Antikörper-Targeting von Claudin-1 als potenzielle kolorektale Krebstherapie

CRC-Proben

Für das Genexpressionsprofil wählten wir 143 Tumorproben von 143 Patienten aus, die in drei Kohorten eingeschlossen waren: die prospektive Single-Center-Studie REGP (19 Patienten) (GSE62322) , die retrospektive Multi-Center-Studie COSIVAL (68 Patienten) und die prospektive multizentrische Studie BIOCOLON (56 Patienten) (GSE62080 und GSE72970) . Für diese drei Studien waren Einschlusskriterien: histologisch nachgewiesenes Kolonadenokarzinom, fortgeschrittener und bidimensional messbarer Tumor (Stadium IV), Alter zwischen 18 und 75 Jahren und Leistungsstatus der Weltgesundheitsorganisation (WHO) ≤2. Vor jeder Behandlung wurden alle Patienten einer Operation zur primären Tumorresektion oder endoskopischen Biopsie unterzogen.

Für die Western-Blot-Analyse wurden 13 zusätzliche Tumorproben aus der prospektiven Single-Center-Studie REGP verwendet, die jedoch nicht in den 143 Proben enthalten waren.

Für die immunhistochemische Analyse wurden Gewebeproben von 52 weiteren Patienten mit CRC retrospektiv nur dann aus den Pathologiedateien des Instituts für Krebsforschung in Montpellier ausgewählt, wenn für denselben Patienten normale Mukosa-, Adenom- und Adenokarzinomproben verfügbar waren.

Alle Studien mit menschlichen Gewebeproben wurden von den zuständigen Ethikkommissionen genehmigt und alle Teilnehmer wurden über die Studienziele und -methoden informiert und unterschrieben eine schriftliche Einverständniserklärung vor der Einschreibung.

Genexpressionsanalyse

Dickdarmproben (normale Dickdarm-, Primärtumor- und Lebermetastasenproben für die REG / P-Studie, aber nur Primärtumorproben für die COSIVAL- und BIOCOLON-Studien) wurden zum Zeitpunkt der Operation nach einem standardisierten Verfahren entnommen, um qualitativ hochwertige RNA zu erhalten . Die Proben wurden dann mit human genome U133 Plus 2.0 Arrays (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA).

Um neue therapeutische Ziele für die antikörperbasierte Therapie bei mCRC zu identifizieren, verglichen wir die Genexpressionsprofile von normalen Gewebeproben der Schleimhaut (n = 17), des Primärtumors (n = 20) und der Lebermetastasen (n = 19).

Da die CRC-Heterogenität beim Vergleich von Genexpressionsprofilen berücksichtigt werden muss, wurden Primärtumorproben (n = 143) unter Verwendung der CRC Molecular Classifications klassifiziert, die auf von drei unabhängigen Gruppen vorgeschlagenen Genexpressionsprofilen und der jüngsten Konsensusklassifikation basieren . Kurz gesagt, De Sousa E. Melo et al. vorgeschlagen, Tumore in drei Klassen zu gruppieren: CCS1 (CRC mit Mikrosatelliteninstabilität, MSI), CCS2 (Krebs mit chromosomaler Instabilität, CIN) und CCS3 (neuer Subtyp) . In: Sadanandam et al. identifizierte fünf molekulare Subtypen, basierend auf dem Zellphänotyp: Becherartig, transitverstärkend (TA), enterozytär, stammartig und entzündlich . In: Marisa et al. beschrieben sechs molekulare Subtypen (C1 bis C6) mit den folgenden Hauptmerkmalen: C1 = CIN und Downregulation der Immunwege, C2 = MSI, C3 = mutiertes KRAS, C4 = Stammzell-Phänotyp-like, C5 = CIN und Upregulation der WNT-Wege und C6 = CIN und normal-like Genexpressionsprofil . Schließlich legte ein internationales Konsortium ausgehend von sechs zuvor veröffentlichten Signaturen eine Klassifizierung mit vier Konsensus-Subtypen vor: MSI (CMS1), canonical (CMS2), metabolic (CMS3) und mesenchymal (CMS4) (zur Überprüfung). Die CRC-Probenverteilung nach dem molekularen Subtyp ist in der zusätzlichen Datei 1: Tabelle S1 dargestellt.

Immunhistochemische Analyse

Die Proben wurden in einem Tissue Micro-Array (TMA) unter Verwendung von drei Gewebekernen (jeweils 0,6 mm Durchmesser) wie zuvor beschrieben zusammengestellt. Kurzzeitig wurden 3 µm-Schnitte des TMA entparaffinisiert und in abgestuften Alkoholen rehydriert. Die hitzeinduzierte Antigengewinnung wurde durchgeführt, indem TMA-Abschnitte in EDTA-Puffer (pH 9) bei 98 ° C in einem Wasserbad für 20 min inkubiert wurden. Nach Neutralisation der endogenen Peroxidaseaktivität wurden TMA-Abschnitte mit einem polyklonalen Anti-CLDN1-Antikörper (JAY-8, Zymed Laboratories Inc, CA, USA) oder Antikörperverdünner (Dako, Glostrup, Dänemark) allein für 60 min inkubiert. Die primäre Antikörperbindung wurde mit dem Envision® System und dem Dako Autostainer® (Dako, Glostrup, Dänemark) visualisiert. Der Prozentsatz der CLDN1-positiven Zellen und die Färbungsintensität (0, keine Färbung; 1, gelblich; 2, braun; und 3, dunkelbraun) wurden für jeden einzelnen TMA-Spot ausgewertet.

Western Blot Analyse

Tumorgewebeproben von Patienten wurden direkt in Lysepuffer gemahlen (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 2 mM PMSF, 100 mM NaF, 10 mM Natriumorthovanadat, eine Cocktail-Proteaseinhibitortablette für 10 ml) mit einem Mischer Mill® MM 300 Einheit (Qiagen, Valencia, CA). Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bradford-Assay (Pierce Coomassie Plus Protein Assay) bestimmt. Anschließend wurden 50 µg Gesamtproteine mit 12% SDS-PAGE aufgelöst und auf Nitrozellulosemembranen (Whatman® Protran®, Porengröße 0,45 µm) transferiert. Unspezifische Bindungsstellen wurden mit 5% (wt/vol) fettfreier Milch in PBS mit 0,1% (vol/vol) Tween 20 (PBS-T) bei Raumtemperatur für 1 h blockiert und anschließend Membranen bei 4°C mit einem polyklonalen Anti-CLDN1-Antikörper (JAY-8) über Nacht inkubiert. Anschließend wurden die Membranen gewaschen und mit dem entsprechenden Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper für 1 h inkubiert. Die Revelation erfolgte mit einem Chemilumineszenzsystem (Amersham Biosciences); β-Tubulin-Expression wurde zur Normalisierung verwendet.

Subzelluläre Proteinextraktion

Die Proteinextraktion wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Für jede Probe wurden 20 µm dicke Schnitte mit einem Kryotom geschnitten, in flüssigem Stickstoff gemischt und vorsichtig mit einem Mikrostößel gemahlen. Für die subzelluläre Proteinextraktion wurde das ProteoExtract Subzelluläre Proteomextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Calbiochem) verwendet. Subzelluläre Fraktionen (je 10 µg) wurden auf 12% ige SDS-PAGE-Gele beladen. Das Immunoblotting erfolgte wie oben beschrieben mit folgenden Primärantikörpern: anti-CLDN1 (JAY-8), -CD71 (Invitrogen), -Histon H3 (Pierce) und -β-Tubulin (Sigma T4026).

Zelllinien

Die folgenden humanen CRC-Zelllinien wurden verwendet: SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (ein Geschenk von C. Montagut, Abteilung für medizinische Onkologie, Hospital del Mar, Barcelona, Spanien), HCT116 (CCL-247) und Modell: LS174T (ATCC CL-188). Zur Gewinnung der CLDN1-positiven SW480-Zelllinie (SW480-CLDN1) wurden SW480-Zellen mit dem humanen CLDN1-cDNA-Klon (Invitrogen MGC collection) oder mit Leervektor (pcDNA) unter Verwendung des jetPRIME™-Transfektionsreagenzes (Polyplus-transfektion Inc., Frankreich). CLDN1-positive Klone wurden selektiert, indem transfizierte Zellen in Gegenwart von 500 µg/ml Geneticin gezüchtet wurden. Zur CLDN1-Stummschaltung wurde SW620 mit dem pSIREN-Vektor, der die shRNA enthält, gegen CLDN1 (SW620shCLDN1) oder gegen Luciferase (shLUC, Negativkontrolle) transduziert. Nach 24 h wurden Zellen mit 1 µg/ml Puromycin selektiert und stabile Klone gepoolt. Alle transienten Transfektionen wurden mit dem jetPRIME™ Transfektionsreagenz durchgeführt.

Produktion von Anti-CLDN1 mAb 6 F6

Zur Antikörperproduktion wurden 6-8 Wochen alte weibliche BALB / c-Mäuse (Harlan, Gannat, Frankreich) durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von 4 Millionen Maus-NIH-Zellen herausgefordert transient mit CLDN1-cDNA (NIH-CLDN1-Zellen) transfiziert alle zwei Wochen (insgesamt fünf Injektionen). NIH-CLDN1-Zellen wurden für die erste Injektion mit vollständigem Freund-Adjuvans (Sigma) und für die anderen vier Injektionen mit unvollständigem Freund-Adjuvans (Sigma) gemischt. Eine intravenöse Auffrischungsinjektion von NIH-CLDN1-Zellen wurde drei Monate nach der fünften Immunisierung verabreicht. Drei Tage später wurden Milzzellen von immunisierten Mäusen mit der Maus-Myelom-Zelllinie P3-X63-Ag fusioniert.8.653 zur Herstellung von Maushybridomen. Überstände von neu generierten Klonen wurden durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) mit SW480-CLDN1 und SW480 Zellen (Negativkontrolle) gescreent. Die Screening-Ergebnisse wurden durch Durchführung und zusätzliches Screening mit SW620- und SW620-shCLDN1-Zellen bestätigt. Der Anti-CLDN1 hybridoma 6 F6 Klon wurde selektiert und durch limitierende Verdünnung kloniert. Die Antikörper-Isotypisierung zeigte, dass 6 F6 ein IgG3k war.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der französischen Regierung für Tierversuche (Vereinbarung CEEA-LR-12052) durchgeführt.

Radioaktive Markierung und SPECT-CT-Bildgebung

Weibliche athymische Nacktmäuse (6-8 Wochen alt) wurden von Harlan gekauft. Das 6 F6 mAb wurde mit 125I (Perkin Elmer) bei der spezifischen Aktivität von 370 MBq / mg für die Einzelphotonenemissions-Computertomographie (SPECT) -Bildgebung unter Verwendung des IODO-GEN (Pierce Chemical Co.) Methode. Nach Schwanzveneninjektion von 16 MBq / 50 µg 125I-markiertem 6 F6 wurden Ganzkörper-Einzelphotonenemissionstomographie / Computertomographie (SPECT / CT) -Bilder mit einer 4-Kopf-Multiplex-Multi-Pinhole-NanoSPECT-Kamera (Bioscan Inc., Washington, USA) zu verschiedenen Zeiten (48, 72 und 96 h). Gleichzeitig wurden Ganzkörper-Mikro-CT-Bilder zur anatomischen Koregistrierung mit SPECT-Daten aufgenommen. Rekonstruierte SPECT- und CT-Daten wurden mit Invivoscope® visualisiert und co-registriert.

Clonogenic Assay

Kolorektale Krebszellen wurden in eine 6-Well-Platte (150, 250 oder 400 Zellen/ Well) ausgesät und über Nacht bei 37 ° C anhaften gelassen. Dann wurde 1 ml RPMI mit oder ohne 6 F6 mAb (Endkonzentration: 100 µg/ml) zu jeder Vertiefung gegeben und die Zellen sechs Tage lang kultiviert. Nach sechs weiteren Tagen in Medium ohne Antikörper wurden die Platten mit einem Celigo™ Imaging Cytometer und der Anwendung “Single colony Verification” gelesen. Das Celigo™ Cytometer ist ein Tischgerät zur In-situ-Zellanalyse, das Bilder von Bohrlöchern mit Hellfeldbeleuchtung liefert (Nexcelom Bioscience, MA, USA).

Etablierung dreidimensionaler (3D) Sphäroidkulturen

Zur Sphäroidbildung wurden 96-Well-Platten mit rundem Boden (Corning Costar) mit ultratiefem Ansatz verwendet. SW480-, SW480-CLDN1- oder SW620-Zellen wurden mit einer Dichte von 5 × 104 ausgesät. Zellen aggregiert und verschmolzen in 3D-Sphäroiden innerhalb von 24-72 h. Bilder von Wells wurden mit einem Phasenkontrastmikroskop unter Verwendung eines 5 × -Objektivs aufgenommen oder mit dem Celigo ™ Imaging Cytometer unter Verwendung der Anwendung “Tumorosphere” aufgenommen. Die Zellviabilität wurde mit dem CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI, USA) beurteilt. Nach Zugabe von 100 µl CellTiter Glo-Reagenz zu jeder Vertiefung für 10 min wurde die Lumineszenz an einem 1450 MicroBeta TriLux Lumineszenz-Mikroplatten-Reader (Perkin Elmer) gemessen.

Zellzyklus- und Proliferationsanalyse in Sphäroiden

Sphäroide wurden hergestellt, indem 1000 DiFi-Zellen pro Well in Ultra-Low Attachment 96-Well-Platten plattiert und 5 Tage lang in Gegenwart von 100 µg / ml des 6 F6 mAb oder 4 mAb (Retuximab) gezüchtet wurden. Zur Zellzyklusanalyse wurden die Zellen pelletiert, trypsinisiert, mit PBS gewaschen, in 75%igem Ethanol fixiert und mit 40 µg/ml Propidiumiodid in Gegenwart von 100 µg ml−1 RNase (Qiagen) gefärbt. Die Zellzyklusverteilung wurde mit einem Beckman Coulter Durchflusszytometer FC500 unter Verwendung des FL-3-Kanals bestimmt. Die Zellen wurden auf einem Punktdiagramm gated, das den DNA-Puls-Peak im Vergleich zum DNA-Puls-Bereich anzeigte, um Dubletten auszuschließen. Die Zellzyklusverteilungen wurden mit der Flowjo-Analysesoftware (Treestar, FLOWJO, Ashland, OR, USA) veranschaulicht.

Am Tag 4 der Kultur wurde die Zellproliferation durch Inkubation von Zellen mit 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin (EdU) für 24 h gemessen. Dann wurde nach Zelltrypsinisierung und Fixierung / Permeabilisierung in 75% Ethanol / PBS die EdU markiert und mit dem Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen) nachgewiesen. Anschließend wurden die Zellen mit 1 µg/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) in PBS/0,1% Triton X100 bei 37°C für 30 min inkubiert. Die Celigo™ “Expressionsanalyse” (Target 1 + Maske) Anwendung wurde zur Quantifizierung des Fluoreszenzsignals und zur Datenanalyse verwendet. Die Zellen wurden unter Verwendung des DAPI-Kernfärbemittels identifiziert und die DNA-Synthese durch Messung des EdU-Inkorporations quantifiziert.

Maus-Xenotransplantat-Modelle

1,5 × 106 SW620-Zellen oder 3 × 106 DiFi-Zellen wurden in Kulturmedium suspendiert und subkutan (s.c.) in die rechte Flanke von 6-8 Wochen alten weiblichen athymischen Nacktmäusen aus Harlan injiziert. Wenn das Tumorvolumen ungefähr 100 mm3 erreichte, wurden Mäuse in verschiedenen Gruppen randomisiert und durch i.p. Injektion von 0,9% NaCl oder 6F6 mAb (15 mg / kg pro Injektion) zweimal pro Woche für drei aufeinanderfolgende Wochen für das erste Experiment und dreimal pro Woche für das zweite Experiment. Tumore wurden zweiwöchentlich mit einem Messschieber gemessen und die Volumina mit der Formel berechnet: D1 x D2 x D3 / 2.

Intrasplenisches Leberkolonisationsmodell

In jedem Experiment wurden 2 Millionen Luciferase-exprimierende SW620-Zellen (SW620-LUC-Zellen) in die Milz von 6-8 Wochen alten weiblichen athymischen Nacktmäusen injiziert. Die Milz wurde 2 min nach der Zellinjektion entfernt. Am Tag 1 nach der Injektion wurden die Mäuse zufällig in zwei Gruppen von 10 Mäusen eingeteilt, die entweder dreimal pro Woche mit 15 mg / kg 6 F6 mAb oder 0,9% NaCl durch IP-Injektion behandelt wurden. Um die Metastasenbildung und -verbreitung zu bewerten, wurde die Luziferase-Expression durch Lumineszenz-Bildgebung nach Injektion von Luciferin (Camera Ivis Lumina II, PerkinElmer®) einmal pro Woche überwacht. In Woche 5 nach der Operation wurden Mäuse getötet, Lebern entfernt, fotografiert und makroskopisch sichtbare Metastasen auf der Leberoberfläche gezählt.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit der STATA 13.0-Software (StataCorp) durchgeführt. Für Genexpressions- oder immunhistochemische Experimente wurden Unterschiede zwischen Gruppen mit dem Kruskall Wallis / Dunn-Test analysiert. Korrelationen zwischen CLDN1-Genexpression und progressionsfreiem Überleben (PFS) und Gesamtüberleben (OS) wurden in der gesamten Gruppe (n = 143 Patienten) und nach dem molekularen Subtyp des Tumors bewertet. Zu diesem Zweck wurden die 143 Patienten basierend auf der medianen CLDN1-Genexpression (d. H. 9, 75 ) in zwei Gruppen eingeteilt. PFS- und OS-Werte wurden mit der Kaplan-Meier-Methode verglichen und die Unterschiede zwischen den Überlebensverteilungen mit dem Log-Rank-Test bewertet.

Der gepaarte t-Test wurde verwendet, um den Effekt der Inkubation mit dem 6 F6 mAb in In-vitro-Experimenten zu vergleichen.

In In-vivo-Experimenten wurde ein lineares gemischtes Regressionsmodell verwendet, um die Beziehung zwischen Tumorwachstum und Anzahl der Tage nach der Injektion zu bestimmen. Der feste Teil des Modells enthielt Variablen, die der Anzahl der Tage nach der Transplantation und verschiedenen Behandlungsgruppen entsprachen. Interaktionsterme wurden in das Modell integriert; Zufällige Abschnitte und zufällige Steigungen wurden einbezogen, um den Zeiteffekt zu berücksichtigen. Die Koeffizienten des Modells wurden mit maximaler Wahrscheinlichkeit geschätzt. Die Überlebensraten wurden vom Zeitpunkt der Injektion bis zu dem Zeitpunkt geschätzt, an dem der Tumor ein Volumen von 1500 mm3 erreichte, unter Verwendung der Kaplan–Meier-Methode. Überlebenskurven wurden unter Verwendung des Log-Rank-Tests verglichen. Für die hepatischen Kolonisationsexperimente wurden Unterschiede zwischen den Gruppen mit dem Mann-Whitney-U-Test bewertet. Für alle Experimente wurden Unterschiede als signifikant angesehen, wenn P < 0,05.