesetzt werden. Monoklonale Antikörper stellen einen Vorteil hinsichtlich einer stabilen Reagenzversorgung dar, wie bei jeder anderen Nachweismethode unter Verwendung von Antikörpern.

F: Funktioniert die nächste Charge bei Verwendung von polyklonalen Antikörpern in einem CETSA®-Assay genauso?

EIN: Nach unserer Erfahrung hatten wir nie eine Situation, in der sich die nächste Charge eines polyklonalen Antikörpers im CETSA®-Assay anders verhielt als frühere Chargen. Der CETSA®-Assay muss jedoch mit der nächsten Charge des polyklonalen Antikörpers erneut validiert werden.

Q: Gibt es andere empfehlung für antikörper auswahl?

A: Wenn verfügbar, sollten Antikörper so ausgewählt werden, dass sie verschiedene Epitope des Zielproteins abdecken, um die Chancen zu maximieren, ein geeignetes Antikörperpaar zu finden, das im Alpha CETSA®-Assay funktioniert.

Antikörperpaare, die steilere Kurven (höhere Hügelneigung) und weniger Hintergrund ergeben, werden bevorzugt, da sie normalerweise ein spezifischeres Signal liefern. Eine niedrige Hügelneigung kann das Zeichen für die Fähigkeit eines Antikörperpaares sein, das neu gefaltete Protein zu erkennen.

F: Sind die Alpha CETSA® Antikörper nur gegen das endogene Zielprotein oder gegen das endogene Zielprotein plus gebundenes kleines Molekül?

A: Basierend auf den bisher entwickelten Kits richten sich die Antikörper nur gegen das Proteinziel.

Q: Kann ich erwarten, dass die Antikörperaffinitäten zwischen gebundenem und ungebundenem kleinem Molekül zum Zielprotein unterschiedlich sind?

A: Kleine Moleküle, die die Proteinfaltung an Epitopstellen beeinflussen, sind in der Tat gefährdet, die Antikörperbindung zu verändern. Dieses Phänomen wird als “Epiturbance” bezeichnet und kann eine Einschränkung von Antikörper-based-CETSA® sein. Im CETSA® Classic Assayformat (Western Blotting) wird im Allgemeinen keine Epiturbanz beobachtet, da in diesem Fall das Protein vor dem Antikörpernachweisschritt vollständig denaturiert wird.

F: Kann nur IgG mit den CETSA® Toolbox Kits verwendet werden?

EIN: In der Tat sind die Antikörper auf den Anti-Kaninchen- und Anti-Maus-Perlen spezifisch für IgG und würden andere Antikörperklassen nicht erkennen (dh IgA, IgM usw. sollten nicht ausgewählt werden).

F: Gibt es einen Vorteil bei der Verwendung von Alpha CETSA® im Vergleich zu CETSA® Classic (Western Blotting)?

A: Neben einer höheren Sensitivität des Alpha CETSA® Assays und Überlegungen zu Durchsatz und Automatisierung kann Alpha CETSA® aufgrund der möglichen Schwierigkeiten bei der Analyse von Membranproteinen in der CETSA® Classic-Methode für solche Targets eine bessere Leistung erbringen, da kein Trennschritt erforderlich ist.

CETSA®-Datenanalyse und -interpretation

F: Welche falsch positiven Treffer können in CETSA® erzielt werden?

A: Die thermische Stabilität einiger Proteine kann nach der Behandlung der Verbindung beeinträchtigt werden, obwohl sie nicht direkt an die Testverbindung gebunden sind. Diese indirekten Effekte können beispielsweise durch Proteinphosphorylierung, Proteinrekrutierung durch ein Partnerprotein oder durch allgemeine Veränderung des Redoxzustandes der Zelle hervorgerufen werden. Die parallele Durchführung des CETSA®-Assays an intakten Zellen und an gestörten Zellen kann zwischen direkten und indirekten Effekten unterscheiden, da solche indirekten Effekte nicht zu erwarten sind, wenn die Zellen gestört sind und die Stoffwechselprozesse gestoppt werden.

In Alpha CETSA® kann eine Interferenz des Compound Assays auftreten, da die Verbindungen im Nachweisschritt in einer relativ hohen Konzentration vorliegen. Dies kann zu irreführenden Ergebnissen führen, und es ist wichtig, einen Gegenbildschirm durchzuführen, um diese Verbindungen zu identifizieren.

F: Wie kann die Zieldestabilisierung interpretiert werden?

EIN: Destabilisierung kann von der Unterbrechung durch die verbindliche Schwergängigkeit eines Proteinkomplexes resultieren, der das Zielprotein stabilisierte. Nach unserer Erfahrung haben Membranproteine normalerweise eine höhere Schmelztemperatur und werden eher destabilisiert als durch Verbindungsbindung stabilisiert. Für Kinasen könnte es auch aus der Verdrängung von ATP resultieren. In diesem Fall kann ein Vergleich des Ergebnisses von CETSA®-Assays mit intakten Zellen (physiologische ATP-Konzentrationen) und gestörten Zellen (ATP-Verlust) nützlich sein. Für einige Targets (siehe ErbB2 Alpha CETSA® Kit manual) haben wir beobachtet, dass irreversible Inhibitoren das Target destabilisierten, während ein reversibler Inhibitor das Target stabilisierte.

F: Gibt es eine Möglichkeit, den Störungseffekt zu vermeiden?

A: Zugabe einer kleinen menge von waschmittel, wie 0.01% SDS, kann verhindern die epiturbance phänomen. Eine Erklärung könnte sein, dass SDS selbst in Gegenwart der Verbindung Zugang zum Antikörper bietet. Einige der CETSA®-Zelllysepuffer enthalten eine geringe Menge an SDS und können daher Störungen gegenüber anderen Lysepuffern vermeiden. Wir können nicht ausschließen, dass in einigen Fällen weitere SDB hinzugefügt werden müssen.

Es ist zu beachten, dass ein solcher Epiturbance-Effekt nicht auf CETSA®-Assays beschränkt ist, sondern auch in jedem Immunoassay auftreten kann.

F: Counter-Screen / Wie prüfe ich, ob mein CETSA®-Treffer falsch positiv ist?

A: In CETSA® gibt es eine einfache Methode, mit der festgestellt werden kann, ob die Verbindung selbst auf das Zielprotein (de) wirkt oder die Nachweismethode stört: ein Vergleich kann gemacht werden zwischen (1) Zugabe der Verbindungen zu den Zellen, dann Inkubation und Durchführung der Wärmebehandlung und (2) Erhitzen der Zellen zuerst und Zugabe der Verbindung erst danach. Wenn die Verbindungsaktivität nur in Test 1 gefunden wird, ist sie am Ziel wirklich aktiv. Wenn die Aktivität der Verbindung in 1 und 2 gefunden wird, zeigt dies, dass sie irgendwie mit der Nachweistechnologie interferiert (eine Liste potenzieller Alpha-Interferenzen finden Sie im PerkinElmer Protein-Protein Interaction Guide).

F: Welche falsch negativen Treffer können mit CETSA® erzielt werden?

EIN: Wenn eine Verbindung das Ziel in einem zellulären Kontext nicht erreicht, kann sie in biochemischen Assays als positiv erscheinen und in CETSA® immer noch negativ sein . Dies ist kein falsches Negativ, sondern spiegelt nur die Tatsache wider, dass die Verbindung unter realen zellulären Bedingungen nicht auf das Ziel zugreifen kann, was Teil der Leistungsfähigkeit der Methode ist.

F: Wie lassen sich CETSA®-Werte mit funktionellen Assays vergleichen / gibt es eine Bedeutung der Thermoshift-Amplitude?

EIN: Bei der Analyse von CETSA®-Daten muss berücksichtigt werden, dass sich das Prinzip des Assays stark von typischen funktionellen Assays unterscheidet, wie z. B. der Betrachtung von Proteinphosphorylierung, Ionenkonzentrationen, cAMP und anderen Signaltransduktionsmarkern oder der phänotypischen Analyse im High Content Screening, und daher müssen die Daten entsprechend interpretiert werden.

Die Amplitude der Thermoverschiebung ist KEIN Maß für die Verbundaffinität.

Die EC50- oder ITDRF50-Werte sind spezifisch für bestimmte Testbedingungen (Temperatur, Aufheizzeit, …). Dies unterscheidet sich nicht von funktionellen Assays, bei denen EC50-Werte beispielsweise spezifisch für Stimulationszeiten sind.

F: Ist es möglich, Antagonisten und Agonisten in CETSA®-Assays zu unterscheiden?

A: Normalerweise ist dies keine Information, die aus CETSA®-Assays extrahiert wird, sondern die Veröffentlichung von Shaw et al. (2018) Wissenschaftliche BERICHTE | (2018) 8:163 / DOI:10.1038/s41598-017-18650- x. berichte, dass nur Agonisten in der Lage waren, den Androgenrezeptor im entwickelten CETSA®-Assay zu stabilisieren, während Antagonisten im CETSA®-Assay keine direkte Wirkung hatten, aber als Konkurrenten der Wirkung von Agonisten im CETSA®-Assay nachgewiesen werden konnten. Daher konnte der CETSA®-Assay in diesem speziellen Fall zwischen Androgenrezeptoragonisten und Antagonisten unterscheiden. Dies bedeutet nicht, dass dies für jedes Ziel möglich ist, da es zahlreiche Beispiele gibt, in denen der CETSA®-Assay sowohl Agonisten als auch Antagonisten direkt nachweist.

Q: Kann CETSA® zum Nachweis der Toxizität einer Verbindung verwendet werden?

A: Es wird erwartet, dass Verbindungen, die eine toxische Wirkung auf eine Zelle ausüben, zu einer Änderung des Spiegels einiger Proteine (durch Abbau und / oder Transkriptionseffekte) und zu Änderungen der Thermostabilität einiger Proteine (durch posttranslationale Modifikationen oder allgemeine Änderung des Redoxzustands der Zellen) führen. Pelago untersucht die Möglichkeit, aus CETSA® MS-Daten “CETSA®-Fingerabdrücke” zu generieren, die mit verschiedenen Arten von Toxizität in Verbindung gebracht werden könnten. Dies könnte auch Wissen über Ziele generieren, die Medikamente nicht treffen sollten, um eine solche Toxizität zu vermeiden. Wenn ein spezifisches Ziel mit Toxizität in Verbindung zu stehen scheint, kann die Verwendung von Alpha CETSA® zu einer Methode der Wahl für die Pharmaindustrie werden.

F: Kann ein Housekeeping-Protein zur Normalisierung von CETSA®-Assays verwendet werden?

A: Eine Normalisierung ist bei CETSA®-Assays normalerweise nicht erforderlich, da der wichtige Output des Assays der EC50-Wert ist. In einigen Fällen, beispielsweise beim Arbeiten mit Gewebeproben, kann die Menge des pro Datenpunkt eingesetzten Materials jedoch erheblich variieren, und eine Normalisierung kann dann gewünscht sein. In CETSA® Classic (Western Blotting) wird SOD1 häufig verwendet, da sein Schmelzpunkt von 80 ° C ihn zu einer guten unveränderlichen Referenz für jedes Target macht und sein Molekulargewicht von 18 kDa den Nachweis auf Western Blots erleichtert. GAPDH würde aufgrund seiner niedrigeren Schmelztemperatur (55 ° C) nicht empfohlen, was es nicht zu einer möglichen Kontrolle für Ziele mit einer höheren Schmelztemperatur macht.

Wenn Sie den Alpha-CETSA®-Assay normalisieren möchten, können Sie Cofilin ausprobieren (es gibt ein AlphaLISA SureFire Ultra-Kit für Gesamt-Cofilin mit vorläufigen CETSA®-Daten, aber noch kein vollständig validiertes Kit)